Nghiên Cứu Tính Chất và Thành Phần Monosaccharide của Exopolysaccharide từ Lactobacillus plantarum

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

1. MỞ ĐẦU

1.1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic

1.1.1.1. Giới thiệu về vi khuẩn lactic

1.1.1.2. Khái niệm về exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic

1.1.1.3. Cấu trúc và phân loại exopolysaccharide

1.1.1.4. Sinh tổng hợp exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic

1.1.1.4.1. Cơ chế sinh tổng hợp homopolysaccharide

1.1.1.4.2. Cơ chế sinh tổng hợp heteroexopolysaccharide

1.1.1.5. Tình hình nghiên cứu exopolysaccharide của vi khuẩn lactic

1.1.1.6. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide

1.1.1.6.1. pH môi trường

1.1.1.6.2. Nhiệt độ nuôi cấy

1.1.1.6.3. Thời gian nuôi cấy

1.1.1.7. Điều kiện tách chiết và tinh chế exopolysaccharide từ môi trường nuôi cấy

1.1.1.8. Đặc tính sinh lý và chức năng công nghệ của exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic

1.1.1.8.1. Chức năng sinh lý

1.1.1.8.2. Tính chất chức năng công nghệ của exopolysaccharide trong thực phẩm

1.1.1.9. Cấu trúc của exopolysaccharide

1.1.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.1.2.1. Đối tượng nghiên cứu

1.1.2.2. Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn

1.1.2.3. Các hóa chất sử dụng trong các thí nghiệm về exopolysaccharide

1.1.2.4. Phương pháp nghiên cứu

1.1.2.4.1. Các phương pháp vi sinh

1.1.2.4.2. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào vi khuẩn

1.1.2.4.3. Phương pháp nuôi cấy thu sinh khối

1.1.2.4.4. Xác định hàm lượng exopolysaccharide bằng phương pháp phenol – sulfuric acid

1.1.2.4.5. Xác định hàm lượng N tổng số bằng phương pháp Kjeldahl

1.1.2.4.6. Phương pháp tách chiết exopolysaccharide từ dịch nuôi cấy

1.1.2.4.7. Kết tủa protein trong dịch nuôi cấy bằng TCA

1.1.2.4.8. Kết tủa exopolysaccharide trong dịch nuôi cấy bằng ethanol tuyệt đối

1.1.2.4.9. Xác định khả năng hòa tan trong nước của chế phẩm exopolysaccharide

1.1.2.4.10. Phương pháp khảo sát khả năng giữ nước và giữ dầu của chế phẩm exopolysaccharide

1.1.2.4.11. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các exopolysaccharide được sinh tổng hợp bởi các chủng L. plantarum nghiên cứu

1.1.2.4.12. Xác định thành phần đường và các mối liên kết của phân tử exopolysaccharide bằng phương pháp GC-MS và NMR

1.1.2.4.13. Xác định khối lượng phân tử exopolysaccharide bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel

1.1.2.4.14. Các phương pháp khảo sát khả năng ứng dụng

1.1.2.4.14.1. Phương pháp xác định trạng thái gel của sữa đậu nành lên men

1.1.2.4.14.2. Phương pháp xác định khả năng giữ nước của gel sữa đậu nành lên men

1.1.2.4.14.3. Phương pháp xác định thuộc tính dòng chảy của sữa đậu nành lên men

1.1.2.4.15. Sơ đồ thực hiện các nội dung nghiên cứu

1.1.2.4.16. Bố trí thí nghiệm của các nội dung nghiên cứu

1.1.2.4.16.1. Bố trí thí nghiệm nội dung 4

1.1.2.4.16.2. Bố trí thí nghiệm nội dung 5

1.1.2.4.16.3. Bố trí thí nghiệm nội dung 6

1.1.2.4.17. Phương pháp xử lý số liệu

1.1.3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

1.1.3.1. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide của một số chủng L. plantarum được phân lập từ các thực phẩm truyền thống

1.1.3.1.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide của các chủng L. plantarum được tuyển chọn

