Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư của phức hệ nano bạc tổng hợp từ dịch chiết lá của cây Chua méo (Embelia laeta (L.) Mez) thu thập tại khu bảo tồn thiên nhiên Thần Sa – Phượng Hoàng tỉnh Thái Nguyên

Luận văn tác dụng kháng ung thư của phức hệ nano bạc từ lá cây chua méo tại Thái Nguyên

• Tác giả: Nguyễn Thị Quỳnh
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Thị Thanh Hương
• Trường học: Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư của phức hệ nano bạc tổng hợp từ dịch chiết lá của cây Chua méo (Embelia laeta (L.) Mez) thu thập tại khu bảo tồn thiên nhiên Thần Sa – Phượng Hoàng tỉnh Thái Nguyên
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: Thái Nguyên

Tóm tắt

I. Tổng quan về phức hệ nano bạc từ cây chua méo Embelia laeta

Công nghệ tổng hợp xanh hạt nano kim loại đang phát triển mạnh mẽ. Phương pháp sử dụng dịch chiết thực vật thay thế hóa chất độc hại mang lại độ an toàn sinh học cao. Cây chua méo có tên khoa học là Embelia laeta thuộc họ Đơn nem Myrsinaceae. Loài thực vật này phân bố tự nhiên tại Khu bảo tồn thiên nhiên Thần Sa Phượng Hoàng tỉnh Thái Nguyên. Dịch chiết lá cây chua méo chứa nhiều hoạt chất sinh học giá trị như polyphenol, flavonoid và tannin. Các hợp chất này đóng vai trò chất khử và chất bao bọc tự nhiên trong quá trình tạo nano bạc. Phức hệ nano bạc sinh học sở hữu nhiều đặc tính vượt trội. Hạt có kích thước siêu nhỏ, diện tích bề mặt tiếp xúc lớn và độ ổn định cao. Nghiên cứu tập trung đánh giá cấu trúc hạt và tiềm năng tiêu diệt tế bào ung thư. Đề tài mở ra hướng phát triển vật liệu y sinh mới từ nguồn tài nguyên bản địa Thái Nguyên. Ứng dụng này giúp nâng cao giá trị dược liệu của cây chua méo trong hỗ trợ điều trị bệnh học hiện đại.

1.1. Nguồn gốc cây chua méo tại Thần Sa Phượng Hoàng

Khu bảo tồn thiên nhiên Thần Sa Phượng Hoàng có địa hình núi đá vôi đặc trưng. Thảm thực vật tại đây rất phong phú và có tính đa dạng sinh học cao. Cây chua méo sinh trưởng tự nhiên dưới tán rừng và sườn núi ẩm Thái Nguyên. Lá chua méo được thu hái đúng mùa vụ nhằm giữ nguyên vẹn hàm lượng dược chất. Quá trình xử lý sơ bộ gồm rửa sạch, phơi sấy khô và nghiền mịn. Bột lá được chiết xuất bằng nước cất để thu dung dịch hoạt chất tự nhiên. Dịch chiết này đóng vai trò là tiền chất sinh học quan trọng. Nguồn dịch chiết bảo đảm tính thân thiện môi trường cho toàn bộ quy trình.

1.2. Cơ chế tổng hợp xanh phức hệ nano bạc sinh học

Quá trình tổng hợp xanh diễn ra thông qua phản ứng oxi hóa khử thân thiện môi trường. Dung dịch muối bạc nitrat AgNO3 tiếp xúc trực tiếp với dịch chiết lá chua méo. Các phân tử hữu cơ như flavonoid khử ion bạc Ag+ thành hạt nano bạc Ag0. Sự thay đổi màu sắc từ vàng nhạt sang nâu sẫm phản ánh quá trình khử thành công. Các hợp chất hữu cơ đồng thời bao bọc bề mặt hạt nano mới tạo thành. Lớp vỏ bọc này ngăn chặn hiện tượng kết tụ hạt và tăng độ phân tán trong dung dịch. Phức hệ thu được có cấu trúc ổn định và duy trì hoạt tính sinh học kéo dài. Quy trình không cần sử dụng phụ gia tổng hợp hay dung môi độc hại.

II. Khó khăn trong điều trị ung thư và hạn chế của nano bạc

Bệnh ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn cầu. Các phương pháp điều trị truyền thống như hóa trị và xạ trị bộc lộ nhiều hạn chế nghiêm trọng. Thuốc hóa trị thường tiêu diệt tế bào ác tính lẫn tế bào lành. Bệnh nhân dễ gặp tác dụng phụ nặng nề như suy tủy, rụng tóc và suy kiệt miễn dịch. Hiện tượng kháng thuốc của tế bào ung thư cũng gia tăng nhanh chóng. Việc tìm kiếm các tác nhân tiêu diệt khối u có nguồn gốc tự nhiên là cấp thiết. Hạt nano bạc hóa học thông thường chứa nhiều tạp chất độc hại từ chất khử tổng hợp. Dư lượng hóa chất gây độc tế bào gan và thận khi đi vào cơ thể. Phức hệ nano bạc tổng hợp sinh học từ cây chua méo giải quyết triệt để rào cản này. Dịch chiết thảo mộc cung cấp lớp bảo vệ tự nhiên, giảm độc tính trên tế bào thường. Nghiên cứu phân tích độc tính tế bào cho thấy hạt nano xanh an toàn hơn đáng kể. Vật liệu nano thảo mộc tạo bước đột phá trong nghiên cứu y dược học hiện nay.

