Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong lĩnh vực y sinh học hiện đại, khoa học và công nghệ nano đang mở ra các hướng tiếp cận mới trong chẩn đoán, điều trị và làm hệ dẫn truyền thuốc. Vật liệu nano là các cấu trúc có kích thước nằm trong khoảng từ 1 đến 100 nanomet, mang những đặc tính lý - hóa khác biệt đáng kể so với vật liệu ở quy mô khối thông thường. Trong số các hệ chất mang tiên tiến, vật liệu silica hữu cơ xốp rỗng cấu trúc tuần hoàn (Periodic Mesoporous Organosilicas - PMO) nhận được sự quan tâm nghiên cứu lớn nhờ sở hữu cấu trúc trật tự cao, kích thước mao quản đồng đều (thuộc thang mesopore từ 2 đến 50 nm), diện tích bề mặt riêng lớn cùng sự phân bố đồng nhất của các cầu nối hữu cơ trực tiếp trong khung silica. Sự hiện diện của các nhóm chức hữu cơ bắc cầu cho phép kiểm soát linh hoạt các đặc tính bề mặt (tính ưa nước, tính kỵ nước), tăng cường độ bền cơ học và tạo điều kiện gắn kết các phân tử sinh học.

Một trong những hướng ứng dụng quan trọng của PMO là làm chất nền cố định enzyme. Enzyme là các chất xúc tác sinh học có hoạt tính và độ đặc hiệu cao, giữ vai trò thiết yếu trong nhiều quy trình công nghệ sinh học và phân tích y dược. Tuy nhiên, việc ứng dụng enzyme tự do thường gặp trở ngại do tính kém bền trong các điều kiện khắc nghiệt, thời gian sử dụng ngắn và khó thu hồi để tái sử dụng. Việc cố định enzyme lên các đế vật liệu như PMO giúp khắc phục những nhược điểm này bằng cách tăng độ bền nhiệt, duy trì hoạt tính xúc tác và tạo thuận lợi cho việc phân tách khỏi môi trường phản ứng.

Từ thực tiễn trên, đề tài khóa luận "Nghiên cứu tổng hợp silica cấu trúc rỗng định hướng ứng dụng gắn enzym thủy phân protein" của tác giả Trần Xuân Huy được triển khai nhằm khảo sát khả năng sử dụng PMO làm giá đỡ cho enzyme protease. Tác giả xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Tổng hợp vật liệu Micro/nano PMO có nhóm carboxyl (-COOH).
  2. Thiết kế và tối ưu quy trình gắn Trypsin – enzyme thủy phân protein – lên vật liệu PMO; đồng thời đánh giá hoạt tính của enzyme Trypsin sau khi được cố định trên vật liệu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài bao gồm:

  • Đối tượng nghiên cứu: Vật liệu PMO chức năng hóa nhóm carboxyl ở hai cấp độ kích thước: vật liệu microPMO gắn nhóm -COOH (MPC) và nanoPMO gắn nhóm -COOH (NPC); enzyme phân cắt protein là Trypsin (nguồn gốc Ấn Độ); cơ chất protein mô hình là Albumin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin - BSA).
  • Phạm vi thời gian: Từ tháng 02 năm 2022 đến tháng 04 năm 2023.
  • Phạm vi không gian: Thực nghiệm được tiến hành tại Khoa Công nghệ Nông nghiệp – Trường Đại học Công nghệ (Đại học Quốc gia Hà Nội) và Bộ môn Y Dược học cơ sở – Trường Đại học Y Dược (Đại học Quốc gia Hà Nội). Phép đo hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FESEM) thực hiện tại Viện Khoa học vật liệu (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và đo quang phổ hồng ngoại (FTIR) tại Khoa Hóa học – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. Nghiên cứu được bảo trợ bởi đề tài Nghị định thư mã số NĐT.CHN/19 ("Hợp tác nghiên cứu kỹ thuật định lượng một số biomarker ở bệnh nhân bị bệnh võng mạc đái tháo đường").