1.1.3.1.1.1. Mật độ tế bào gieo cấy ban đầu

1.1.3.1.1.2. pH ban đầu của môi trường

1.1.3.1.1.3. Nhiệt độ nuôi cấy

1.1.3.1.1.4. Thời gian nuôi cấy

1.1.3.1.2. Ảnh hưởng của điều kiện tách chiết đến khả năng thu nhận exopolysaccharide từ dịch lên men của các chủng L. plantarum được tuyển chọn

1.1.3.1.2.1. Hàm lượng ethanol tuyệt đối

1.1.3.1.2.2. Thời gian kết tủa

1.1.3.1.3. Một số tính chất của exopolysaccharide từ các chủng L. plantarum được tuyển chọn

1.1.3.1.3.1. Khả năng hòa tan trong nước

1.1.3.1.3.2. Khả năng giữ nước, giữ dầu

1.1.3.1.3.3. Khả năng chống oxy hóa

1.1.3.1.4. Xác định một phần cấu trúc phân tử của exopolysaccharide được sinh tổng hợp bởi chủng L.

1.1.3.1.5. Khối lượng phân tử của exopolysaccharide được sinh tổng hợp bởi L.

1.1.3.1.6. Thành phần monosaccharide của các exopolysaccharide được sinh tổng hợp bởi L.

1.1.3.1.6.1. Thành phần monosaccharide

1.1.3.1.6.2. Mối liên kết glycoside

1.1.3.1.7. Khảo sát khả năng đồng tạo gel trong sữa đậu nành lên men của các chủng L. plantarum được tuyển chọn

1.1.3.1.7.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến trạng thái gel của sữa đậu nành lên men

1.1.3.1.7.2. Khả năng giữ nước của gel sữa đậu nành lên men

1.1.3.1.7.3. Độ nhớt của sữa đậu nành lên men

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Về Exopolysaccharide Từ Lactobacillus Plantarum

Vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm vi khuẩn có lợi, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và y dược. Bên cạnh khả năng lên men, LAB còn có khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide (EPS), một polysaccharide ngoại bào có nhiều ứng dụng tiềm năng. EPS có thể cải thiện cấu trúc, độ nhớt và khả năng giữ nước của thực phẩm, đồng thời mang lại các lợi ích sức khỏe như tăng cường miễn dịch, kháng virus và chống oxy hóa. Nghiên cứu về EPS từ Lactobacillus plantarum đang thu hút sự quan tâm lớn, nhằm khai thác các ứng dụng đa dạng của chúng. Các polysaccharide vi sinh vật có nhiều ưu điểm so với nguồn gốc thực vật, bao gồm chu kỳ sinh trưởng ngắn, môi trường nuôi cấy rẻ tiền và khả năng điều khiển quá trình sản xuất.

1.1. Định Nghĩa và Phân Loại Exopolysaccharide EPS

Exopolysaccharide (EPS) là các polysaccharide ngoại bào được vi khuẩn tiết ra môi trường. Chúng có thể bám chặt vào màng tế bào (PS dạng màng bao) hoặc hòa tan hoàn toàn trong môi trường. EPS thường là các polysaccharide chuỗi dài, phân nhánh, cấu tạo từ các đơn vị đường hoặc dẫn xuất đường. Các loại đường phổ biến trong EPS bao gồm glucose (Glc), galactose (Gal) và rhamnose (Rha). Các liên kết glycoside như 1,4-β, 1,3-β, 1,2-α và 1,6-α tạo nên bộ khung của EPS. EPS có khối lượng phân tử cao, không hòa tan hoàn toàn trong nước, do đó có khả năng tạo đặc hoặc tạo gel.

1.2. Vai Trò và Ứng Dụng Tiềm Năng Của EPS

EPS đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sống của tế bào vi khuẩn, đồng thời có nhiều tính chất chức năng công nghệ hữu ích. Trong thực phẩm, EPS được sử dụng để cải thiện chất lượng sản phẩm, tăng khả năng hấp dẫn, ổn định cấu trúc và hoàn thiện tính lưu biến. Ngoài ra, EPS còn có tác dụng tốt cho sức khỏe, bao gồm tăng cường miễn dịch, kháng virus, chống oxy hóa, chống ung thư và chống cao huyết áp. Nghiên cứu về EPS từ vi khuẩn lactic đang mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm.

