Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây dâu tằm (Morus alba L.), thuộc họ Dâu tằm (Moraceae), là loài thực vật có lịch sử sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền phương Đông cũng như trong đời sống kinh tế xã hội. Tất cả các bộ phận của cây dâu tằm như lá (tang diệp), vỏ rễ (tang bạch bì), quả chín (tang thầm), cành non (tang chi) cho đến các sản phẩm ký sinh như tang ký sinh hay tổ bọ ngựa (tang phiêu diêu) đều được ghi nhận là những vị thuốc có giá trị điều trị phong phú. Trong đó, lá dâu tằm thường được sử dụng trong các bài thuốc chủ trị đái tháo đường, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, viêm đường hô hấp, cảm mạo phong nhiệt, nhức đầu và hoa mắt. Bên cạnh đó, theo kinh nghiệm dân gian và các nghiên cứu hiện đại gần đây, lá dâu tằm còn là nguồn nguyên liệu tự nhiên có tiềm năng lớn trong chăm sóc da, hỗ trợ làm trắng da và ức chế hình thành sắc tố melanin.

Mặc dù có lịch sử sử dụng lâu đời và phổ biến rộng rãi tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu toàn diện và có hệ thống về đặc điểm giải phẫu thực vật học cũng như thành phần hóa học chi tiết của nguồn nguyên liệu lá dâu tằm trong nước vẫn còn hạn chế. Nhằm tạo cơ sở khoa học và tiền đề thực nghiệm vững chắc cho việc tiêu chuẩn hóa dược liệu cũng như ứng dụng lá dâu tằm vào lĩnh vực dược phẩm và mỹ phẩm chăm sóc sức khỏe, đề tài "Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của lá cây Dâu tằm (Morus alba L.)" được thực hiện với 3 mục tiêu cụ thể:

  1. Nghiên cứu được đặc điểm về thực vật của cây Dâu tằm (Morus alba L.).
  2. Định tính được các nhóm hợp chất hữu cơ có trong lá cây Dâu tằm bằng các phản ứng hóa học đặc trưng.
  3. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất tinh khiết từ lá cây Dâu tằm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài được xác định cụ thể như sau:

  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lá của loài dâu tằm (Morus alba L.), họ Dâu tằm (Moraceae).
  • Phạm vi không gian: Mẫu thực vật được thu hái trực tiếp tại huyện Phổ Yên, tỉnh Thái Nguyên vào tháng 6 năm 2016. Mẫu nghiên cứu đã được các chuyên gia thực vật học tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học và được lưu trữ tiêu bản tại Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
  • Phạm vi thực nghiệm: Đề tài tập trung vào việc mô tả đặc điểm hình thái thực vật, giải phẫu vi phẫu thân, cuống lá, gân lá và đặc điểm bột dược liệu; khảo sát định tính 14 nhóm hợp chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học; chiết phân đoạn, phân tách sắc ký và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng phương pháp phổ hiện đại.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được triển khai dựa trên cơ sở lý thuyết của phân loại thực vật học, giải phẫu thực vật dược liệu và hóa học các hợp chất thiên nhiên (phytochemistry). Trong đó, khung phân loại thực vật xác định loài nghiên cứu thuộc giới Plantae, ngành Ngọc lan (Magnoliophyta), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), bộ Gai (Urticales), họ Dâu tằm (Moraceae), chi Morus, loài Morus alba L. Cơ sở hóa học thiên nhiên tập trung vào các nhóm hoạt chất thứ cấp chính thường gặp trong chi Morus như flavonoid (đặc biệt là các dẫn chất glycosid của flavonol, prenylflavonoid), hợp chất phenolic, stilbene, alkaloid đa hydroxyl (điển hình là 1-deoxynojirimycin - DNJ), tanin, saponin, acid béo và khoáng chất.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm đã được áp dụng bao gồm:

  • Phương pháp nghiên cứu thực vật học:

    • Mô tả hình thái học phân tích thân, cành, lá, hoa, quả.
    • Phương pháp giải phẫu vi học: Cắt lát vi phẫu cầm tay các bộ phận thân, cuống lá, gân lá; xử lý tẩy bằng nước Javen, ngâm dung dịch acid acetic 5%, rửa sạch và tiến hành nhuộm kép với xanh methylen và đỏ carmin (đỏ son phèn); lên tiêu bản nước cất, quan sát cấu trúc giải phẫu và chụp ảnh hiển vi.
    • Soi kính hiển vi tiêu bản bột dược liệu: Bột lá sấy khô, nghiền mịn được đánh giá cảm quan (màu, mùi, vị), sau đó lên tiêu bản với nước cất để quan sát và ghi nhận các đặc điểm bột đặc trưng.
    • Phương pháp giám định tên khoa học: Đối chiếu đặc điểm hình thái, giải phẫu với các tài liệu phân loại thực vật chuẩn kết hợp tham vấn ý kiến chuyên gia.

  • Phương pháp hóa thực vật định tính: Tiến hành chiết xuất mẫu lá khô với các dung môi có độ phân cực khác nhau (nước, ethanol, ether dầu hỏa, n-hexan) và thực hiện các phản ứng hóa học ống nghiệm đặc trưng để định tính 14 nhóm chất: saponin (thử nghiệm tạo bọt), alkaloid (thuốc thử Mayer, Dragendorff, Bouchardat), anthranoid (phản ứng Borntraeger), glycosid tim (Liebermann-Burchard, Legal, Baljet, Keller-Kiliani), flavonoid (phản ứng Cyanidin, hơi $NH_3$, dung dịch $NaOH$ 10%, $FeCl_3$ 5%), coumarin (phản ứng đóng mở vòng lacton), tanin (dung dịch $FeCl_3$ 5%, gelatin 1%, chì acetat 10%, đồng acetat 10%), đường khử (thuốc thử Fehling A và B), chất béo (thử vết mờ trên giấy lọc), sterol (Liebermann-Burchard), caroten (phản ứng với $H_2SO_4$ đặc), polysaccharid (thuốc thử Lugol), acid amin (thuốc thử Ninhydrin 3%), acid hữu cơ (phản ứng giải phóng khí với $Na_2CO_3$).

  • Phương pháp chiết xuất, phân tách và phân lập hợp chất:

    • Chiết ngấm kiệt lạnh mẫu bột lá khô (6,0 kg) với methanol (MeOH, 9,0 lít/lần $\times$ 4 lần, mỗi lần 48 giờ ở nhiệt độ phòng). Gộp dịch chiết, lọc và cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm được 520 g cao chiết tổng MeOH.
    • Chiết phân bố lỏng - lỏng phân đoạn: Cao tổng được phân tán vào nước cất và lắc phân bố lần lượt với n-hexan và ethyl acetat (EtOAc) để thu được các cắn chiết có độ phân cực tăng dần: cắn n-hexan (60 g), cắn EtOAc (75 g) và cắn nước (42 g).
    • Phân tách sắc ký: Kết hợp sắc ký lớp mỏng phân tích (TLC) trên bản nhôm silica gel $60\text{ }F_{254}$ và pha đảo $RP\text{-}18\text{ }F_{254s}$; sắc ký cột cổ điển (CC) sử dụng chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 0,040–0,063 mm và 0,063–0,200 mm, Merck / Nacalai Tesque), silica gel pha đảo (ODS, YMC-gel, kích thước hạt $50\text{ }\mu\text{m}$), và nhựa hấp phụ trao đổi ion Diaion HP-20.

  • Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Đo điểm nóng chảy (máy SMP10 BioCote), phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis), góc quay cực riêng (máy PLR-4, MRC), phổ khối ion hóa phun bụi điện tử (ESI-MS trên thiết bị AGILENT 1260 Series LC-MS Ion Trap) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT, HSQC, HMBC ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong và ngoài nước liên quan đến chi Morus và loài Morus alba L. Tác giả trình bày vị trí phân loại học thực vật, đặc điểm sinh thái, nguồn gốc từ Trung Quốc và phân bố rộng rãi tại Việt Nam. Về thành phần hóa học, tổng quan chỉ rõ chi Morus rất giàu các dẫn chất flavonoid (như quercetin, quercitrin, rutin, isoquercitrin, moracetin, astragalin, moralbanon, leachianon G, kuwanon C), các dẫn chất stilbenoid (oxyresveratrol, mulberroside A), alkaloid nhóm iminosugar (1-deoxynojirimycin - DNJ với hàm lượng cao nhất trong các alkaloid), 13 loại acid béo (trong đó acid $\alpha$-linolenic chiếm tới 34,97–37,57%, acid palmitic chiếm 25,99–26,38%, acid linoleic chiếm 14,76–16,05%), vitamin C, caroten, các acid phenolic và khoáng chất.

Số liệu tổng hợp về hàm lượng dinh dưỡng và khoáng chất trong lá dâu tằm giữa dạng tươi và khô được trình bày đối chiếu trong văn bản:

Thành phần / Chỉ tiêu Lá Dâu tằm tươi Lá Dâu tằm khô
Độ ẩm (%) 71,13 – 76,68 5,11 – 7,24
Protein (%) 4,72 – 9,96 15,31 – 30,91
Chất béo (%) 0,64 – 1,51 2,09 – 4,93
Carbohydrat (%) 8,01 – 13,42 9,70 – 29,64
Acid ascorbic (mg/100g) 160 – 280 100 – 200
$\beta$-Caroten (mg/100g) 10,00 – 14,688 8,438 – 13,125
Sắt - Iron (mg/100g) 19,66 380 – 786

Về mặt dược lý và y học cổ truyền, chương 1 phân tích các tác dụng sinh học đã được chứng minh của lá và các bộ phận khác: tác dụng chống oxy hóa qua cơ chế dọn gốc tự do của flavonoid và acid chlorogenic; tác dụng chống viêm qua ức chế con đường sinh tổng hợp prostaglandin; tác dụng làm trắng da thông qua cơ chế ức chế enzyme tyrosinase (do mulberroside F, oxyresveratrol, các glycosid flavonol malonyl hóa); tác dụng hạ đường huyết, ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase và bảo vệ tế bào gan. Đồng thời, tác giả tóm lược tính vị, quy kinh và công năng chủ trị theo Đông y của bốn vị thuốc từ cây dâu: Tang diệp (lá dâu), Tang bạch bì (vỏ rễ), Tang thầm (quả dâu chín) và Tang chi (cành non).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc mẫu thực vật thu hái tại huyện Phổ Yên, tỉnh Thái Nguyên (tháng 6/2016) và quy trình xử lý nguyên liệu (rửa sạch, sấy khô ở 50°C, xay bột mịn). Tác giả quy chuẩn hóa danh mục hóa chất tẩy nhuộm, dung môi phân tích và các thiết bị phân tích hiện đại sử dụng trong đề tài. Quy trình thực nghiệm được xây dựng cụ thể cho từng nội dung:

  • Kỹ thuật cắt vi phẫu bằng dụng cụ cầm tay, tẩy sắc tố bằng nước Javen, trung hòa bằng acid acetic 5% và nhuộm kép hai màu xanh methylen - đỏ carmin.
  • Quy trình tiến hành 14 phép thử định tính hóa học ống nghiệm trên các phân đoạn dịch chiết.
  • Quy trình chiết ngấm kiệt 6,0 kg bột dược liệu bằng methanol (4 chu kỳ $\times$ 9 L $\times$ 48 giờ) và quy trình chiết phân đoạn lỏng - lỏng với n-hexan và ethyl acetat.
  • Quy trình sắc ký cột: Phân tách 50 g cắn EtOAc trên cột silica gel pha thường (kích thước cột $60 \times 10\text{ cm}$) rửa giải bằng hệ dung môi DCM:MeOH (tỷ lệ 20:1 giảm dần đến 0:1) để thu 4 phân đoạn (B1 đến B4); sau đó phân tách phân đoạn B3 (12,0 g) qua cột pha đảo YMC ODS-A ($80 \times 3\text{ cm}$ và $80 \times 1,5\text{ cm}$, dung môi aceton:nước 2:5) và cột silica gel pha thường ($CHCl_3$:MeOH 5:2) để tinh chế hợp chất DB1. Phân tách 30 g cắn nước qua cột Diaion HP-20 ($60 \times 5\text{ cm}$, dung môi nước:MeOH 4:1 đến 1:1) thu 3 phân đoạn (C1 đến C3); tiếp tục tinh chế phân đoạn C3 (9,5 g) qua 2 lần sắc ký cột pha đảo YMC ODS-A (dung môi MeOH:nước 2:1 và aceton:nước 3:5) để tinh chế hợp chất LC1.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày toàn bộ các phát hiện thực nghiệm của khóa luận:

  1. Đặc điểm hình thái và giải phẫu:

    • Cây dâu tằm cao 2–3 m (dạng trồng tỉa lấy lá), thân cành nhiều nhựa mủ trắng, không có gai; mầm đỉnh và mầm nách phát triển. Lá mọc so le, phiến lá dài 8–15 cm, gốc hình tim, chóp nhọn, mép có răng cưa to, từ cuống tỏa ra 3 gân chính rõ rệt. Hoa đơn tính, đực và cái mọc thành bông riêng biệt; quả phức hình trứng gồm nhiều quả bế nạc bao bọc bởi đài hoa mọng nước, khi chín chuyển từ đỏ sang tím sẫm.
    • Vi phẫu thân: Hình tròn, nhiều lông che chở ở ngoài biểu bì phủ cutin; mô mềm vỏ tế bào đa giác góc tròn; mô dày xếp thành hình vuông khép kín; trụ bì bao quanh bó gỗ liên tục; trong cùng là mô mềm ruột.
    • Vi phẫu cuống lá: Cấu tạo tương tự thân, có lớp mô cứng gồm các tế bào chết màng dày hóa gỗ nâng đỡ nằm cạnh mô mềm ruột.
    • Vi phẫu gân lá: Biểu bì trên có tế bào lớn, mang lông chứa nang thạch (bào thạch); biểu bì dưới mang nhiều khí khổng; mô dày phát triển thành 2 đám trên và dưới; mô mềm chứa tinh thể calci oxalat hình cầu gai và hình phiến; cung libe - gỗ hình chữ U (gỗ ở trên, libe ở dưới) có sợi bao quanh.
    • Tiêu bản bột lá: Bột mịn, màu lục xám, không vị, mùi thơm đặc trưng. Dưới kính hiển vi quan sát thấy các cấu tử nhận dạng đặc trưng gồm: bào thạch (nang thạch), tinh thể calci oxalat hình cầu gai và hình phiến, mảnh biểu bì kèm lỗ khí, mảnh mạch vạch/mạch xoắn và lông che chở đơn bào/đa bào.
    • Tên khoa học được xác định chính xác là Morus alba L., họ Dâu tằm (Moraceae).

  2. Kết quả định tính thành phần hóa học: Kết quả thực hiện 14 phép thử định tính hóa học ống nghiệm trên lá dâu tằm được tổng hợp như sau:

STT Nhóm hợp chất Phản ứng / Thuốc thử định tính Kết quả Kết luận
1 Saponin Hiện tượng tạo bọt bền sau 15 phút ++ Dương tính
2 Alkaloid Thuốc thử Mayer, Dragendorff, Bouchardat - Âm tính
3 Anthranoid Phản ứng Borntraeger - Âm tính
4 Glycosid tim Liebermann, Legal, Baljet, Keller-Kiliani - Âm tính
5 Flavonoid Phản ứng Cyanidin, hơi $NH_3$, dung dịch $FeCl_3$ 5% +++ / ++ / +++ Dương tính
6 Coumarin Phản ứng mở/đóng vòng lacton - Âm tính
7 Tanin $FeCl_3$ 5%, Gelatin 1%, $Pb(CH_3COO)_2$ 10%, $Cu(CH_3COO)_2$ +++ Dương tính
8 Đường khử Thuốc thử Fehling A và B - Âm tính
9 Chất béo Thử vết mờ trên giấy lọc - Âm tính
10 Sterol $H_2SO_4$ đặc / Anhydrid acetic - Âm tính
11 Caroten Phản ứng tạo màu xanh lá với $H_2SO_4$ đặc + Dương tính
12 Polysaccharid Thuốc thử Lugol - Âm tính
13 Acid amin Thuốc thử Ninhydrin - Âm tính
14 Acid hữu cơ Bột $Na_2CO_3$ giải phóng bọt khí - Âm tính

(Ghi chú: (-) âm tính, (+) dương tính, (++) dương tính rõ, (+++) dương tính rất rõ)

  1. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học:
    • Hợp chất DB1 (48 mg): Phân lập từ phân đoạn cắn ethyl acetat dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng, nhiệt độ nóng chảy $178\text{–}179^\circ\text{C}$. Phổ ESI-MS cho pic ion phân tử tại $m/z\text{ }447\text{ }[M-H]^-$ và $471\text{ }[M+Na]^+$, xác định khối lượng phân tử $M = 448\text{ g/mol}$, công thức phân tử $C_{21}H_{20}O_{11}$. Phổ $^1\text{H-NMR}$ ($DMSO-d_6$, 500 MHz) cho thấy proton anomer tại $\delta_H\text{ }5,44\text{ (1H, }d, J=7,5\text{ Hz})$; cặp tín hiệu doublet tương tác meta tại $\delta_H\text{ }6,24\text{ (}d, J=2,0\text{ Hz, H-6)}$ và $\delta_H\text{ }6,43\text{ (}d, J=2,0\text{ Hz, H-8)}$ đặc trưng cho vòng A flavonol; hệ thống spin vòng B thế para gồm 2 tín hiệu doublet tại $\delta_H\text{ }8,05\text{ (2H, }dd, J=1,5; 7,0\text{ Hz, H-2', H-6')}$ và $\delta_H\text{ }6,87\text{ (2H, }dd, J=1,5; 7,0\text{ Hz, H-3', H-5')}$. Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ ghi nhận 21 tín hiệu carbon (15 carbon khung kaempferol và 6 carbon đơn vị $\beta$-D-glucopyranosyl). Tương tác HMBC giữa $H-1''$ ($\delta_H\text{ }5,44$) với carbon $C-3$ ($\delta_C\text{ }133,4$) khẳng định liên kết glycosid tại vị trí C-3. DB1 được xác định là Kaempferol 3-O-$\beta$-D-glucopyranosid (astragalin).
Vị trí C $\delta_C$ DB1 (ppm) $\delta_C$ tham khảo (ppm) $\delta_H$ DB1 (ppm, $J$ tính bằng Hz) Tương tác HMBC ($H \rightarrow C$)
2 156,7 156,7 - -
3 133,4 133,5 - -
4 177,7 177,6 - -
5 161,4 160,8 - -
6 98,9 99,3 6,24 (d, 2,0) C-5, C-7, C-8, C-10
7 164,4 162,2 - -
8 94,0 94,5 6,43 (d, 2,0) C-6, C-7, C-9, C-10
9 156,6 156,0 - -
10 104,3 105,5 - -
1' 121,2 120,7 - -
2', 6' 131,2 130,9 8,05 (dd, 1,5; 7,0) C-2, C-4', C-2', C-6'
3', 5' 115,4 115,1 6,87 (dd, 1,5; 7,0) C-1', C-3', C-4', C-5'
4' 160,1 160,2 - -
1'' 101,1 100,8 5,44 (d, 7,5) C-3
2''–6'' 74,4; 77,6; 70,1; 76,6; 61,1 - Vùng proton đường -
  • Hợp chất LC1 (30 mg): Phân lập từ phân đoạn cắn nước dưới dạng bột màu vàng nhạt, phổ UV $\lambda_{max}\text{ (MeOH)}$: 265, 328, 343 nm. Phổ ESI-MS cho pic ion giả phân tử tại $m/z\text{ }577,5\text{ }[M-H]^-$, khối lượng phân tử $M = 578\text{ g/mol}$, công thức phân tử $C_{27}H_{30}O_{14}$. Phổ $^1\text{H-NMR}$ ($DMSO-d_6$, 500 MHz) chỉ ra các tín hiệu proton khung kaempferol: $\delta_H\text{ }6,45\text{ (1H, }d, J=2,0\text{ Hz, H-6)}$, $\delta_H\text{ }6,77\text{ (1H, }d, J=2,0\text{ Hz, H-8)}$, $\delta_H\text{ }7,79\text{ (2H, }d, J=9,0\text{ Hz, H-2', H-6')}$, $\delta_H\text{ }6,92\text{ (2H, }d, J=8,5\text{ Hz, H-3', H-5')}$, cùng một tín hiệu singlet đặc trưng của nhóm 5-OH liên kết hydro nội phân tử ở $\delta_H\text{ }12,592\text{ ppm}$. Đồng thời, phổ ghi nhận sự có mặt của 2 gốc đường rhamnose: 2 proton anomer ở $\delta_H\text{ }5,30\text{ (1H, }s, H-1'')$ và $\delta_H\text{ }5,54\text{ (1H, }s, H-1''')$; 2 nhóm methyl dạng doublet ở $\delta_H\text{ }0,81\text{ (3H, }d, J=5,5\text{ Hz, H-6'')$ và $\delta_H\text{ }1,13\text{ (3H, }d, J=6,5\text{ Hz, H-6''')$. Phổ $^{13}\text{C-NMR}$ và DEPT cho thấy 27 tín hiệu carbon (16 nhóm methin, 2 nhóm methyl $\delta_C\text{ }17,50$ và $17,94$, 2 carbon anomer $\delta_C\text{ }101,96$ và $98,53$). Phổ 2 chiều HMBC chỉ ra tương tác rõ ràng giữa $H-1''$ ($\delta_H\text{ }5,30$) với $C-3$ ($\delta_C\text{ }134,66$) và giữa $H-1'''$ ($\delta_H\text{ }5,54$) với $C-7$ ($\delta_C\text{ }161,80$). Từ đó, hợp chất LC1 được xác định là Kaempferol-3,7-di-O-$\alpha$-L-rhamnopyranosid (tên thông thường: kaempferitrin).