2.1. Độc tính của phương pháp tổng hợp nano hóa học

Phương pháp hóa học truyền thống thường sử dụng NaBH4 hoặc hydrazine để khử ion bạc. Các hóa chất này có độ độc cao và khó loại bỏ triệt để sau phản ứng. Dư lượng hóa chất bám trên bề mặt nano gây kích ứng các mô sống của cơ thể. Sự tích tụ lâu dài dẫn đến hoại tử tế bào lành và tổn thương gan thận nghiêm trọng. Quy trình sản xuất hóa học còn tạo ra chất thải nguy hại cho môi trường sống xung quanh. Chi phí xử lý chất thải độc hại làm tăng chi phí sản xuất dược phẩm y tế. Việc chuyển sang phương pháp xanh từ dịch chiết cây chua méo là giải pháp cấp bách.

2.2. Sự đề kháng thuốc của tế bào ung thư hiện nay

Tế bào ung thư liên tục biến đổi gen để thích nghi với các loại thuốc hóa trị. Quá trình đề kháng thuốc khiến hiệu quả điều trị khối u suy giảm nghiêm trọng. Khối u thường tăng cường hoạt động bơm tống thuốc ra ngoài màng tế bào ung thư. Hiện tượng này đòi hỏi tăng liều điều trị, làm gia tăng độc tính cho toàn thân bệnh nhân. Hạt nano bạc sinh học sở hữu cơ chế tác động đa điểm lên cấu trúc tế bào đích. Hạt nano có thể xuyên qua màng sinh học và phá vỡ cấu trúc ty thể dễ dàng. Cơ chế này giúp vô hiệu hóa khả năng tự bảo vệ của các dòng tế bào ung thư kháng thuốc.

III. Đánh giá tác dụng kháng ung thư của phức hệ nano bạc xanh

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư gan HepG2 trong môi trường RPMI 1640. Điều kiện nuôi cấy được duy trì ở 37 độ C, độ ẩm 95% và 5% khí CO2. Tế bào được cấy vào đĩa 96 giếng với mật độ 7000 tế bào trên mỗi giếng. Sau 48 giờ ổn định, tế bào được xử lý bằng nano bạc ở các nồng độ từ 0 đến 10 microgam/ml. Phương pháp phân tích MTT được sử dụng để xác định tỷ lệ tế bào sống sót chuẩn xác. Thuốc thử MTT chuyển hóa thành tinh thể formazan màu tím nhờ enzym dehydrogenase trong ty thể tế bào sống. Dung môi DMSO hòa tan hoàn toàn tinh thể formazan để đo mật độ quang ở bước sóng 570 nm. Kết quả quang phổ kế phản ánh chính xác khả năng ức chế tăng sinh của phức hệ nano bạc. Tỷ lệ sống của dòng tế bào ung thư suy giảm tỷ lệ thuận với nồng độ hạt nano bạc bổ sung. Hạt nano bạc từ cây chua méo thể hiện tiềm năng gây độc chọn lọc trên tế bào ác tính.

3.1. Phương pháp thử nghiệm MTT trên dòng tế bào HepG2

Quy trình thử nghiệm MTT diễn ra trong môi trường vô trùng nghiêm ngặt. Tế bào HepG2 phát triển ổn định được tiếp xúc với dung dịch nano bạc trong 24 giờ. Hóa chất MTT nồng độ 0,5 mg/ml được ủ cùng tế bào trong 4 giờ liên tục. Tinh thể formazan hình thành phản ánh số lượng tế bào còn sống và có hoạt tính trao đổi chất. Sau khi loại bỏ môi trường nuôi cấy, hỗn hợp DMSO và dung dịch đệm kiềm được thêm vào từng giếng. Máy quang phổ SPECTROstar Nano đo mật độ quang học ở bước sóng chuẩn 570 nm. Giá trị quang phổ thu được cho phép tính toán tỷ lệ phần trăm tế bào sống so với đối chứng. Thử nghiệm lặp lại nhiều lần đảm bảo tính chính xác và độ lặp lại của kết quả nghiên cứu.

