Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa với mức độ đa dạng sinh học cao, sở hữu nguồn tài nguyên dược liệu tự nhiên phong phú. Theo thống kê của Trung tâm Giám sát Bảo tồn Thế giới (1992) được trích dẫn trong văn bản, Việt Nam có khoảng 20.000 loài thực vật, xếp thứ 16 trên thế giới về đa dạng sinh học và chiếm 6,5% tổng số loài toàn cầu. Điều kiện khí hậu nóng ẩm mưa nhiều tạo thuận lợi cho thảm thực vật phát triển, song cũng thúc đẩy sự gia tăng của các vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm. Trước thực trạng các vi khuẩn và nấm xuất hiện hiện tượng kháng thuốc, xu hướng sàng lọc và tìm kiếm các hoạt chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu tự nhiên ngày càng được chú trọng do tính an toàn và chi phí nghiên cứu thấp hơn so với con đường tổng hợp hóa học.

Cây Rau trai, còn gọi là Rau rươi hay Trai hoa trần, có tên khoa học là Murdannia nudiflora (L.) Brenan, thuộc chi Murdannia, họ Thài lài (Commelinaceae). Loài thực vật này phân bố tương đối rộng rãi tại các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong y học cổ truyền, cây được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để điều trị rắn cắn, thũng độc, ho ra máu, mụn nhọt, lở ngứa. Tuy nhiên, các công bố khoa học về loài này trên thế giới còn hạn chế, chủ yếu dừng lại ở các thử nghiệm sơ bộ trên động vật; tại Việt Nam, cây chủ yếu mọc hoang dại như cỏ dại và chưa được quy hoạch trồng trọt làm dược liệu do thiếu hụt các dữ liệu thực nghiệm về thành phần hóa học cũng như kiểm chứng lâm sàng trên người.

Các nghiên cứu trước đó đã ghi nhận sự có mặt của các nhóm chất như carbohydrat, tannin, flavonoid, saponin, alcaloid, và từng phân lập được hai hợp chất là tricosanoic acid cùng 6-methoxy-1H-indol-3-methyl carboxylat từ dịch chiết ethyl acetat. Nhằm tiếp tục làm sáng tỏ thành phần hóa học của loài dược liệu này, đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn dịch chiết ethylacetat từ cây Rau trai [Murdannia nudiflora (L.) Brenan]" được thực hiện với 02 nhiệm vụ và mục tiêu cụ thể:

  1. Chiết xuất, phân lập một số hợp chất hóa học của phân đoạn dịch chiết ethyl acetat từ cây Rau trai.
  2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được.

Đối tượng nghiên cứu của khóa luận là phần trên mặt đất của cây Rau trai (Murdannia nudiflora (L.) Brenan). Mẫu nghiên cứu được thu hái tại thị trấn Thanh Sơn, huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ vào ngày 04 tháng 12 năm 2021. Mẫu thực vật tươi gồm thân mang lá và hoa đã được giám định tên khoa học tại Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội (Phiếu giám định số: 21/2021-UMP). Phạm vi nghiên cứu giới hạn ở quy trình chiết xuất, phân lập sắc ký và giải cấu trúc các hợp chất tinh khiết từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat của mẫu dược liệu trên.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên cơ sở lý thuyết về phân loại học thực vật, hóa thực vật học và các phương pháp vật lý - hóa lý hiện đại dùng trong xác định cấu trúc hợp chất thiên nhiên:

  • Khung phân loại và tổng quan hóa thực vật: Vị trí phân loại của chi Murdannia thuộc giới Plantae, ngành Angiosperms, lớp Monocots, bộ Commelinales, họ Commelinaceae. Các tài liệu tham khảo chính gồm "Cây cỏ Việt Nam" (GS. Phạm Hoàng Hộ), "Từ điển cây thuốc Việt Nam", cùng các công bố quốc tế về chiết xuất phân đoạn và hoạt tính sinh học của Murdannia nudiflora (Kuppusamy và cộng sự, Muhammad Shah Dawood và cộng sự, Huq Samin và cộng sự).
  • Phương pháp chiết xuất và phân bố lỏng - lỏng: Phương pháp ngâm chiết kiệt hồi lưu nhiệt độ phòng với dung môi ethanol 70% (v/v), thu hồi dung môi dưới áp suất giảm trên máy cô quay chân không để thu cao tổng. Sau đó, cao tổng được phân tán vào nước cất và chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan và ethyl acetat.
  • Phương pháp phân lập hợp chất: Sử dụng kỹ thuật sắc ký cột cổ điển (Column Chromatography - CC) với chất hấp phụ là silicagel pha thường có các kích cỡ hạt 0,063 - 0,200 mm và 0,040 - 0,063 mm (hãng Merck). Kích thước cột chính là 60 cm × 3 cm. Hệ dung môi rửa giải gồm dichloromethan : methanol và n-hexan : ethyl acetat với tỷ lệ phân cực tăng dần. Quá trình chia phân đoạn và gộp phân đoạn được theo dõi liên tục bằng sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) trên bản mỏng nhôm tráng sẵn Kieselgel 60 F254 (độ dày 0,20 mm) và RP-18 F254 (độ dày 0,25 mm). Bản mỏng được soi dưới đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm, sau đó hiện màu bằng thuốc thử dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và gia nhiệt trên bếp điện.
  • Phương pháp xác định cấu trúc: Phối hợp các phép đo vật lý và hóa lý gồm: đo nhiệt độ nóng chảy trên thiết bị SMP10 BioCote; ghi phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) trên hệ thống Varian Agilent 1100 LC/MSD; ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân bao gồm phổ 1H-NMR (tần số 500 MHz), phổ 13C-NMR (tần số 125 MHz) và phổ phân biệt nhóm chức DEPT (DEPT-90 và DEPT-135 MHz) trên máy Bruker AVANCE AV 500 tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST).
  • Nguồn dữ liệu đối chiếu: Dữ liệu phổ thực nghiệm thu được đối chiếu trực tiếp với các số liệu chuẩn đã được công bố trên các tạp chí chuyên ngành quốc tế để xác định danh pháp và cấu hình lập thể.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu và tổng quan tài liệu về chi Murdannia và loài Murdannia nudiflora

Chương tổng quan hệ thống hóa các đặc điểm thực vật học, vùng phân bố, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của chi Murdannia nói chung và loài Murdannia nudiflora nói riêng:

  • Đặc điểm phân bố và hình thái: Chi Murdannia có khoảng 60 loài trên thế giới, tập trung nhiều nhất ở châu Á (chiếm hơn 50%). Tại Việt Nam, tài liệu ghi nhận có 15 loài, tiêu biểu như M. bracteata, M. divergens, M. edulis, M. medica, M. nudiflora, M. simplex, M. spirata, M. triquetra. Cây Rau trai (M. nudiflora) là loài thảo mảnh, sống hàng năm hoặc lâu năm, thân phân nhánh dài 15–30 cm (có thể đạt 50 cm), mọng nước, có rễ mọc ở các đốt. Lá đơn mọc so le, phiến lá thuôn dài 3–10 cm, rộng 4–10 mm, bẹ lá dài 0,2–1 cm có lông nhung ôm lấy thân. Hoa màu tím hoặc hồng hoa cà, lưỡng tính hoặc hoa đực, có 3 lá đài, 3 cánh hoa, 2–3 nhị hữu thụ và 2–4 nhị bất thụ. Quả nang 3 ô, mở thành 3 mảnh chứa hạt nhỏ màu vàng nâu.
  • Thành phần hóa học đã biết: Theo y học cổ truyền, cây tươi chứa 90,1% nước, 1,7% protein, 4,2% dẫn xuất không protein, 0,5% lipid, 2% cellulose và 1,5% khoáng toàn phần. Các nghiên cứu hiện đại bằng GC-MS đã định danh nhiều cấu tử hữu cơ như: phytol, n-decanoic acid, muscimol, phenol, eugenol, benzyl alcohol, ethyl hexadecanoat, dodecanoic acid, 9,12-octadecadienoic acid, n-hexadecanoic acid, indol, 2-methoxy-4-vinylphenol, 2-pentadecanon 6,10,14-trimethyl phenol. Năm 2022, khóa luận của Hà Thu Trà lần đầu phân lập được tricosanoic acid và 6-methoxy-1H-indol-3-methyl carboxylat từ phân đoạn ethyl acetat của cây này tại Việt Nam.
  • Dược lý thực nghiệm: Tổng quan liệt kê các hoạt tính sinh học gồm:
    • Chống oxy hóa: Khả năng thu dọn gốc tự do DPPH của dịch chiết methanol đạt từ 82,539% đến 96,825% (IC50 = 1,51 × 10⁻¹⁰ µg/mL). Các cấu tử hòa tan trong lipid có IC50 dọn gốc tự do DPPH và ABTS lần lượt là 5,255 mg/mL và 3,848 mg/mL.
    • Giảm đau: Thử nghiệm trên chuột nhắt trắng bằng đĩa nóng (dịch chiết ethanol) và gây quằn quại bằng acid acetic 0,7% (dịch chiết methanol với tỷ lệ ức chế cơn đau đạt 85,67% ở liều 200 mg/kg và 59,57% ở liều 100 mg/kg, so với 80,74% của diclofenac natri 25 mg/kg).
    • Kháng khuẩn và chống viêm: Dịch chiết nước ức chế Pseudomonas aeruginosa (MIC = 12,25 mg/mL), Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus. In vivo làm giảm các cytokin tiền viêm TNF-α, IL-6, PEG-2.
    • Bảo vệ gan: Dịch chiết methanol (14 ngày) ức chế tổn thương hoại tử mô gan do CCl4 ở chuột, làm giảm enzym ALT, AST, giảm nồng độ MDA và phục hồi hệ thống enzym chống oxy hóa (catalase, GSH, GSH-Px, GSH-Rd, G6PD).
    • Chống ung thư: Hạt nano vàng và bạc sinh tổng hợp từ dịch chiết nước có độc tính tế bào đối với dòng ung thư ruột kết HCT-116 với IC50 lần lượt là 200 và 100 µg/mL.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này trình bày chi tiết về nguồn gốc mẫu, hóa chất sử dụng và các quy trình thực nghiệm:

  • Xử lý mẫu ban đầu: 3,0 kg phần trên mặt đất của M. nudiflora sau khi rửa sạch, cắt nhỏ, phơi khô và sấy ở 80°C được đưa vào chiết xuất.
  • Quy trình chiết tách phân đoạn:
    • Dược liệu khô được ngâm chiết 3 lần với ethanol 70% ở nhiệt độ phòng (lần 1: 12 L trong 3 ngày; lần 2: 8 L trong 2 ngày; lần 3: 8 L trong 2 ngày). Gộp dịch chiết, lọc qua giấy lọc và cô quay thu hồi ethanol dưới áp suất giảm, thu được 263 g cao chiết tổng ethanol.
    • Lấy 200 g cao tổng phân tán đồng nhất trong 200 mL nước cất (tỷ lệ 1:1, m/v), sau đó chiết phân bố lỏng - lỏng với n-hexan (3 lần × 900 mL, mỗi lần lắc 30 phút). Gộp pha n-hexan, cô thu hồi dung môi thu được 36,8 g cắn n-hexan (ký hiệu H).
    • Pha nước còn lại tiếp tục được chiết phân bố với ethyl acetat (3 lần × 900 mL, mỗi lần lắc 30 phút). Gộp dịch chiết ethyl acetat, cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 54,6 g cắn ethyl acetat (ký hiệu E).