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên các nền tảng lý thuyết về hóa học vật liệu xốp, hóa sinh học phân tử và kỹ thuật cố định phân tử sinh học:

  • Khung lý thuyết về PMO: Vật liệu silica hữu cơ xốp rỗng tuần hoàn được phát triển từ năm 1999, có công thức tổng quát dạng $(R'O)_3Si-R-Si(OR')_3$ (trong đó $R'$ là nhóm methyl hoặc ethyl; $R$ là gốc hữu cơ cầu nối). Kích thước mao quản của PMO tuân theo phân loại của IUPAC, thuộc nhóm mesopore (đường kính mao quản từ 2 đến 50 nm), diện tích bề mặt riêng đo bằng phương pháp hấp phụ đẳng nhiệt khí nitơ có thể đạt giá trị cao.
  • Lý thuyết cố định enzyme: Ba phương pháp cố định protein chính lên chất mang rắn bao gồm hấp phụ vật lý, vi bao/nhốt giữ và tạo liên kết cộng hóa trị. Trong nghiên cứu này, tác giả lựa chọn phương pháp tạo liên kết cộng hóa trị thông qua tác nhân ghép đôi 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Cơ chế phản ứng dựa trên việc hoạt hóa nhóm carboxyl (-COOH) trên bề mặt hạt PMO bởi EDC để tạo chất trung gian hoạt động, sau đó chất trung gian này phản ứng với các nhóm amin tự do ($-NH_2$) của Trypsin để hình thành liên kết peptide bền vững.
  • Đặc điểm sinh học của Trypsin và BSA: Trypsin là một endopeptidase đường tiêu hóa, cắt liên kết peptide tại đầu carboxyl của các amino acid mang tính base như lysine và arginine (trừ khi kế tiếp là proline), hoạt động tối ưu ở pH 7–8 và nhiệt độ 37 °C. BSA là protein hình cầu có khối lượng phân tử khoảng 66,5 kDa, điểm đẳng điện $pI = 4,7$, được sử dụng phổ biến làm cơ chất mô hình để đánh giá động học phân cắt protein.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và phân tích bao gồm:

  • Tổng hợp và chức năng hóa vật liệu: Vật liệu PMO ban đầu chứa nhóm amin được điều chế bằng phương pháp sol-gel từ các tiền chất silic hữu cơ (BTME, BTEE, APTES) với chất hoạt động bề mặt định hướng cấu trúc CTAB trong môi trường dung dịch nước. Sau đó, nhóm amin trên bề mặt được chuyển đổi thành nhóm carboxyl thông qua phản ứng với succinic acid anhydride (SAA, nồng độ 10 mg/mL, pH = 6) trong thời gian 2 giờ, thu được hai dạng vật liệu MPC (cỡ micromet) và NPC (cỡ nanomet).
  • Phương pháp khảo sát gắn enzyme: So sánh hai quy trình gắn (Quy trình 1: giữ nguyên EDC trong suốt thời gian phản ứng 2 giờ; Quy trình 2: ủ với EDC trong 15 phút, ly tâm loại bỏ dịch hoạt hóa rồi mới bổ sung Trypsin); khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (4 °C và 25 °C), thời gian (2, 4, 6, 8 giờ) và nồng độ Trypsin ban đầu (2, 5, 10, 20 mg/mL).
  • Phương pháp chuẩn bị mẫu thủy phân: Protein BSA được xử lý biến tính, khử liên kết disulfide bằng dithiothreitol (DTT) ở 56 °C trong 1 giờ, sau đó alkyl hóa các gốc thiol tự do bằng iodoacetamide (IAA) trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ trước khi tiến hành thủy phân.
  • Phương pháp phân tích công cụ và xử lý số liệu:
    • Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FESEM, thiết bị Hitachi S4800) dùng để khảo sát kích thước và hình thái hạt.
    • Quang phổ tán xạ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) dùng để xác định các liên kết hóa học trước và sau khi gắn enzyme.
    • Phổ hấp thụ UV-Vis đo tại bước sóng 280 nm trên hệ thống vi thể tích Nanodrop ND 8000 (Thermo Scientific) để định lượng nồng độ Trypsin dựa trên định luật Lambert-Beer ($A = \varepsilon \cdot d \cdot C$).
    • Phương pháp đo màu Bradford trên máy quang phổ vi bản Epoch 2 (BioTek) để định lượng nồng độ BSA còn lại sau phản ứng thủy phân.
    • Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2016, tính giá trị trung bình (hàm AVERAGE) và độ lệch chuẩn của các lần đo lặp lại.