3.2. Cơ chế kích hoạt quá trình tự chết tế bào apoptosis

Phức hệ nano bạc xâm nhập tế bào qua cơ chế ẩm bào và khuếch tán thụ động. Hạt nano giải phóng các ion bạc tự do và kích thích sản sinh các gốc oxy hóa tự do ROS. Nồng độ ROS tăng cao gây tổn thương màng ty thể và giải phóng cytochrome c. Hiện tượng này kích hoạt chuỗi enzym caspase dẫn đến phân mảnh DNA và teo nhân tế bào. Tế bào ung thư mất khả năng bám dính, co cụm và tự tiêu hủy theo chương trình apoptosis. Sự phá hủy này diễn ra nhanh chóng mà không gây viêm nhiễm lan rộng sang mô lân cận. Đây là cơ chế kháng ung thư then chốt của vật liệu nano bạc sinh học tổng hợp từ thảo mộc.

IV. Kết luận và triển vọng ứng dụng phức hệ nano bạc trong y học

Nghiên cứu khẳng định tiềm năng to lớn của phức hệ nano bạc tổng hợp từ cây chua méo. Quá trình tổng hợp xanh tận dụng hiệu quả nguồn dược liệu tự nhiên tại Thái Nguyên. Sản phẩm nano bạc thu được có kích thước đồng đều và độ phân tán ổn định cao. Kết quả thực nghiệm chứng minh hiệu quả ức chế mạnh mẽ dòng tế bào ung thư gan HepG2. Khả năng gây độc chọn lọc mở ra triển vọng bào chế thuốc điều trị ung thư thế hệ mới. Vật liệu nano thảo mộc giúp giảm thiểu tác dụng phụ so với các phác đồ hóa trị thông thường. Nguồn nguyên liệu từ cây chua méo dồi dào, thân thiện với môi trường và có chi phí thấp. Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho các thử nghiệm tiền lâm sàng tiếp theo. Ứng dụng công nghệ nano sinh học nâng cao giá trị nguồn tài nguyên thực vật bản địa Việt Nam. Hướng đi này đóng góp thiết thực vào nền y học hiện đại và bảo tồn đa dạng sinh học.

4.1. Tiềm năng ứng dụng trong bào chế dược phẩm y sinh

Phức hệ nano bạc từ lá cây chua méo có thể phát triển thành hệ dẫn thuốc kháng ung thư. Kích thước nano siêu nhỏ cho phép hạt thâm nhập sâu vào các khối u rắn nguy hiểm. Lớp vỏ hữu cơ sinh học giúp kéo dài thời gian lưu hành trong tuần hoàn máu của hạt. Vật liệu này có thể kết hợp với các kháng thể để hướng đích chính xác tế bào bệnh. Khả năng kháng khuẩn phổ rộng còn hỗ trợ ngăn ngừa nhiễm trùng cơ hội ở bệnh nhân ung thư. Sự kết hợp giữa nano bạc và hoạt chất tự nhiên tối ưu hóa hiệu quả điều trị lâm sàng. Sản phẩm hứa hẹn mang lại giải pháp hỗ trợ điều trị an toàn và tiết kiệm chi phí.

4.2. Định hướng khai thác và bảo tồn cây chua méo

Việc khai thác cây chua méo cần gắn liền với chiến lược bảo tồn đa dạng sinh học. Khu bảo tồn thiên nhiên Thần Sa Phượng Hoàng cần quy hoạch vùng phát triển dược liệu bền vững. Cơ quan chuyên môn cần nghiên cứu phương pháp nhân giống vô tính và gieo ươm quy mô lớn. Việc kiểm soát chất lượng thu hái giúp duy trì ổn định hàm lượng hợp chất có hoạt tính sinh học. Quy trình sản xuất xanh cần được chuẩn hóa để chuyển giao công nghệ cho doanh nghiệp dược phẩm. Hướng đi này vừa bảo tồn nguồn gen quý vừa phát triển kinh tế sinh thái địa phương bền vững.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Theo báo cáo toàn cầu của Tổ chức Y tế Thế giới và Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế, ung thư tiếp tục là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn cầu với dự báo đạt 28,4 triệu ca mắc mới vào năm 2040, tăng 47% so với năm 2020. Tại Việt Nam, thống kê của Globocan năm 2020 ghi nhận 182.563 ca mắc mới và 122.690 ca tử vong do ung thư, trong đó ung thư gan chiếm tỷ lệ cao nhất với 26.555 ca mắc mới (chiếm 14,5%) và tỷ lệ tử vong đứng đầu ở cả hai giới. Các phác đồ điều trị truyền thống như phẫu thuật, xạ trị và hóa trị thường gặp nhiều rào cản nghiêm trọng về độc tính toàn thân, thiếu tính chọn lọc mô đích và hiện tượng đa kháng thuốc của tế bào ung thư.

Trước thách thức trên, hướng tiếp cận công nghệ nano sinh học xanh (Green Nanotechnology) nổi lên như một giải pháp đột phá. Luận văn tập trung vào mục tiêu tổng hợp thành công phức hệ hạt nano bạc sử dụng dịch chiết nước từ lá cây Chua méo (Embelia laeta (L.) Mez) và đánh giá tác dụng kháng ung thư trên dòng tế bào ung thư biểu mô gan người HepG2 trong mô hình nuôi cấy in vitro.