II. Phương Pháp Phân Tích Thành Phần Monosaccharide Trong EPS

Việc xác định thành phần monosaccharide của exopolysaccharide (EPS) là bước quan trọng để hiểu rõ cấu trúc và tính chất của chúng. Các phương pháp phân tích phổ biến bao gồm sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký khí khối phổ (GC-MS). HPLC cho phép định lượng các loại đường khác nhau trong EPS sau khi thủy phân. GC-MS cung cấp thông tin chi tiết hơn về cấu trúc đường, bao gồm cả các liên kết glycoside. Kết hợp cả hai phương pháp giúp xác định chính xác thành phần monosaccharide và cấu trúc của EPS. Ngoài ra, phương pháp NMR (Cộng hưởng từ hạt nhân) cũng được sử dụng để xác định các mối liên kết trong phân tử exopolysaccharide.

2.1. Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao HPLC Trong Phân Tích Monosaccharide

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật phân tích mạnh mẽ để xác định và định lượng các monosaccharide trong mẫu exopolysaccharide (EPS). Mẫu EPS thường được thủy phân để giải phóng các monosaccharide thành phần. Sau đó, các monosaccharide được tách ra dựa trên ái lực của chúng với pha tĩnh trong cột sắc ký. Detector sẽ đo lượng monosaccharide khi chúng đi qua, cho phép xác định và định lượng từng loại đường. HPLC là phương pháp nhanh chóng, chính xác và phù hợp với nhiều loại monosaccharide khác nhau.

2.2. Sắc Ký Khí Khối Phổ GC MS Để Xác Định Cấu Trúc EPS

Sắc ký khí khối phổ (GC-MS) là một kỹ thuật phân tích mạnh mẽ để xác định thành phần monosaccharide và cấu trúc của exopolysaccharide (EPS). Mẫu EPS được thủy phân, sau đó các monosaccharide được chuyển đổi thành các dẫn xuất dễ bay hơi. Các dẫn xuất này được tách ra bằng sắc ký khí và được phát hiện bởi khối phổ kế. Khối phổ kế cung cấp thông tin về khối lượng phân tử của từng monosaccharide, cho phép xác định chính xác loại đường và các liên kết glycoside. GC-MS cung cấp thông tin chi tiết hơn về cấu trúc đường so với HPLC.

2.3. Ứng Dụng Phổ Khối Lượng Trong Nghiên Cứu Exopolysaccharide

Phổ khối lượng (Mass Spectrometry) là một kỹ thuật phân tích mạnh mẽ được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu exopolysaccharide (EPS). Kỹ thuật này cho phép xác định khối lượng phân tử của EPS và các monosaccharide thành phần. Ngoài ra, phổ khối lượng còn có thể cung cấp thông tin về cấu trúc của EPS, bao gồm các liên kết glycoside và các nhóm thế. Các kỹ thuật phổ khối lượng tiên tiến như MALDI-TOF MS và ESI-MS cho phép phân tích EPS có khối lượng phân tử lớn và độ phức tạp cao.

III. Ảnh Hưởng Của Điều Kiện Nuôi Cấy Đến Sản Xuất EPS

Khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide (EPS) của Lactobacillus plantarum chịu ảnh hưởng lớn bởi các điều kiện nuôi cấy. Các yếu tố quan trọng bao gồm nguồn carbon, nguồn nitrogen, pH, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy. Tối ưu hóa các điều kiện này có thể tăng đáng kể hiệu suất sản xuất EPS. Nghiên cứu cho thấy, việc bổ sung các loại đường khác nhau vào môi trường nuôi cấy có thể ảnh hưởng đến thành phần monosaccharide của EPS. Ngoài ra, pH và nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp EPS.

3.1. Tối Ưu Hóa Nguồn Carbon Cho Sản Xuất Exopolysaccharide

Nguồn carbon là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide (EPS) của Lactobacillus plantarum. Các loại đường khác nhau như glucose, fructose, sucrose và lactose có thể được sử dụng làm nguồn carbon. Hiệu quả của từng loại đường phụ thuộc vào khả năng chuyển hóa của chủng vi khuẩn và ảnh hưởng đến thành phần monosaccharide của EPS. Nghiên cứu cho thấy, việc sử dụng hỗn hợp các loại đường có thể tăng hiệu suất sản xuất EPS so với việc sử dụng một loại đường duy nhất.