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề và Tổng quan

Tác giả trình bày bức tranh tổng thể về sự phát triển của công nghệ micro/nano, sự ra đời của vật liệu PMO từ năm 1999 và các con đường chế tạo vật liệu nano (tiếp cận từ trên xuống - top-down và từ dưới lên - bottom-up). Phân tích chi tiết bốn con đường điều chế PMO có nhóm hữu cơ trong khung mao quản và cơ chế hình thành cấu trúc rỗng nhờ micelle của chất hoạt động bề mặt khi vượt quá nồng độ micelle tới hạn (CMC). Chương này cũng điểm lại các ứng dụng của PMO trong y sinh: làm hệ mang thuốc có kiểm soát (vận chuyển ibuprofen, gentamicin, amoxicillin...), làm chất xúc tác sinh học và làm nền tinh chế, cố định phân tử sinh học. Đồng thời, tác giả tổng hợp tình hình nghiên cứu cố định enzyme trên thế giới và tại Việt Nam, nêu bật các công trình của Phạm Xuân Núi, Bùi Xuân Đông để khẳng định tính kế thừa và xu hướng hội nhập của đề tài.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết danh mục hóa chất tinh khiết, trang thiết bị phân tích và các thông số thực nghiệm:

  • Trình bày quy trình chức năng hóa 50 mg PMO amin bằng 2,5 mL dung dịch SAA 10 mg/mL ở pH 6 để tạo nhóm carboxyl, các bước lọc rửa bằng nước khử ion đến pH trung tính và sấy khô ở 45 °C.
  • Quy trình gắn Trypsin 1: Cân 10 mg vật liệu (MPC hoặc NPC), rửa bằng đệm MES, bổ sung 400 µL đệm MES, 50 µL dung dịch EDC 40 mg/mL (lắc 5 phút), sau đó nạp trực tiếp 50 µL dung dịch Trypsin 50 mg/mL, phản ứng ở 25 °C trong 2 giờ. Sau ly tâm, dịch nổi được đo A280 để tính lượng dư, cặn vật liệu được rửa và bảo quản trong acid acetic pH 3.
  • Quy trình gắn Trypsin 2: Tương tự quy trình 1 nhưng dung dịch EDC được cho tương tác với vật liệu trong 15 phút, sau đó ly tâm gạn bỏ dịch chứa EDC dư rồi mới bổ sung dung dịch Trypsin để phản ứng tiếp trong 2 giờ.
  • Thiết lập các bố trí thí nghiệm thủy phân BSA: khảo sát thời gian (30 phút đến 3 giờ), nhiệt độ (25 °C, 37 °C, 50 °C) và tỷ lệ nồng độ Trypsin:BSA với cơ chất đã được xử lý bằng DTT và IAA.

Kết quả và bàn luận

Nội dung chương tập trung vào việc trình bày số liệu thực nghiệm và giải thích cơ chế tương tác:

  • Đặc trưng hình thái: Ảnh FESEM xác nhận cấu trúc hạt của cả hai mẫu NPC và MPC đều đồng đều, xốp mịn, đạt yêu cầu hình thái học để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo.
  • Đường chuẩn phân tích: Xây dựng thành công đường chuẩn tuyến tính cho Trypsin qua đo quang trực tiếp tại 280 nm và đường chuẩn BSA qua phương pháp Bradford.
  • Tối ưu hóa phản ứng gắn kết: So sánh định lượng giữa Quy trình 1 và Quy trình 2 cho thấy việc duy trì EDC liên tục trong môi trường phản ứng (Quy trình 1) mang lại hiệu suất gắn kết cao hơn rõ rệt. Vật liệu kích thước micromet (MPC) cho hiệu suất gắn kết và khả năng liên kết đặc hiệu vượt trội so với vật liệu kích thước nanomet (NPC). Nhiệt độ 25 °C được chứng minh là điều kiện thích hợp nhất vì đảm bảo hiệu suất phản ứng cao mà không gây biến tính enzyme. Động học phản ứng theo thời gian cho thấy lượng gắn đạt ngưỡng bão hòa tương đối sau 2 giờ (đạt 31,99%), kéo dài thời gian lên 4–8 giờ không làm tăng hiệu suất một cách có ý nghĩa mà có nguy cơ gây tự phân hủy Trypsin. Về nồng độ cơ chất, nồng độ Trypsin 10 mg/mL được lựa chọn là điểm dung hòa giữa tải lượng enzyme gắn trên hạt và tỷ lệ hao hụt.
  • Bằng chứng liên kết phổ FTIR: Kết quả phổ hồng ngoại cho thấy sự dịch chuyển của dải hấp thụ đặc trưng từ 1554,63 cm⁻¹ sang 1558,48 cm⁻¹, chứng minh nhóm carboxyl trên giá mang đã chuyển hóa thành liên kết peptide với phân tử Trypsin.
  • Đánh giá hoạt tính xúc tác: Khảo sát trên cơ chất BSA cho thấy Trypsin tự do thủy phân hoàn toàn BSA sau 2,5 đến 3 giờ ở tỷ lệ enzyme:cơ chất là 1:2,5. Khi cố định trên MPC, phức hợp MPC-Trypsin thể hiện tốc độ xúc tác vượt trội: phân cắt phần lớn BSA chỉ sau 15 phút và làm suy giảm hoàn toàn nồng độ BSA sau 30 phút phản ứng ở 37 °C. Thử nghiệm đối chứng khẳng định hiện tượng hấp phụ vật lý của BSA lên bề mặt MPC trần là không đáng kể (chỉ 0,0093 mg BSA trên 10 mg vật liệu).