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu đề ra và cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm cụ thể:

  • Xác lập đầy đủ các thông số thực vật học và tiêu chuẩn giải phẫu vi học của thân, cuống lá, gân lá cũng như các cấu tử vi học đặc trưng của bột lá cây dâu tằm (Morus alba L.) thu hái tại Thái Nguyên.
  • Chứng minh bằng thực nghiệm định tính sự có mặt của 4 nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu trong lá dâu tằm gồm flavonoid, tanin, saponin và caroten; trong khi các phép thử đối với alkaloid, anthranoid, glycosid tim, coumarin, đường khử, chất béo, sterol, polysaccharid, acid amin và acid hữu cơ cho kết quả âm tính trong điều kiện khảo sát.
  • Từ 6,0 kg bột khô lá dâu tằm qua quy trình chiết ngấm kiệt và sắc ký cột phân đoạn đa bước, đã tinh chế và làm sáng tỏ cấu trúc hóa học hoàn chỉnh của 2 hợp chất flavonoid tinh khiết:
    1. DB1: Kaempferol 3-O-$\beta$-D-glucopyranosid (khối lượng thu được: 48 mg).
    2. LC1: Kaempferol-3,7-di-O-$\alpha$-L-rhamnopyranosid / Kaempferitrin (khối lượng thu được: 30 mg).

