MỞ ĐẦU Trong cơ thể, protein dimer đóng vai trò như một nhân tố điều hòa. Trên thực tế, các protein hầu như không hoạt động “một mình” khi thực hiện chức năng của chúng trong cơ thể (Yanagida, 2002), một nghiên cứu đã báo cáo rằng có hơn 80% protein hoạt động ở các dạng phức hợp (Berggard và cộng sự, 2007) dimer hoặc oligomer. Việc tự liên kết các protein monomer để tạo thành các thể dimer hoặc oligomer bậc cao là một hiện tượng rất phổ biến. Protein dimer đóng một vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như điều hòa enzyme, phiên mã, con đường truyền tín hiệu và thậm chí điều hòa con đường gây bệnh.
Các nghiên cứu về cấu trúc và sinh lý gần đây cho thấy sự dimer hoặc oligomer hóa protein là yếu tố chính trong việc điều hòa các protein như enzyme, kênh ion, thụ thể và các yếu tố phiên mã. Cụ thể như trong tế bào, enzyme pro-caspase-9 tồn tại ở dạng monomer không có hoạt tính, khi được dimer caspase-9 sẽ cắt và kích hoạt caspase 3/7, từ đó kích thích quá trình apoptosis và mang đến nhiều tiềm năng trong việc điều trị ung thư (Riedl và cộng sự, 2004), (Ledgerwood và cộng sự, 2009). Ngoài ra, sự dimer các thụ thể G-protein-coupled receptors (GPCR) trên bề mặt tế bào kích thích quá trình truyền dẫn tín hiệu nội bào dẫn đến tạo ra các phản ứng thích hợp cho tế bào,…( Renatus và cộng sự, 2001). Do đó, việc hình thành và kiểm soát dimer protein sẽ mang lại nhiều ứng dụng quan trọng trong tế bào.
Hiện nay, có nhiều nhiều công trình nghiên cứu tìm ra phương pháp tạo ra protein dimer, tuy nhiên mỗi phương pháp vẫn còn tồn tại một số hạn chế nhất định. Đầu tiên, phương pháp thiết kế protein (protein engineering) được áp dụng và mang lại những kết quả đáng chú ý nhưng sự dimer chỉ diễn ra theo một chiều, tức là chỉ hình thành mà không tách cấu trúc dimer ra được, dẫn đến việc cản trở quá trình điều hòa hoạt tính của protein. Sau đó, phương pháp sử dụng các phân tử từ bên ngoài để cảm ứng sự dimer protein ra đời đã giải quyết được những hạn chế của các phương pháp trước đây. Nhưng việc can thiệp vào cấu trúc tế bào bằng các phân tử lạ lại mang đến nhiều hạn chế, ví dụ như Rapamycin được sử dụng như một phân tử cảm ứng sự SVTH: Bùi Như Ngọc Khóa luận tốt nghiệp Trang 2 GVHD: Đặng Thanh Dũng dimer nhưng lại gây độc cho tế bào người và những nghiên cứu ứng dụng thì chưa được sử dụng rộng rãi.
Trong khi đó, G-quadruplex là những cấu trúc thứ cấp đặc biệt của DNA và RNA được đánh giá là đầy tiềm năng cho sự dimer protein vì cấu trúc này hình thành ngay trong tế bào cơ thể nên có độ an toàn cao. Sự hình thành G-quadruplex ở đầu telomer và vùng promoter đóng vai trò then chốt trong nhiều quá trình sinh học như kéo dài telomer, phiên mã, dịch mã và sao chép ( Tuấn Anh, 2010). Mặt khác, G- quadruplex có thể gắn đặc hiệu và dimer RHAU peptide và sự liên kết chặt chẽ của RHAU peptide với protein CFP VÀ YFP cho phép thiết kế xây dựng mô hình cảm ứng sự dimer phức hợp RHAU-CFP/RHAU-YFP bằng G-quadruplex (Lattmann và cộng sự, 2010). Trong thí nghiệm dimer protein, hai protein được quan tâm đến là CFP và YFP vì đây là 2 protein dễ biểu hiện, bền và đặc biệt là có sự chồng lấp giữa quang phổ phát ra của CFP (Cyan Fluorescent Protein) với quang phổ hấp thụ của YFP (Yellow Fluorescent Protein) nên dễ dàng quan sát sự hình thành thể dimer thông qua phương pháp FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer-Truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang).