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã thu thập và xử lý các chuỗi số liệu thực nghiệm chi tiết, được chuẩn hóa thành các phương trình hồi quy và bảng thông số định lượng cụ thể:

1. Dữ liệu đường chuẩn định lượng

Chất phân tích Phương pháp đo Nồng độ khảo sát (mg/mL) Phương trình hồi quy Hệ số tương quan ($R^2$)
Trypsin UV-Vis ($A_{280}$, Nanodrop) 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 $y = 0,1936x + 0,01$ 0,9987
BSA Đo màu Bradford (Epoch 2) 0,625; 1,25; 2,5; 5,0; 10,0 $y = 0,0284x + 0,0132$ 0,9919

Chi tiết giá trị đo quang trung bình của Trypsin tại bước sóng 280 nm:

  • 0,5 mg/mL: $0,09 \pm 0,004$
  • 1,0 mg/mL: $0,19 \pm 0,007$
  • 2,0 mg/mL: $0,41 \pm 0,016$
  • 5,0 mg/mL: $1,03 \pm 0,043$
  • 10,0 mg/mL: $1,92 \pm 0,081$

Chi tiết độ hấp thụ quang trung bình của BSA theo phương pháp Bradford:

  • 0,625 mg/mL: $0,03 \pm 0,001$
  • 1,25 mg/mL: $0,05 \pm 0,002$
  • 2,5 mg/mL: $0,09 \pm 0,005$
  • 5,0 mg/mL: $0,17 \pm 0,008$
  • 10,0 mg/mL: $0,29 \pm 0,015$

2. Thông số gắn Trypsin và hoạt tính thủy phân trên MPC

Chỉ số đánh giá Mẫu thử nghiệm 1 Mẫu thử nghiệm 2
Tổng lượng Trypsin gắn trên 10 mg vật liệu MPC $0,56 \pm 0,03\text{ mg}$ $0,69 \pm 0,04\text{ mg}$
Lượng Trypsin gắn đặc hiệu trên 10 mg vật liệu MPC $0,24 \pm 0,01\text{ mg}$ $0,27 \pm 0,01\text{ mg}$
Nồng độ BSA ban đầu $1,05 \pm 0,05\text{ mg/mL}$ $1,05 \pm 0,05\text{ mg/mL}$
Nồng độ BSA còn lại sau 15 phút thủy phân $0,21 \pm 0,01\text{ mg/mL}$ $0,10 \pm 0,01\text{ mg/mL}$
Nồng độ BSA còn lại sau 30 phút thủy phân $0,01\text{ mg/mL}$ $0,00\text{ mg/mL}$