Về mặt đóng góp khoa học, tác giả nhấn mạnh đây là công trình đầu tiên công bố việc phân lập và xác định cấu trúc thành công của 2 hợp chất flavonoid glycosid nói trên từ lá cây dâu tằm (Morus alba L.) thu hái tại Việt Nam. Kết quả này cung cấp thêm dữ liệu hóa thực vật mới cho nguồn tài nguyên dược liệu trong nước.

Về mặt kiến nghị, tác giả đề xuất hai hướng tiếp nối:

  1. Tiếp tục triển khai nghiên cứu phân lập sâu hơn các phân đoạn còn lại để phân tách và xác định thêm các hợp chất hóa học khác có trong lá dâu tằm thu hái tại Thái Nguyên.
  2. Thiết kế và tiến hành các thử nghiệm sinh học nhằm đánh giá tác dụng chống oxy hóa và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase (làm trắng da) của cao chiết toàn phần, các phân đoạn chiết và từng hợp chất tinh khiết đã phân lập được.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận có một số giới hạn thực tế được xác định từ phạm vi nghiên cứu và nội dung trình bày:

  • Mẫu thực vật nghiên cứu chỉ được thu hái tại một địa điểm duy nhất (huyện Phổ Yên, tỉnh Thái Nguyên) vào một thời điểm trong năm (tháng 6/2016), chưa khảo sát biến thiên hàm lượng hoạt chất theo mùa vụ hoặc theo các vùng địa lý khác nhau.
  • Phép thử định tính alkaloid cho kết quả âm tính bằng các thuốc thử kết tủa thông thường (Mayer, Dragendorff, Bouchardat), do các alkaloid đặc trưng của lá dâu (như 1-deoxynojirimycin - DNJ) thuộc nhóm polyhydroxylated alkaloid/sugar-mimic có tính phân cực cao, không tạo tủa với các thuốc thử alkaloid kinh điển mà cần phương pháp sắc ký chuyên biệt để phát hiện.
  • Đề tài mới dừng lại ở việc định tính nhóm chất, phân lập và xác định cấu trúc 2 hợp chất hóa học; chưa tiến hành định lượng hàm lượng hoạt chất bằng HPLC và chưa triển khai các thử nghiệm hoạt tính sinh học (in vitro, in vivo) đối với các chất phân lập được do giới hạn về thời gian và khuôn khổ của một khóa luận đại học.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên môn hữu ích cho:

  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Dược học, Dược liệu - Dược học cổ truyền, Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Thực vật học.
  • Các nhà nghiên cứu và kiểm nghiệm viên cần tài liệu đối chiếu về giải phẫu thực vật, đặc điểm vi phẫu và soi bột phục vụ công tác xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu lá dâu tằm (Morus alba L.) theo Dược điển.
  • Các nhóm nghiên cứu phát triển sản phẩm thiên nhiên quan tâm đến quy trình chiết ngấm kiệt, kỹ thuật sắc ký cột phân đoạn (Diaion HP-20, Silica gel, YMC ODS-A) và phương pháp phân tích phổ NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT, HSQC, HMBC), ESI-MS để giải cấu trúc hợp chất tự nhiên.

Câu hỏi thường gặp

1. Hai hợp chất flavonoid tinh khiết được phân lập từ lá dâu tằm trong khóa luận có tên và khối lượng phân tử là gì? Khóa luận đã phân lập được 2 hợp chất gồm:

  • Hợp chất DB1: Kaempferol 3-O-$\beta$-D-glucopyranosid (còn gọi là astragalin), công thức phân tử $C_{21}H_{20}O_{11}$, khối lượng phân tử $M = 448\text{ g/mol}$, nhiệt độ nóng chảy $178\text{–}179^\circ\text{C}$.
  • Hợp chất LC1: Kaempferol-3,7-di-O-$\alpha$-L-rhamnopyranosid (còn gọi là kaempferitrin), công thức phân tử $C_{27}H_{30}O_{14}$, khối lượng phân tử $M = 578\text{ g/mol}$.