Kết quả nghiên cứu: Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học

Chương này mô tả kết quả phân lập từ cắn ethyl acetat và phân tích phổ để làm sáng tỏ cấu trúc của 3 hợp chất:

  • Quá trình sắc ký phân lập: Lấy 45 g cắn ethyl acetat (E) hòa tan lượng dung môi thích hợp, phối trộn đều với 150 g silicagel, đuổi dung môi tạo bột tơi rồi nạp lên cột sắc ký silicagel (60 cm × 3 cm). Rửa giải bằng hệ dung môi dichloromethan : methanol có độ phân cực tăng dần từ 20:1 đến 0:1, thu được 4 phân đoạn chính: E1 (6,6 g), E2 (7,2 g), E3 (13,8 g) và E4 (14,1 g).
    • Sắc ký cột phân đoạn E1 với pha động n-hexan : ethyl acetat (5:1, v/v), kiểm tra bản mỏng TLC, thu được 4 phân đoạn nhỏ (E1.1 đến E1.4). Từ phân đoạn này đã tinh chế được hợp chất tinh khiết ký hiệu là MN1.
    • Sắc ký cột phân đoạn E2 với hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (tỷ lệ 10:1, sau đó là 5:1, v/v), gom dịch rửa giải dựa trên kết quả TLC thu được 2 phân đoạn nhỏ (E2.1 và E2.2). Quá trình tinh chế từ phân đoạn này thu được hai hợp chất tinh khiết ký hiệu là MN2 và MN3.
  • Xác định cấu trúc hợp chất MN1 (Hexadecanoic acid / Palmitic acid):
    • Tính chất vật lý: Tinh thể màu trắng đến vàng, nhiệt độ nóng chảy 43–44°C.
    • Phổ ESI-MS: Cho pic ion phân tử tại m/z 257,0 [M+H]⁺ và m/z 255,0 [M-H]⁻, khối lượng phân tử M = 256 g/mol, công thức phân tử C16H32O2.
    • Phổ 13C-NMR và DEPT (125 MHz): Có 16 tín hiệu carbon, trong đó C-1 dịch chuyển xa nhất ở δC 179,7 ppm đặc trưng cho nhóm carboxyl (-COOH); tín hiệu δC 34,0 ppm (C-2) và 31,9 ppm (C-14); nhóm 5 carbon đối xứng C-7, C-8, C-9, C-10, C-11 cộng hưởng cùng tín hiệu cường độ cao tại δC 29,7 ppm; các methylen C-4, C-5, C-6, C-12, C-13 xuất hiện từ 29,1 đến 29,6 ppm; C-3 tại 24,7 ppm; C-15 tại 22,7 ppm và nhóm methyl tận cùng C-16 tại δC 14,1 ppm.
    • Phổ 1H-NMR (500 MHz): Tín hiệu δH 2,34 ppm (2H, t, J = 7,0 Hz, H-2); 1,63 ppm (2H, m, J = 7,5 Hz, H-3); dải đa mũi tích phân 24H tại δH 1,26 ppm (từ H-4 đến H-15); nhóm methyl tận cùng tại δH 0,88 ppm (3H, t, J = 7,0 Hz, H-16).