3. Đóng góp của tác giả

  • Tác giả đã thiết lập được quy trình chức năng hóa bề mặt hạt silica xốp tuần hoàn từ dạng amin sang carboxyl bằng SAA và quy trình cố định cộng hóa trị một bước sử dụng EDC trực tiếp (Quy trình 1), giúp đơn giản hóa thao tác, giảm sai số thực nghiệm so với các quy trình loại bỏ tác nhân hoạt hóa nhiều bước.
  • Xác định được hệ điều kiện tối ưu để cố định Trypsin lên MPC: môi trường đệm MES, nhiệt độ phòng 25 °C, thời gian phản ứng 2 giờ và nồng độ enzyme ban đầu khuyến nghị là 10 mg/mL.
  • Chứng minh bằng thực nghiệm rằng Trypsin sau khi gắn cộng hóa trị lên giá đỡ MPC không những duy trì được hoạt tính sinh học mà còn rút ngắn đáng kể thời gian phân cắt hoàn toàn cơ chất BSA xuống còn 30 phút (so với 2,5 đến 3 giờ của enzyme tự do ở các điều kiện tương đương).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên nội dung thảo luận và kết luận của khóa luận, các hạn chế và hướng mở rộng được tác giả ghi nhận bao gồm:

  • Sai lệch trong khảo sát nhiệt độ của enzyme tự do: Kết quả thực nghiệm ghi nhận tốc độ thủy phân BSA của Trypsin tự do đạt cao nhất ở 50 °C, khác biệt với nhiệt độ tối ưu theo lý thuyết sinh học là 37 °C. Tác giả chỉ ra nguyên nhân là do quá trình truyền nhiệt từ bể điều nhiệt vào bên trong ống phản ứng eppendorf chưa đạt trạng thái cân bằng đồng bộ, dẫn đến sự chênh lệch giữa nhiệt độ cài đặt và nhiệt độ dung dịch thực tế.
  • Hiện tượng tự phân giải của enzyme (autolysis): Khi kéo dài thời gian phản ứng gắn kết trên 4 giờ, sự sụt giảm nồng độ Trypsin tự do trong dung dịch có thể bị nhiễu bởi hiện tượng các phân tử Trypsin tự phân cắt lẫn nhau chứ không hoàn toàn do gắn kết lên vật liệu.
  • Giới hạn về phạm vi khảo sát độ bền tái sử dụng: Khóa luận tập trung chứng minh khả năng gắn kết thành công và hoạt tính phân cắt ban đầu, chưa tiến hành đánh giá chu kỳ tái sử dụng (reusability) qua nhiều lần thu hồi cũng như chưa khảo sát độ ổn định hoạt tính theo thời gian bảo quản dài hạn của phức hợp MPC-Trypsin.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo: Tác giả đề xuất tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các ưu điểm, hạn chế của phức hợp PMO-Trypsin sau cố định nhằm hướng tới ứng dụng cụ thể trong việc xử lý mẫu protein và định lượng biomarker hỗ trợ chẩn đoán bệnh võng mạc đái tháo đường.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận cung cấp tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cho:

  • Sinh viên, học viên ngành Dược học và Hóa dược: Tham khảo phương pháp chức năng hóa bề mặt hạt silica mesopore bằng succinic acid anhydride để tạo nhóm carboxyl và kỹ thuật ghép đôi phân tử sinh học qua cầu nối carbodiimide (EDC).
  • Nghiên cứu viên công nghệ sinh học và proteomics: Có thể ứng dụng quy trình xử lý, biến tính protein chuẩn (khử cầu disulfide bằng DTT tại 56 °C và alkyl hóa bằng IAA trong bóng tối) để chuẩn bị mẫu trước khi phân cắt bằng protease.
  • Người làm đề tài về vật liệu nano y sinh: Kế thừa phương pháp xác định tải lượng protein gắn kết thông qua việc đo độ hấp thụ vi thể tích UV-Vis tại bước sóng 280 nm bằng hệ Nanodrop, phương pháp kiểm tra liên kết hóa học qua dịch chuyển peak FTIR và phương pháp định lượng protein cơ chất bằng thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 (phương pháp Bradford).

Câu hỏi thường gặp

1. Vai trò của hóa chất EDC trong quy trình gắn Trypsin lên vật liệu PMO là gì?

EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) đóng vai trò là chất xúc tác ghép đôi hóa học. Hóa chất này kích hoạt các nhóm carboxyl (-COOH) trên bề mặt vật liệu PMO để tạo thành chất trung gian hoạt động, từ đó chất trung gian này phản ứng trực tiếp với nhóm amin (-$NH_2$) của phân tử Trypsin để tạo liên kết peptide bền vững giữa enzyme và giá mang.