Nghiên cứu được triển khai từ tháng 7/2023 đến tháng 6/2024 tại Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, với nguồn nguyên liệu lá cây Chua méo thu thập tại Khu Bảo tồn Thiên nhiên Thần Sa – Phượng Hoàng (huyện Võ Nhai, tỉnh Thái Nguyên), nơi có diện tích 11.280 ha và sở hữu 608 loài cây thuốc quý. Đề tài mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc, góp phần nâng cao giá trị dược liệu của nguồn thực vật bản địa, đồng thời cung cấp dữ liệu thực nghiệm quan trọng về hiệu suất ức chế tế bào ung thư gan với tỷ lệ tiêu diệt tế bào đạt trên 75% ở nồng độ khảo sát tối ưu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng của hai khung lý thuyết khoa học cốt lõi:

Thứ nhất là lý thuyết tổng hợp xanh vật liệu nano kim loại. Phương pháp này dựa trên quá trình khử ion bạc $Ag^+$ từ muối bạc nitrat ($AgNO_3$) thành bạc nguyên tử $Ag^0$ nhờ các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học trong dịch chiết thực vật. Hoạt chất chính trong chi Embelia là embelin (2,5-dihydroxy-3-undecyl-1,4-benzoquinone), cùng với các nhóm polyphenol và flavonoid, đóng vai trò kép: vừa là chất khử tự nhiên, vừa là chất bao phủ bề mặt (capping agent) giúp kiểm soát kích thước hạt, ngăn chặn hiện tượng kết tụ và tăng tính tương thích sinh học.

Thứ hai là lý thuyết về cơ chế gây độc tế bào và kích hoạt apoptosis (chết tế bào theo chương trình). Khi thâm nhập vào tế bào ung thư qua cơ chế nội bào, phức hệ nano bạc kích thích sản sinh các gốc oxy hóa phản ứng (ROS), gây tổn thương cấu trúc DNA, làm suy giảm điện thế màng ty thể và giải phóng cytochrome C. Quá trình này ức chế các con đường truyền tín hiệu sinh tồn như NF-κB, PI3K/AKT và STAT3, đồng thời vô hiệu hóa protein kháng apoptosis XIAP nhờ cấu trúc đặc thù của embelin, kích hoạt trực tiếp dòng thác enzyme caspase-9 và caspase-3.

Nghiên cứu vận dụng 4 khái niệm then chốt: Phức hệ nano bạc sinh học (AgNPs-EbL), hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR), nồng độ ức chế 50% sự tăng sinh tế bào (IC50), và chỉ số đa phân tán (PDI) của hạt nano.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng 10 g mẫu lá tươi cây Chua méo được thu hái ngẫu nhiên tại Khu Bảo tồn Thiên nhiên Thần Sa – Phượng Hoàng. Mẫu được định danh hình thái dựa trên các tài liệu thực vật học chuẩn quốc gia, rửa sạch qua 3 lần nước khử ion và 3 lần nước cất, sau đó đun sôi cùng 100 ml nước khử ion ở 100°C trong 10 phút để thu dịch chiết toàn phần.

Quy trình tổng hợp xanh nano bạc được tiến hành bằng cách phối trộn 10 ml dịch chiết lá cây với 90 ml dung dịch $AgNO_3$ nồng độ 10 mM (tỷ lệ 1:9), khuấy từ liên tục ở vận tốc 600 vòng/phút tại hai mốc nhiệt độ 60°C và 100°C trong thời gian 10 phút.

Các đặc tính lý hóa của phức hệ AgNPs-EbL được xác định qua hệ thống thiết bị chuyên sâu: máy quang phổ UV-Vis Jasco V770 ghi phổ hấp thụ trong dải bước sóng từ 250 nm đến 1.000 nm; máy đo nhiễu xạ tia X Bruker AXS D2 PHASER quét cấu trúc tinh thể trong góc $2\theta$ từ 10° đến 80°; máy quang phổ hồng ngoại FTIR Perkin Elmer phân tích nhóm chức trong dải 500 – 4.000 cm⁻¹; kính hiển vi điện tử quét SEM S4800 (Hitachi) và kính hiển vi điện tử truyền qua TEM xác định hình thái và phân bố kích thước hạt.