3.2. Ảnh Hưởng Của pH Và Nhiệt Độ Đến Sinh Tổng Hợp EPS

pH và nhiệt độ là hai yếu tố môi trường quan trọng ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme và quá trình sinh tổng hợp exopolysaccharide (EPS). Mỗi chủng Lactobacillus plantarum có một khoảng pH và nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển và sản xuất EPS. pH quá cao hoặc quá thấp có thể ức chế hoạt động của enzyme và làm giảm hiệu suất sản xuất EPS. Tương tự, nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp có thể ảnh hưởng đến tính ổn định của enzyme và quá trình trao đổi chất của vi khuẩn.

3.3. Vai Trò Của Nguồn Nitrogen Trong Quá Trình Lên Men Lactobacillus

Nguồn nitrogen đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men của Lactobacillus plantarum, ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng và khả năng sản xuất exopolysaccharide (EPS). Các nguồn nitrogen hữu cơ như peptone, yeast extract và casein thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy. Việc lựa chọn nguồn nitrogen phù hợp và tối ưu hóa nồng độ có thể cải thiện đáng kể hiệu suất sản xuất EPS và các sản phẩm lên men khác.

IV. Tính Chất Và Ứng Dụng Của Exopolysaccharide Từ L

Exopolysaccharide (EPS) từ Lactobacillus plantarum có nhiều tính chất độc đáo, bao gồm khả năng tạo đặc, tạo gel, ổn định nhũ tương và hoạt tính sinh học. Các tính chất này mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng trong thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Trong thực phẩm, EPS có thể được sử dụng để cải thiện cấu trúc, độ nhớt và khả năng giữ nước của sản phẩm. Trong dược phẩm, EPS có thể được sử dụng làm chất mang thuốc hoặc chất tăng cường miễn dịch. Trong mỹ phẩm, EPS có thể được sử dụng làm chất dưỡng ẩm hoặc chất chống oxy hóa.

4.1. Khả Năng Tạo Gel Và Ổn Định Của Exopolysaccharide

Exopolysaccharide (EPS) có khả năng tạo gel và ổn định hệ keo, nhũ tương, là những tính chất quan trọng trong ứng dụng thực phẩm. Khả năng tạo gel của EPS phụ thuộc vào cấu trúc phân tử, khối lượng phân tử và nồng độ. EPS có thể tạo gel ở các điều kiện khác nhau, như pH, nhiệt độ và sự hiện diện của ion kim loại. Tính ổn định của EPS giúp duy trì cấu trúc và tính chất của sản phẩm trong quá trình bảo quản và sử dụng.

4.2. Hoạt Tính Sinh Học Của EPS Đối Với Sức Khỏe

Exopolysaccharide (EPS) từ Lactobacillus plantarum có nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe, bao gồm khả năng tăng cường miễn dịch, kháng virus, chống oxy hóa và chống ung thư. EPS có thể kích thích hệ miễn dịch bằng cách tăng cường hoạt động của tế bào miễn dịch và sản xuất cytokine. EPS cũng có thể ức chế sự phát triển của virus bằng cách ngăn chặn sự xâm nhập của virus vào tế bào. Hoạt tính chống oxy hóa của EPS giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do.

4.3. Ứng Dụng EPS Trong Sản Xuất Thực Phẩm Lên Men

Exopolysaccharide (EPS) đóng vai trò quan trọng trong sản xuất thực phẩm lên men, đặc biệt là các sản phẩm từ sữa và rau quả. EPS có thể cải thiện cấu trúc, độ nhớt và khả năng giữ nước của sản phẩm, đồng thời mang lại hương vị và cảm quan tốt hơn. Trong sữa chua, EPS giúp tạo độ đặc và mịn, ngăn ngừa sự tách lớp whey. Trong rau quả lên men, EPS giúp bảo quản và cải thiện cấu trúc sản phẩm.

V. Nghiên Cứu Cấu Trúc Phân Tử Của EPS Từ L

Nghiên cứu cấu trúc phân tử của exopolysaccharide (EPS) từ Lactobacillus plantarum là cần thiết để hiểu rõ mối quan hệ giữa cấu trúc và tính chất của chúng. Các phương pháp phân tích cấu trúc bao gồm sắc ký khí khối phổ (GC-MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). GC-MS và HPLC được sử dụng để xác định thành phần monosaccharide và tỷ lệ của chúng. NMR cung cấp thông tin chi tiết về các liên kết glycoside và cấu trúc ba chiều của EPS. Thông tin về cấu trúc phân tử giúp dự đoán và tối ưu hóa các ứng dụng của EPS.