  • Xác định cấu trúc hợp chất MN2 ((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoic acid / Linoleic acid):
    • Tính chất vật lý: Chất lỏng sánh, không màu.
    • Phổ ESI-MS: Cho pic ion phân tử tại m/z 281,0 [M+H]⁺, tương ứng khối lượng phân tử M = 280 g/mol, công thức phân tử C18H32O2.
    • Phổ 13C-NMR và DEPT (125 MHz): Thể hiện 18 tín hiệu carbon gồm carbon carboxyl tại δC 179,6 ppm (C-1); 4 carbon olefinic methin chưa bão hòa tại δC 130,0 ppm (C-9), 128,1 ppm (C-10), 127,9 ppm (C-12), 130,2 ppm (C-13); carbon bis-allylic tại δC 25,6 ppm (C-11); 2 carbon allylic tại δC 27,2 ppm (C-8, C-14); methyl tận cùng tại δC 14,0 ppm (C-18); các carbon methylen khác cộng hưởng trong khoảng δC 22,6–34,0 ppm.
    • Phổ 1H-NMR (500 MHz): Tín hiệu 4 proton olefinic tại δH 5,31–5,40 ppm (4H, m, H-9, H-10, H-12, H-13); proton bis-allylic tại δH 2,77 ppm (2H, t, J = 7,0 Hz, H-11); 2 proton methylen α so với nhóm carboxyl tại δH 2,34 ppm (2H, t, H-2); 4 proton allylic tại δH 2,05 ppm (4H, m, H-8, H-14); nhóm methyl tận cùng tại δH 0,89 ppm (3H, t, H-18). Hằng số ghép xác định cấu hình (Z,Z) của hai nối đôi.
  • Xác định cấu trúc hợp chất MN3 ((Z)-octadec-9-enoic acid / Oleic acid):
    • Tính chất vật lý: Chất lỏng sánh, không màu.
    • Phổ ESI-MS: Pic ion phân tử tại m/z 283,0 [M+H]⁺ và m/z 281,0 [M-H]⁻, tương ứng M = 282 g/mol, công thức phân tử C18H34O2.
    • Phổ 13C-NMR và DEPT (125 MHz): Ghi nhận 18 tín hiệu carbon gồm C-1 tại δC 180,3 ppm (nhóm -COOH); 2 carbon olefinic chưa bão hòa tại δC 130,0 ppm (C-9) và 129,7 ppm (C-10); nhóm methyl tận cùng C-18 tại δC 14,1 ppm; các nhóm methylen trải dài từ δC 22,7 đến 34,1 ppm (trong đó C-2 tại 34,1 ppm, C-8 tại 31,9 ppm, C-11 tại 28,8 ppm).
    • Phổ 1H-NMR (500 MHz): Gồm tín hiệu δH 5,34 ppm (2H, m, H-9, H-10); 2,34 ppm (2H, t, H-2); 2,04 ppm (4H, m, H-8, H-11); dải đa mũi δH 1,26–1,37 ppm (22H, m, các nhóm methylen còn lại); tín hiệu ba mũi của nhóm methyl cuối mạch tại δH 0,89 ppm (3H, t, J = 7,0 Hz, H-18).