Đánh giá hoạt tính sinh học được thực hiện trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 do Viện Y học Quốc gia Pháp cung cấp. Tế bào được nuôi trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% huyết thanh bò và 1% kháng sinh ở điều kiện 37°C, 5% $CO_2$. Thử nghiệm độc tính tế bào sử dụng đĩa 96 giếng với cỡ mẫu chuẩn 7x10³ tế bào/giếng. Tế bào được xử lý với AgNPs-EbL ở dải nồng độ từ 0 đến 10 µg/ml trong 24 giờ. Tỷ lệ tế bào sống được định lượng qua phản ứng khử muối MTT ở bước sóng 570 nm. Sự biến đổi hình thái nhân được quan sát qua nhuộm huỳnh quang DAPI trên kính hiển vi Nikon Eclipse Ti2-U, và tỷ lệ apoptosis được định lượng chính xác bằng hệ thống Flow cytometry BD Accuri C6 Plus. Các phương pháp phân tích MTT và Flow cytometry được lựa chọn vì tính khách quan cao, độ lặp lại chuẩn xác và khả năng phân biệt rõ ràng giữa tế bào sống, tế bào chết hoại tử và tế bào đi vào chu trình apoptosis.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận 4 phát hiện quan trọng có giá trị khoa học cao:

Thứ nhất, phản ứng khử ion bạc diễn ra nhanh chóng, dung dịch chuyển từ màu vàng nhạt sang màu nâu sẫm chỉ sau 10 phút phản ứng ở nhiệt độ 100°C. Phổ hấp thụ UV-Vis xuất hiện đỉnh cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) rõ nét tại dải bước sóng 430 – 440 nm, khẳng định sự hình thành của các hạt nano bạc kim loại với độ tinh sạch cao.

Thứ hai, kết quả phân tích ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và quét (SEM) cho thấy các hạt nano AgNPs-EbL có dạng hình cầu đồng nhất, phân tán tốt, không bị kết cụm, với kích thước hạt trung bình dao động từ 10 nm đến 30 nm. Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) xuất hiện 4 đỉnh nhiễu xạ đặc trưng cho mạng tinh thể lập phương tâm diện của bạc. Phổ FTIR xác nhận sự hiện diện của các liên kết chức hydroxyl (-OH) và carbonyl (C=O) từ hoạt chất embelin đóng vai trò màng bọc sinh học ổn định.

Thứ ba, thử nghiệm MTT trên dòng tế bào HepG2 chứng minh phức hệ AgNPs-EbL có khả năng ức chế tăng sinh tế bào phụ thuộc chặt chẽ vào nồng độ. Tại nồng độ 10 µg/ml sau 24 giờ xử lý, tỷ lệ ức chế tế bào ung thư gan đạt trên 75% so với nhóm đối chứng không xử lý, làm giảm mật độ tế bào nuôi cấy rõ rệt và làm thay đổi kiểu hình từ dạng thoi bám dính sang dạng tròn co cụm, bong tróc khỏi đáy đĩa.

Thứ tư, kết quả nhuộm huỳnh quang DAPI và phân tích Flow cytometry chứng minh phức hệ kích hoạt mạnh mẽ con đường apoptosis. Tỷ lệ tế bào ung thư gan đi vào quá trình chết theo chương trình ở các nhóm xử lý nano bạc tăng hơn 50% so với nhóm đối chứng, đi kèm hiện tượng cô đặc chất nhiễm sắc và phân mảnh nhân điển hình.

Thảo luận kết quả

Khả năng ức chế tế bào ung thư gan vượt trội của AgNPs-EbL bắt nguồn từ tác động hiệp đồng giữa kích thước nano siêu nhỏ (10 – 30 nm) và hoạt tính sinh học của embelin. Kích thước hạt nhỏ giúp phức hệ dễ dàng thâm nhập vào nội bào, giải phóng ion bạc gây stress oxy hóa nội sinh, kết hợp cùng hoạt tính ức chế protein XIAP của embelin để mở khóa con đường apoptosis nội bào thông qua ty thể.

Khi so sánh với các nghiên cứu tổng hợp nano bạc từ các loài thực vật khác như Azadirachta indica (kích thước hạt 2 – 18 nm, IC50 từ 4,25 µg/ml đến 40 µg/ml) hay Blumea lacera (kích thước 12,52 nm, IC50 đạt 20 µg/ml), phức hệ AgNPs-EbL từ cây Chua méo thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư tương đương và có ưu thế về tốc độ tổng hợp cũng như độ đồng đều của cấu trúc hạt.

Về phương thức biểu diễn dữ liệu thực nghiệm, toàn bộ động học phản ứng được mô tả chi tiết thông qua biểu đồ đường cong phổ hấp thụ quang phổ UV-Vis theo nhiệt độ và thời gian; hiệu quả ức chế tế bào được trực quan hóa qua biểu đồ cột thể hiện tỷ lệ % tế bào sống sót tương ứng với các thang nồng độ 0, 2, 4, 6, 8, 10 µg/ml; cấu trúc pha tinh thể được minh họa qua đồ thị nhiễu xạ XRD theo góc quét $2\theta$; và sự chuyển dịch quần thể tế bào apoptosis được thể hiện rõ nét qua biểu đồ chấm phân tán hai chiều từ hệ thống Flow cytometry.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm phát triển kết quả nghiên cứu thành các sản phẩm ứng dụng thực tiễn, luận văn đưa ra 4 khuyến nghị then chốt:

1. Triển khai thử nghiệm tiền lâm sàng in vivo: Đề nghị nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Thái Nguyên phối hợp với các viện ung bướu tiến hành đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và khả năng ức chế khối u trên mô hình chuột mang khối u dị ghép HepG2, hướng đến mục tiêu giảm thể tích khối u trên 60% trong khung thời gian 12 – 18 tháng (giai đoạn 2024 – 2025).
2. Chuẩn hóa quy trình công nghệ tổng hợp xanh: Đề xuất Khoa Công nghệ Sinh học và Khoa Hóa học thuộc Trường Đại học Khoa học tiếp tục tối ưu hóa các thông số kỹ thuật như pH, nồng độ tiền chất và phát triển kỹ thuật sấy thăng hoa nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi sản phẩm phức hệ đạt trên 85% trong vòng 6 tháng tới.
3. Nghiên cứu sâu cơ chế phân tử ở mức độ phiên mã và dịch mã: Kiến nghị thực hiện định lượng biểu hiện các gen điều hòa apoptosis (Bax, Bcl-2, Caspase-3, Caspase-9, Survivin) bằng kỹ thuật Real-time PCR và Western Blot trong thời gian 9 tháng để làm sáng tỏ toàn diện các con đường truyền tín hiệu nội bào.
4. Xây dựng vùng nguyên liệu và bảo tồn nguồn gen: Đề nghị Ban quản lý Khu Bảo tồn Thiên nhiên Thần Sa – Phượng Hoàng phối hợp cùng Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Thái Nguyên triển khai dự án bảo tồn, nhân giống vô tính cây Chua méo trên diện tích 10 ha trong giai đoạn 2024 – 2026 nhằm bảo đảm nguồn dược liệu ổn định, phục vụ cho các nghiên cứu y dược học tiếp theo.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả nghiên cứu của luận văn mang lại giá trị thiết thực cho 4 nhóm đối tượng:

1. Các nhà khoa học, giảng viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học và Hóa dược: Tài liệu cung cấp quy trình thực nghiệm chuẩn mực về tổng hợp xanh hạt nano kim loại, cách thức tối ưu hóa phản ứng và phương pháp phân tích hóa lý toàn diện phục vụ cho công tác giảng dạy và nghiên cứu chuyên sâu.
2. Học viên cao học và sinh viên các ngành Khoa học Sự sống: Luận văn là tài liệu tham khảo giá trị về thiết kế nghiên cứu đánh giá độc tính tế bào in vitro, bao gồm kỹ thuật nuôi cấy tế bào ung thư gan HepG2, thử nghiệm MTT, nhuộm huỳnh quang DAPI và phân tích dòng chảy tế bào Flow cytometry.
3. Các doanh nghiệp dược phẩm và đơn vị phát triển công nghệ nano: Nguồn thông tin hữu ích để tiếp cận công nghệ sản xuất nano thảo dược thân thiện với môi trường, làm cơ sở nghiên cứu phát triển các dòng sản phẩm hỗ trợ điều trị ung thư với chi phí sản xuất thấp và độ an toàn sinh học cao.
4. Cơ quan quản lý lâm nghiệp và bảo tồn đa dạng sinh học: Dữ liệu thực chứng giúp các nhà quản lý nhận diện giá trị y học của loài Embelia laeta, từ đó xây dựng kế hoạch bảo vệ, nhân giống và khai thác bền vững tài nguyên cây thuốc tại các khu rừng đặc dụng.

Câu hỏi thường gặp

Phức hệ nano bạc tổng hợp xanh có ưu điểm gì vượt trội so với nano bạc tổng hợp hóa học? Phương pháp tổng hợp xanh sử dụng dịch chiết lá cây Chua méo hoàn toàn không dùng các hóa chất khử độc hại như $NaBH_4$ hay dung môi hữu cơ phức tạp. Hạt nano tạo ra được bao bọc tự nhiên bởi embelin và polyphenol, giúp tăng độ bền tán xạ, giảm độc tính với tế bào lành và gia tăng tính tương thích sinh học trong ứng dụng y học.

Thành phần hóa học nào trong lá cây Chua méo đóng vai trò then chốt trong quá trình tạo nano? Hoạt chất embelin (2,5-dihydroxy-3-undecyl-1,4-benzoquinone) cùng các nhóm flavonoid và hợp chất phenolic trong dịch chiết lá đóng vai trò là chất khử chính, chuyển đổi ion $Ag^+$ thành $Ag^0$. Đồng thời, các nhóm chức này tạo liên kết phối trí trên bề mặt hạt bạc, đóng vai trò chất bao phủ chống kết tụ hiệu quả.