5.1. Xác Định Thành Phần Monosaccharide Bằng GC MS Và HPLC

Sắc ký khí khối phổ (GC-MS) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là hai phương pháp chính để xác định thành phần monosaccharide của exopolysaccharide (EPS). GC-MS cung cấp thông tin chi tiết về loại đường và liên kết glycoside, trong khi HPLC cho phép định lượng các loại đường khác nhau. Kết hợp cả hai phương pháp giúp xác định chính xác thành phần monosaccharide và tỷ lệ của chúng trong EPS.

5.2. Phân Tích Liên Kết Glycoside Bằng Cộng Hưởng Từ Hạt Nhân NMR

Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một kỹ thuật mạnh mẽ để phân tích cấu trúc phân tử của exopolysaccharide (EPS), đặc biệt là các liên kết glycoside. NMR cung cấp thông tin chi tiết về vị trí và cấu hình của các liên kết glycoside, giúp xác định cấu trúc ba chiều của EPS. Các thí nghiệm NMR khác nhau, như HSQC, HMBC và NOESY, được sử dụng để xác định các liên kết giữa các nguyên tử carbon và hydro trong phân tử EPS.

5.3. Khối Lượng Phân Tử Của Exopolysaccharide Được Xác Định Như Thế Nào

Khối lượng phân tử của exopolysaccharide (EPS) là một thông số quan trọng ảnh hưởng đến tính chất và ứng dụng của chúng. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử trung bình của EPS. GPC tách các phân tử EPS dựa trên kích thước của chúng, cho phép xác định phân bố khối lượng phân tử và khối lượng phân tử trung bình.

VI. Tiềm Năng Ứng Dụng Của Lactobacillus Plantarum Trong Thực Phẩm

Lactobacillus plantarum, với khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide (EPS), có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm. Việc sử dụng L. plantarum trong quá trình lên men có thể cải thiện cấu trúc, hương vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Ngoài ra, EPS từ L. plantarum có thể được sử dụng như một chất phụ gia tự nhiên để thay thế các chất phụ gia tổng hợp. Nghiên cứu về khả năng ứng dụng của L. plantarum trong thực phẩm đang được tiến hành để khai thác tối đa tiềm năng của chúng.

6.1. Lên Men Sữa Đậu Nành Với Lactobacillus Plantarum

Lên men sữa đậu nành với Lactobacillus plantarum là một phương pháp hiệu quả để cải thiện giá trị dinh dưỡng và cảm quan của sản phẩm. L. plantarum có thể chuyển hóa các hợp chất trong đậu nành, tạo ra các sản phẩm có hương vị thơm ngon và dễ tiêu hóa hơn. Ngoài ra, EPS từ L. plantarum có thể cải thiện cấu trúc và độ nhớt của sữa đậu nành lên men.

6.2. Cải Thiện Cấu Trúc Và Độ Ổn Định Của Thực Phẩm

Exopolysaccharide (EPS) từ Lactobacillus plantarum có thể được sử dụng để cải thiện cấu trúc và độ ổn định của nhiều loại thực phẩm khác nhau. EPS có thể tạo gel, tăng độ nhớt và ổn định nhũ tương, giúp cải thiện cảm quan và kéo dài thời gian bảo quản của sản phẩm. Việc sử dụng EPS như một chất phụ gia tự nhiên là một xu hướng ngày càng phổ biến trong ngành công nghiệp thực phẩm.

6.3. Lactobacillus Plantarum Như Một Probiotic Tiềm Năng

Lactobacillus plantarum được biết đến với nhiều lợi ích sức khỏe, bao gồm khả năng cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường miễn dịch và giảm cholesterol. Do đó, L. plantarum được coi là một probiotic tiềm năng và được sử dụng trong nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng. Nghiên cứu về tác dụng probiotic của L. plantarum đang được tiến hành để chứng minh và mở rộng các ứng dụng của chúng.