Bàn luận

Chương Bàn luận tập trung làm rõ giá trị sinh học và cơ chế tác dụng của 3 acid béo mạch dài vừa được phân lập thông qua việc so sánh đối chiếu với các công trình nghiên cứu đã xuất bản:

  • Cơ chế kháng khuẩn thông qua ức chế FabI: Ba acid béo đều có khả năng ức chế enzym khử protein vận chuyển enoyl-acyl (FabI) – một enzym mấu chốt trong con đường sinh tổng hợp acid béo của vi khuẩn. Văn bản cung cấp số liệu thực nghiệm của Zheng CJ và cộng sự (2005) chứng minh rằng mức độ bất bão hòa quyết định mạnh mẽ đến hoạt tính ức chế FabI: oleic acid (C18:1) và linoleic acid (C18:2) có hiệu lực cao hơn rõ rệt so với acid béo bão hòa palmitic acid (C16:0) trên các chủng vi khuẩn Gram (+).
Hợp chất acid béo IC50 (mM) trên S. aureus MIC (mM) trên S. aureus MIC (mM) trên Streptococcus pyogenes
Palmitic acid (C16:0) > 2 > 2 > 2
Oleic acid (C18:1) 0,020 0,4 0,1
Linoleic acid (C18:2) 0,035 0,2 0,05
  • Tác dụng hiệp đồng kháng khuẩn: Số liệu trích từ nghiên cứu của Dilika F. và cộng sự (2000) về dịch chiết Helichrysum pedunculatum cho thấy khi phối hợp đồng thời linoleic acid và oleic acid, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với Micrococcus kristinae và Staphylococcus aureus giảm từ 1,0 mg/mL (khi dùng đơn độc) xuống còn 0,05 mg/mL cho mỗi acid. Trên Bacillus subtilis và Bacillus cereus, linoleic acid đơn độc thể hiện MIC rất thấp (0,01 mg/mL).
  • Hoạt tính của từng hợp chất:
    • Palmitic acid (MN1): Là acid béo bão hòa chiếm 20–30% tổng lượng acid béo trong cơ thể người. Bên cạnh khả năng diệt vi khuẩn Gram (-) khoang miệng (A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis), palmitic acid ức chế nấm Candida tropicalis (MIC = 1 mg/mL, bắt đầu giảm tăng trưởng ở 0,5 mg/mL) thông qua cơ chế ức chế màng sinh học biofilm và tăng cường gốc tự do nội bào. Hoạt chất này cũng được chứng minh gây apoptosis ở tế bào ung thư vú, ức chế con đường PI3K/Akt ở ung thư tuyến tiền liệt và ức chế con đường tín hiệu STAT3 ở tế bào ung thư dạ dày.
    • Linoleic acid (MN2): Acid béo không bão hòa đa thiết yếu, có khả năng ức chế sinh trưởng và giảm biểu hiện các gen độc lực của Helicobacter pylori nhờ giảm stress nitro hóa. Ngoài ra, chất này thúc đẩy peroxid hóa lipid, gây độc tế bào và kích hoạt con đường chết theo chương trình ở các dòng tế bào ung thư đại trực tràng.
    • Oleic acid (MN3): Có nhiều trong dầu thực vật, đóng vai trò điều hòa tổng hợp và kích thích các enzym chống oxy hóa, làm tăng tiết oxit nitric (NO) nội mô giúp giãn mạch và hạ huyết áp; làm giảm quá trình oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL); giảm độc tính lipid (lipotoxicity) trên tế bào gan bằng cách giảm stress lưới nội chất và ức chế quá trình tự hủy pyroptosis.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu đề ra về mặt thực nghiệm chiết xuất, phân lập và định danh cấu trúc hóa học. Các kết quả định lượng cụ thể từ văn bản được tổng hợp trong hai bảng dưới đây:

Giai đoạn xử lý / Phân đoạn Khối lượng thu được (g) Tỷ lệ / Ghi chú
Dược liệu khô ban đầu 3.000 g (3,0 kg) Thu hái tại Thanh Sơn, Phú Thọ; sấy khô 80°C
Cao chiết tổng ethanol 70% 263,0 g Ngâm chiết kiệt 3 lần (12 L + 8 L + 8 L)
Cao tổng đưa vào chiết phân bố 200,0 g Phân tán trong 200 mL nước cất (1:1, m/v)
Cắn phân đoạn n-hexan (H) 36,8 g Chiết phân bố 3 lần × 900 mL n-hexan
Cắn phân đoạn ethyl acetat (E) 54,6 g Chiết phân bố 3 lần × 900 mL ethyl acetat
Cắn E nạp cột sắc ký 45,0 g Phối trộn cùng 150 g silicagel pha thường
Phân đoạn E1 6,6 g Rửa giải DCM : MeOH (phân lập được MN1)
Phân đoạn E2 7,2 g Rửa giải DCM : MeOH (phân lập được MN2, MN3)
Phân đoạn E3 13,8 g Rửa giải DCM : MeOH
Phân đoạn E4 14,1 g Rửa giải DCM : MeOH

Bảng tổng hợp đặc tính hóa lý và nhận dạng của 3 hợp chất phân lập:

Ký hiệu Tên hóa học / Danh pháp IUPAC Tên thông thường CTHH Khối lượng phân tử (M) Dữ liệu phổ nhận diện chính
MN1 Hexadecanoic acid Palmitic acid C16H32O2 256 g/mol Tinh thể trắng - vàng, t°nc = 43–44°C; ESI-MS: m/z 257 [M+H]⁺; δC 179,7 ppm (COOH); δH 0,88 ppm (CH3).
MN2 (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoic acid Linoleic acid C18H32O2 280 g/mol Chất lỏng sánh, không màu; ESI-MS: m/z 281 [M+H]⁺; 4 carbon olefinic δC 127,9–130,2 ppm; proton bis-allylic δH 2,77 ppm.
MN3 (Z)-octadec-9-enoic acid Oleic acid C18H34O2 282 g/mol Chất lỏng sánh, không màu; ESI-MS: m/z 283 [M+H]⁺; 2 carbon olefinic δC 129,7 và 130,0 ppm; proton C=C δH 5,34 ppm.