Vì sao nghiên cứu lại chọn dòng tế bào ung thư biểu mô gan HepG2 để thử nghiệm? Ung thư gan là căn bệnh có tỷ lệ mắc mới và tử vong hàng đầu tại Việt Nam với hơn 26.000 ca mỗi năm theo dữ liệu Globocan. Tế bào HepG2 là mô hình chuẩn quốc tế có tính ổn định di truyền cao, phản ánh chính xác các đặc tính chuyển hóa và đáp ứng apoptosis đối với các hợp chất nano chống ung thư mới.

Bằng chứng thực nghiệm nào khẳng định tế bào HepG2 chết theo con đường apoptosis? Nghiên cứu ghi nhận hai bằng chứng rõ rệt: hình ảnh nhuộm huỳnh quang DAPI cho thấy sự cô đặc chất nhiễm sắc và phân mảnh nhân tế bào đặc trưng; đồng thời kỹ thuật Flow cytometry định lượng được sự gia tăng tỷ lệ tế bào apoptosis đạt trên 50% ở các nồng độ xử lý nano bạc so với đối chứng âm.

Kích thước hạt nano từ 10 nm đến 30 nm mang lại lợi ích gì cho điều trị ung thư? Kích thước hạt từ 10 nm đến 30 nm giúp phức hệ nano bạc dễ dàng đi qua các khoảng gian bào lỏng lẻo của mạch máu khối u (hiệu ứng EPR), tăng cường tích tụ chọn lọc tại mô bệnh và dễ dàng được tế bào ung thư dung nạp qua cơ chế nội bào, từ đó phát huy tối đa dược tính tiêu diệt khối u.

Kết luận

• Luận văn đã tổng hợp thành công phức hệ nano bạc sinh học AgNPs-EbL từ dịch chiết lá cây Chua méo (Embelia laeta) với kích thước hạt đồng đều từ 10 nm đến 30 nm và cấu trúc lập phương tâm diện ổn định.
• Hoạt chất embelin trong lá cây đóng vai trò kép vừa là chất khử vừa là chất bao phủ bề mặt, tạo nên phức hệ nano có độ bền cao và thân thiện với môi trường.
• Phức hệ AgNPs-EbL thể hiện hoạt tính ức chế tăng sinh mạnh mẽ trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 với tỷ lệ ức chế đạt trên 75% ở nồng độ 10 µg/ml sau 24 giờ.
• Cơ chế kháng ung thư được chứng minh diễn ra thông qua việc kích hoạt chu trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis), gây phân mảnh nhân và ngưng tụ chất nhiễm sắc.
• Nghiên cứu khẳng định giá trị dược liệu quý giá của hệ thực vật tại Khu Bảo tồn Thiên nhiên Thần Sa – Phượng Hoàng, mở ra triển vọng to lớn cho việc phát triển các liệu pháp nano thảo dược trị liệu ung thư tại Việt Nam.

Giai đoạn nghiên cứu tiếp theo cần tập trung mở rộng thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật trong giai đoạn 2024 – 2025 và giải mã chi tiết các con đường truyền tín hiệu phân tử. Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp y dược được khuyến khích đẩy mạnh hợp tác chuyển giao công nghệ để sớm ứng dụng phức hệ AgNPs-EbL vào thực tiễn hỗ trợ điều trị lâm sàng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới, có ảnh hưởng nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng. Ung thư toàn cầu dự kiến sẽ là 28,4 triệu ca mắc bệnh vào năm 2040, tăng 47% so với năm 2020. Theo thống kê của Globocan năm 2020, Việt Nam ước tính số ca mắc mới là 182.563 người với 98.916 số ca mắc là nam giới và nữ giới là 83.647 ca, số ca tử vong do ung thư là 122.690, số ca mắc bệnh phổ biến trong vòng 5 năm là 353. Nghiên cứu và phát triển các loại thuốc chống ung thư hiện nay đang được quan tâm đặc biệt ở nhiều quốc gia trên thế giới.

Nhiều loại thuốc chống ung thư được tổng hợp và chiết xuất từ nguyên liệu thực vật đã tiến hành thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư khác nhau. Việc nghiên cứu đánh giá và sử dụng các loài thực vật có tiềm năng để phát triển thành thuốc chống ung thư đang được một số quốc gia giàu tài nguyên thực vật đặc biệt chú trọng, trong đó có Việt Nam. Thực vật dược được đánh giá là một nguồn cung cấp các hoạt chất điều trị ung thư rất an toàn, không độc hại và dễ thu hái. Cây Chua méo có tên khoa học Embelia laeta (L.) Mez phân bố ở các nước Trung Quốc, Thái Lan, Campuchia, Lào, XriLanka và Việt Nam, thuộc chi Embelia, họ Đơn nem (Myrsinacaea).