Nhận thấy vai trò quan trọng của protein dimer trong cơ thể và sự cần thiết cho việc nghiên cứu ra phương pháp mới cho dimer protein, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH CHẾ PROTEIN RHAU53-CFP CHO CẢM ỨNG SỰ DIMER PROTEIN BẰNG CẤU TRÚC RNA G- QUADRUPLEX” với mục tiêu tạo ra một mô hình mới G-quadruplex-RHAU cho sự cảm ứng dimer hóa protein và tiến tới ứng dụng trên các protein chức năng trong tế bào. Đề tài thực hiện các nội dung như sau: − Tạo dòng vector pRHAU53-CFP. − Biểu hiện và tinh chế protein RHAU53-CFP bằng phương pháp sắc kí ái lực. − Cảm ứng tạo cấu trúc RNA G-quadruplex.
SVTH: Bùi Như Ngọc Khóa luận tốt nghiệp GVHD: Đặng Thanh Dũng PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU SVTH: Bùi Như Ngọc Khóa luận tốt nghiệp Trang 3 GVHD: Đặng Thanh Dũng 1. Dimer và vai trò của sự dimer hóa protein. Sự dimer protein: là quá trình hai protein liên kết với nhau để hình thành cấu trúc homodimer (dimer 2 protein giống nhau) hoặc heterodimer (dimer 2 protein khác nhau). Vai trò : Sự dimer protein đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như hoạt hóa enzyme, điều hòa phiên mã, dịch mã, và thậm chí là khả năng kháng bệnh cũng được điều hòa thông qua sự dimer protein.
Ví dụ như sự dimer enzyme Caspase-9 kích hoạt quá trình apoptosis, dimer thụ thể epidermal growth factor receptor (EGFR) dẫn đến sự tự phosphoryl hóa vùng tyrosine kinase, giúp EGFR kết hợp được với các phân tử tín hiệu ở giai đoạn sau của con đường tín hiệu (Oda và cộng sự, 2005). Ngoài ra, sự dimer protein có thể giúp giảm thiểu kích thước bộ gen nhưng vẫn duy trì các lợi ích của sự hình thành phức hợp protein-protein (Radford và cộng sự, 2010). Các phương pháp tạo protein dimer. Việc kiểm soát quá trình dimer hóa protein sẽ mang lại nhiều ứng dụng quan trọng như điều hòa các quá trình sinh học diễn ra trong tế bào và đáng chú ý gần đây SVTH: Bùi Như Ngọc Khóa luận tốt nghiệp Trang 4 GVHD: Đặng Thanh Dũng là ứng dụng trong liệu pháp tế bào.
Nhận thấy tiềm năng đó, nhiều công trình nghiên cứu tìm ra phương pháp tạo protein dimer đã được báo cáo. 2: Các phương pháp tạo protein dimer. Kĩ thuật protein Đây là một trong những phương pháp đầu tiên được ứng dụng để tạo ra protein dimer bằng cách thay đổi cấu trúc bề mặt của protein mục tiêu, phương pháp này tạo điều kiện làm tăng tính ổn định và chức năng của protein. ⮚ Gây đột biến bề mặt cấu trúc protein: Thí nghiệm tiến hành thay đổi một vài trình tự amino acid trên protein mục tiêu sẽ dẫn đến tiềm năng dimer của chúng.
Những thí nghiệm đầu tiên thiết kế tạo protein dimer được tiến hành trên enzyme caspase-9. Shi và các cộng sự tạo ra enzyme Caspase-9 có tiềm năng dimer nhờ thay thế 5 amino acid trong chuỗi β6 của Caspase- 9 (Gly402‐Cys‐Phe‐Asn‐Phe406) bằng các amino acid thường hiện diện trong Caspase- SVTH: Bùi Như Ngọc Khóa luận tốt nghiệp Trang 5 GVHD: Đặng Thanh Dũng 3 (Cys264‐Ile‐Val‐Ser‐Met268), dẫn đến bề mặt của protein Caspase-9 có thể hình thành dimer (hình 1. Những protein Capase-9 này đã có khả năng hình thành homodimer trong buffer dẫn đến làm tăng sự hoạt hóa enzyme in vitro, có ý nghĩa trong nghiên cứu tế bào (Y. Chao và cộng sự, 2005).