Đóng góp khoa học của đề tài:

  • Khóa luận làm phong phú thêm cơ sở dữ liệu hóa thực vật về loài Murdannia nudiflora thu hái tại Việt Nam. Sau công trình năm 2022 của Hà Thu Trà (phân lập được tricosanoic acid và 6-methoxy-1H-indol-3-methyl carboxylat), đây là công trình tiếp theo phân lập thành công ba acid béo mạch dài tinh khiết gồm palmitic acid, linoleic acid và oleic acid từ phân đoạn ethyl acetat của cây Rau trai.
  • Cung cấp quy trình chiết xuất phân đoạn và các thông số phân tách sắc ký cột chi tiết, có khả năng lặp lại thực nghiệm cao.
  • Xây dựng bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (1D-NMR) và phổ khối lượng (ESI-MS) hoàn chỉnh đối với các hợp chất acid béo tự nhiên chiết xuất từ loài này.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của nghiên cứu: Do giới hạn về mặt thời gian thực hiện của một khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, nghiên cứu mới chỉ tập trung phân lập và giải cấu trúc được 3 hợp chất acid béo mạch dài phổ biến từ hai phân đoạn nhỏ (E1, E2) của cắn ethyl acetat; hai phân đoạn có khối lượng lớn hơn là E3 (13,8 g) và E4 (14,1 g) chưa được tiến hành phân tách sâu hơn. Đồng thời, đề tài chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro hoặc in vivo trực tiếp trên các mẫu cao chiết và các hợp chất tinh khiết vừa phân lập được mà nội dung hoạt tính sinh học chủ yếu dựa trên tổng quan tài liệu bàn luận.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo (do tác giả đề xuất):
    1. Tiếp tục nghiên cứu sắc ký để chiết xuất và phân lập thêm các hợp chất hữu cơ khác từ phân đoạn ethyl acetat của cây Murdannia nudiflora (đặc biệt là phân đoạn E3 và E4).
    2. Thử nghiệm mở rộng chiết xuất từ các bộ phận khác của cây Rau trai (như quả, hạt, rễ) và tiến hành thăm dò hóa thực vật trên các phân đoạn dịch chiết khác (phân đoạn n-hexan, phân đoạn nước) nhằm tìm kiếm các hợp chất mới hoặc các thành phần có hoạt tính sinh học cao.
    3. Triển khai các thử nghiệm sinh học thực nghiệm (sàng lọc in vitro và in vivo) đối với các cao chiết phân đoạn và các chất đã phân lập, tập trung vào các tác dụng giảm đau, kháng khuẩn, chống nấm, chống oxy hóa và ức chế tế bào ung thư.

Giá trị tham khảo

Công trình khóa luận là tài liệu học thuật hữu ích cho:

  • Sinh viên ngành Dược học, Hóa học, Công nghệ sinh học và các học viên cao học chuyên ngành Dược liệu - Dược học cổ truyền, Hóa hợp chất thiên nhiên đang làm đề tài nghiên cứu chiết tách thực vật.
  • Các nhà nghiên cứu quan tâm đến chi Murdannia và các loài thuộc họ Thài lài (Commelinaceae) tại Việt Nam.

Những nội dung có giá trị tham khảo chuyên môn cao bao gồm:

  • Quy trình chiết phân bố lỏng - lỏng: Phương pháp xử lý cao chiết cồn, phân tán trong nước và chiết phân đoạn lặp lại với n-hexan và ethyl acetat đạt hiệu suất cắn cụ thể.
  • Điều kiện thực nghiệm sắc ký cột: Tỷ lệ chất mang (silicagel so với lượng cắn nạp cột đạt tỷ lệ xấp xỉ 3,3:1 về khối lượng), kích thước cột (60 cm × 3 cm) và hệ dung môi giải hấp phân đoạn (dichloromethan : methanol và n-hexan : ethyl acetat).
  • Bộ dữ liệu phổ thực nghiệm: Toàn bộ bảng số liệu phân tích độ chuyển dịch hóa học (chemical shift δ), hằng số ghép (J coupling constant), dạng vân phổ (triplet, multiplet) trên phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT so sánh đối chiếu với tài liệu quốc tế của 3 acid béo kinh điển.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu dược liệu cây Rau trai dùng trong nghiên cứu được thu thập ở đâu và định danh như thế nào?
Phần trên mặt đất của cây Rau trai mang đầy đủ thân, lá, hoa được thu hái tại thị trấn Thanh Sơn, huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ vào ngày 04/12/2021. Mẫu được giám định tên khoa học chính xác là Murdannia nudiflora (L.) Brenan tại Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội với Phiếu giám định số 21/2021-UMP.

2. Hiệu suất thu nhận cao tổng và cắn các phân đoạn từ 3,0 kg dược liệu ban đầu là bao nhiêu?
Từ 3,0 kg dược liệu khô, quá trình ngâm chiết kiệt với ethanol 70% thu được 263 g cao chiết tổng ethanol. Khi lấy 200 g cao tổng này đem chiết phân bố lỏng - lỏng, tác giả đã thu được 36,8 g cắn n-hexan (H) và 54,6 g cắn ethyl acetat (E).

3. Khóa luận đã phân lập và xác định được những hợp chất tinh khiết nào?
Từ 45 g cắn ethyl acetat qua hệ thống sắc ký cột silicagel, tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của 3 hợp chất acid béo mạch dài gồm: hợp chất MN1 là hexadecanoic acid (palmitic acid, C16H32O2), hợp chất MN2 là (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoic acid (linoleic acid, C18H32O2) và hợp chất MN3 là (Z)-octadec-9-enoic acid (oleic acid, C18H34O2).

4. Những kỹ thuật phổ và thiết bị nào được sử dụng để xác định cấu trúc các chất?
Tác giả đã kết hợp đo nhiệt độ nóng chảy (máy SMP10 BioCote), đo phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử ESI-MS (hệ thống Varian Agilent 1100 LC/MSD) để xác định phân tử khối, cùng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D-NMR (1H-NMR đo ở 500 MHz, 13C-NMR đo ở 125 MHz, phổ DEPT-90 và DEPT-135 MHz trên máy Bruker AVANCE AV 500).

5. Hoạt tính kháng khuẩn của oleic acid và linoleic acid được bàn luận dựa trên cơ chế và dữ liệu thực nghiệm nào?
Hai acid béo bất bão hòa này có khả năng ức chế mạnh mẽ enzym khử protein vận chuyển enoyl-acyl (FabI) ở vi khuẩn Gram (+) với IC50 trên Staphylococcus aureus lần lượt là 0,020 mM (oleic acid) và 0,035 mM (linoleic acid), vượt trội so với palmitic acid (> 2 mM). Ngoài ra, khi phối hợp linoleic acid và oleic acid, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên S. aureus và M. kristinae giảm hiệp đồng xuống mức 0,05 mg/mL cho mỗi acid.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thu Hà đã thực hiện thành công quy trình chiết xuất và phân lập hóa thực vật từ 3,0 kg phần trên mặt đất của cây Rau trai (Murdannia nudiflora (L.) Brenan) thu hái tại tỉnh Phú Thọ. Bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển trên cắn phân đoạn ethyl acetat kết hợp với các kỹ thuật phổ nghiệm ESI-MS và NMR (1H, 13C, DEPT), đề tài đã xác định chính xác cấu trúc của 3 acid béo mạch dài tinh khiết là palmitic acid, linoleic acid và oleic acid. Các kết quả thực nghiệm và tổng quan bàn luận về cơ chế dược lý trong công trình đã góp phần bổ sung dữ liệu khoa học tin cậy về thành phần hóa thực vật của loài cây này tại Việt Nam, làm tiền đề cho các hướng nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học và ứng dụng dược liệu trong tương lai.