2. Khối lượng nguyên liệu bột lá ban đầu và lượng cao chiết thu được qua các phân đoạn là bao nhiêu? Từ 6,0 kg bột lá dâu tằm khô, sau khi ngâm chiết với methanol thu được 520 g cao chiết tổng MeOH. Qua phân bố lỏng - lỏng với các dung môi, tác giả thu được 60 g cắn n-hexan, 75 g cắn ethyl acetat và 42 g cắn nước. Từ 50 g cắn ethyl acetat tinh chế được 48 mg hợp chất DB1; từ 30 g cắn nước tinh chế được 30 mg hợp chất LC1.

3. Đặc điểm vi phẫu gân lá và bột lá dâu tằm có những yếu tố giải phẫu đặc trưng nào?

  • Vi phẫu gân lá: Có lớp biểu bì trên mang lông chứa nang thạch (bào thạch), biểu bì dưới có nhiều khí khổng; mô dày phát triển ở cả hai mặt trên và dưới; mô mềm chứa tinh thể calci oxalat hình cầu gai và hình phiến; cung libe - gỗ hình chữ U với gỗ ở trên, libe ở dưới và có sợi bao quanh.
  • Bột lá: Màu lục xám, có mùi thơm đặc trưng, khi soi kính hiển vi thấy các mảnh biểu bì kèm lỗ khí, bào thạch, tinh thể calci oxalat cầu gai/phiến, mảnh mạch và lông che chở đơn bào/đa bào.

4. Dữ liệu phổ nào đóng vai trò quyết định trong việc xác định vị trí gắn gốc đường của hai hợp chất DB1 và LC1? Vị trí gắn gốc đường được xác định thông qua phổ tương tác xa hai chiều HMBC:

  • Đối với DB1: Tương tác giữa proton anomer $H-1''$ ($\delta_H\text{ }5,44\text{ ppm}$) với carbon $C-3$ ($\delta_C\text{ }133,4\text{ ppm}$) khẳng định gốc $\beta$-D-glucopyranosyl liên kết tại vị trí C-3 của khung kaempferol.
  • Đối với LC1: Tương tác giữa proton anomer $H-1''$ ($\delta_H\text{ }5,30\text{ ppm}$) với carbon $C-3$ ($\delta_C\text{ }134,66\text{ ppm}$) và tương tác giữa proton anomer $H-1'''$ ($\delta_H\text{ }5,54\text{ ppm}$) với carbon $C-7$ ($\delta_C\text{ }161,80\text{ ppm}$) khẳng định 2 gốc $\alpha$-L-rhamnopyranosyl liên kết lần lượt tại vị trí C-3 và C-7 của khung kaempferol.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã hoàn thành toàn diện việc nghiên cứu đặc điểm thực vật học, khảo sát định tính hóa học và phân lập thành phần hoạt chất từ lá cây Dâu tằm (Morus alba L.) thu hái tại huyện Phổ Yên, tỉnh Thái Nguyên. Công trình đã mô tả chi tiết các đặc điểm giải phẫu vi phẫu thân, lá và bột dược liệu, đồng thời chứng minh sự hiện diện của các nhóm hoạt chất flavonoid, tanin, saponin và caroten. Đóng góp nổi bật của đề tài là lần đầu tiên tại Việt Nam đã chiết xuất, phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc hóa học hoàn chỉnh bằng các phương pháp phổ hiện đại đối với 2 hợp chất flavonoid glycosid tinh khiết là Kaempferol 3-O-$\beta$-D-glucopyranosid và Kaempferol-3,7-di-O-$\alpha$-L-rhamnopyranosid. Kết quả này cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho việc kiểm nghiệm tiêu chuẩn hóa và định hướng khai thác ứng dụng dược liệu dâu tằm trong phát triển dược phẩm và mỹ phẩm chăm sóc sức khỏe.