Bên cạnh những thành công đạt được, phương pháp này vẫn tồn tại nhiều hạn chế, đặc biệt là ở khía cạnh kiểm soát các sự kiện diễn ra trong quá trình dimer dẫn dến hoạt tính enzyme của caspase-9 được dimer thấp hơn so với caspase-9 được hoạt hóa bởi Apaf-1. Mặt khác, gây đột biến các vùng chức năng của protein mục tiêu có thể dẫn đến thay đổi cấu trúc và chức năng của chúng. 3: Cấu trúc protein caspase-9 sau khi đột biến có thể hình thành thể dimer (Y Chao và cộng sự, 2005). ⮚ Phương pháp “cấu trúc dây kéo”: Cấu trúc dây kéo hay còn gọi là coiled - coil zipper được hình thành từ hai cấu trúc xoắn ∝ ở dạng monomer, hai cấu trúc này liên kết với nhau bằng các tương tác kị nước giữa các vùng giàu leucine để hình thành thể homo – heterodimer (hình 1.
Phương pháp này dựa trên sự hình thành cấu trúc dây kéo giữa hai chuỗi polypeptide c-Jun và c-Fos, sau đó dung hợp cấu trúc này với protein mục tiêu dẫn đến tiềm năng dimer protein (hình 1. Tuy nhiên, phương pháp chỉ tạo dimer một SVTH: Bùi Như Ngọc Khóa luận tốt nghiệp Trang 6 GVHD: Đặng Thanh Dũng chiều và không có tác động ngược lại. Việc tác động trực tiếp lên cấu trúc protein có thể dẫn đến thay đổi trình tự amino acid, làm biến đổi cấu trúc chức năng protein mục tiêu, gây khó khăn cho việc tìm hiểu cơ chế cũng như kiểm soát quá trình dimer. 4: (A) cấu trúc c-Fos – c-Jun heterodimer.
Thiết kế protein dimer bằng các phân tử từ bên ngoài Hiện nay, phương pháp tác động hóa học thông qua các phân tử nhỏ từ bên ngoài đã được sử dụng đề kiểm soát sự dimer hóa protein (Fegan và cộng sự, 2010). Ưu điểm của phương này là có tác động dimer hai chiều, tạo điều kiện thuận lợi cho việc kiểm soát sự dimer. ⮚ Hệ thống chủ – khách (host- guest system): Gần đây, những thí nghiệm về việc sử dụng siêu phân tử để thiết kế tạo protein dimer đã được báo cáo. Cyclodextrin và cucurbit[8]uril là hai siêu phân tử tiêu biểu được nghiên cứu sử dụng cho việc chọn lọc và kiểm soát quy trình dimer của chúng trong cả in vitro và in vivo.
Hai phân tử này mang những đặc tính mong muốn để sử dụng trong các nghiên cứu sinh hóa như độ hòa tan trong nước, có khả năng liên kết với hệ thống chủ và ít độc. Urbach và cộng sự đã chứng minh sự dimer giữa hai phân tử tripeptide phenylalanine-glycine-glycine (FGG) khi cho chúng liên kết với cucurbit[8]uril để SVTH: Bùi Như Ngọc Khóa luận tốt nghiệp Trang 7 GVHD: Đặng Thanh Dũng tạo thành phức hợp cân bằng hóa học 1:2 với ái lực cao bằng liên kết chủ yếu các amin ở đầu N-terminal của chuỗi peptide với phân tử cucurbit[8]uril (hình 1. Việc sử dụng các siêu phân tử cung cấp phương pháp hữu hiệu và dễ dàng để thiết kế tạo protein dimer, hơn nữa phương pháp này có tác động ngược lại tạo điều kiện thuận lợi để thiết kế và kiểm soát quá trình dimer (Dang T. D, 2012), tuy nhiên thể dimer lại khó đưa vào trong tế bào.
⮚ Sử dụng các phân tử nhỏ: Đây là phương pháp sử dụng các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp mang phân tử gồm hai bán phần đồng chức năng, chúng có khả năng liên kết với hai protein hoặc hai miền protein và mang hai phân tử protein này lại gần nhau để tạo thành thể homo-dimer hoặc hetero-dimer (hình 1. Tuy nhiên do có nhiều nhược điểm nên phương pháp này vẫn chưa được ứng dụng rộng rãi. SVTH: Bùi Như Ngọc Khóa luận tốt nghiệp Trang 8 GVHD: Đặng Thanh Dũng Hình 1. 6: Thiết kế tạo dimer bằng các phân tử nhỏ.