2. Tại sao Quy trình 1 lại cho hiệu suất gắn Trypsin cao hơn Quy trình 2?

Ở Quy trình 1, EDC được duy trì liên tục trong hỗn hợp phản ứng trong suốt 2 giờ, giúp các nhóm -COOH trên bề mặt vật liệu được hoạt hóa ổn định và liên tục để tạo liên kết với Trypsin. Ngược lại, ở Quy trình 2, sau khi hoạt hóa 15 phút, EDC bị ly tâm loại bỏ trước khi cho enzyme vào, khiến khả năng phản ứng suy giảm. Thêm vào đó, Quy trình 1 ít bước thao tác hơn nên hạn chế được sai số và thất thoát mẫu qua các lần ly tâm gạn rửa.

3. Dữ liệu quang phổ FTIR chứng minh việc gắn kết Trypsin lên vật liệu MPC như thế nào?

Kết quả đo phổ FTIR cho thấy trên mẫu MPC ban đầu xuất hiện peak hấp thụ đặc trưng tại số sóng 1554,63 cm⁻¹ đại diện cho nhóm chức carboxyl (-COOH). Sau khi phản ứng với Trypsin, peak này bị biến đổi và dịch chuyển sang số sóng 1558,48 cm⁻¹, chứng minh nhóm carboxyl tự do đã chuyển thành liên kết hóa học mới với phân tử enzyme.

4. Lượng Trypsin gắn đặc hiệu trên 10 mg vật liệu MPC là bao nhiêu và thời gian thủy phân BSA diễn ra như thế nào?

Theo số liệu bảng 3.3 và 3.4 trong văn bản, lượng Trypsin gắn đặc hiệu đo được trên 10 mg MPC là $0,24 \pm 0,01\text{ mg}$ (ở mẫu 1) và $0,27 \pm 0,01\text{ mg}$ (ở mẫu 2), trong tổng lượng Trypsin gắn là 0,56–0,69 mg. Khi cho 10 mg MPC đã gắn Trypsin phản ứng với 100 µL dung dịch BSA (nồng độ ban đầu 1,05 mg/mL), tốc độ thủy phân diễn ra nhanh: nồng độ BSA giảm mạnh sau 15 phút (còn 0,10–0,21 mg/mL) và triệt tiêu gần như hoàn toàn (0,00–0,01 mg/mL) sau 30 phút ở 37 °C.

5. Vì sao tác giả chọn nồng độ Trypsin 10 mg/mL để thực hiện phản ứng thay vì 2 mg/mL hay 20 mg/mL?

Khảo sát nồng độ cho thấy ở 2 mg/mL, hiệu suất phản ứng đạt cao nhất (~35%) nhưng tổng khối lượng enzyme gắn được lên vật liệu rất thấp. Tại nồng độ 20 mg/mL, lượng gắn tăng nhưng hiệu suất sụt giảm mạnh, gây lãng phí lớn lượng enzyme không gắn kết. Nồng độ 10 mg/mL được chọn vì mang lại lượng gắn cao (gấp khoảng 3 lần so với nồng độ 2 mg/mL) trong khi vẫn duy trì hiệu suất gắn chấp nhận được (khoảng 20%), cung cấp đủ lượng enzyme hoạt tính cho các phản ứng thủy phân tiếp theo.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Trần Xuân Huy đã tổng hợp thành công vật liệu silica hữu cơ xốp rỗng tuần hoàn chức năng hóa carboxyl ở hai kích thước micro và nano (MPC, NPC), đáp ứng các tiêu chuẩn hình thái học cho ứng dụng cố định sinh học. Nghiên cứu đã xác lập và tối ưu hóa quy trình gắn cộng hóa trị Trypsin lên vật liệu MPC sử dụng chất xúc tác EDC ở điều kiện 25 °C trong 2 giờ với nồng độ enzyme 10 mg/mL, được kiểm chứng cấu trúc qua phổ dịch chuyển FTIR. Phức hợp MPC-Trypsin tạo thành thể hiện hoạt tính xúc tác phân cắt cơ chất BSA nhanh chóng chỉ trong vòng 30 phút, mở ra tiềm năng ứng dụng vật liệu PMO làm chất mang enzyme phục vụ các kỹ thuật xử lý mẫu và định lượng biomarker sinh học.