Theo y học bản địa của người dân tộc Yao ở Trung Quốc, rễ của cây Embelia laeta (L.) Mez có tác dụng chống viêm được dùng để điều trị các bệnh như viêm loét miệng, đau họng, viêm ruột và viêm khớp dạng thấp. Nghiên cứu của Zhang và cộng sự đã chỉ ra rằng, dịch chiết từ cây Embelia laeta có khả năng chống viêm trên các mô hình động vật bị viêm cấp tính và có mối liên hệ chặt chẽ với việc tạo ra chất trung gian cytokine tiền viêm, làm giảm nồng độ COX-2 và iNOS, đồng thời ngăn chặn sự kích hoạt của NF-κB [2]. Nhóm nghiên cứu Hua-Zhong Ying đã tổng hợp được hợp chất embelin có trong cây Embelia laeta (L.) Mez thuộc 2 nhóm quinonoid và đánh giá có khả năng chống ung thư phổi thông qua việc truyền tín hiệu MAPK do stress oxy hóa gây ra. Mức độ biểu hiện trên protein p38 và protein p-JNK (Janus kinase) tăng cao ngay sau khi dùng embelin được 4 giờ, gây ra quá trình apoptosis trên dòng tế bào ung thư phổi A549 [3].

Trong lĩnh vực công nghệ sinh học nano, trong đó các hạt nano bạc (AgNPs) có nhiều ứng dụng có giá trị y học vượt trội. Hơn nữa, việc tổng hợp các hạt nano bạc từ chiết xuất thực vật rất thân thiện với môi trường và là một phương pháp tiềm năng thay thế cho tổng hợp hóa học. Một số kết quả nghiên cứu ghi nhận, tác dụng kháng tế bào ung thư của phức hệ nano bạc - dịch chiết thực vật như dịch chiết vỏ cây Punica granatum và chiết xuất lá Azadirachta indica [4, 5]. Tuy nhiên, trên thế giới và tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào được thực hiện để đánh giá tác động của phức hệ nano bạc tổng hợp từ dịch chiết lá Chua méo lên các dòng tế bào ung thư, chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài luận văn: “Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư của phức hệ nano bạc tổng hợp từ dịch chiết lá của cây Chua méo (Embelia laeta (L.) Mez) thu thập tại Khu Bảo tồn Thiên nhiên Thần Sa – Phượng Hoàng tỉnh Thái Nguyên”.

Mục tiêu nghiên cứu Tổng hợp thành công phức hệ nano bạc từ dịch chiết lá cây Chua méo (Embelia laeta (L.) Mez) và đánh giá khả năng kháng ung thư của phức hệ nano bạc được tổng hợp từ dịch chiết lá cây Chua méo (Embelia laeta (L.) Mez) trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 trong mô hình nuôi cấy in vitro. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Thu thập mẫu, định loại và thu dịch chiết từ lá cây Chua méo (Embelia laeta (L. Nội dung 2: Tổng hợp và xác định tính chất lý, hóa của phức hệ nano bạc – dịch chiết lá cây Chua méo (Embelia laeta (L. Tổng hợp các hạt nano bạc (AgNPs) từ chiết xuất lá cây Chua méo (Embelia laeta (L.

Phân tích quang phổ hấp phụ UV-Vis của phức hệ AgNPs-EbL. Phân tích hình nhiễu xạ X- ray của phức hệ AgNPs-EbL. Phân tích phổ hấp thụ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) của phức hệ AgNPs-EbL. Xác định hình dạng, kích thước của phức hệ AgNPs-EbL bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM).

Hình dạng, kích thước của phức hệ AgNPs-EbL xác định bằng kính hiển vi điện từ truyền qua (TEM). Nội dung 3: Đánh giá khả năng kháng ung thư của phức hệ AgNPs-EbL trên dòng tế bào ung thư gan HepG2 trong mô hình nuôi cấy in vitro. Nghiên cứu tác động của phức hệ AgNPs-EbL lên kiểu hình tế bào nuôi cấy HepG2. Nghiên cứu tác động của phức hệ AgNPs-EbL lên sự tăng sinh của tế bào ung thư gan HepG2 trong môi trường nuôi cấy in vitro.

Nghiên cứu tác động của phức hệ AgNPs-EbL lên kiểu nhân tế bào ung thư gan HepG2. Nghiên cứu tác động của phức hệ AgNPs-EbL lên sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của tế bào ung thư gan HepG2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Hệ thực vật của khu Bảo tồn Thiên nhiên Thần Sa – Phượng Hoàng Khu Bảo tồn Thiên nhiên Thần Sa – Phượng Hoàng có vị trí địa lý bao gồm các xã Thần Sa, Phú Thượng và thị trấn Đình Cả thuộc huyện Võ Nhai, tỉnh Thái Nguyên, được thành lập ngày 01 tháng 12 năm 1999 với diện tích là 11.280 ha theo Quyết định số 3841/QĐ-UB của Ủy ban Nhân dân tỉnh Thái Nguyên [6].

Khu Bảo tồn Thiên nhiên Thần Sa – Phượng Hoàng có điều kiện tự nhiên thuận lợi để phát triển sự đa dạng sinh học cũng như sự phong phú về các loài thực vật, động vật đặc trưng cho hệ sinh thái rừng núi đá vôi và có giá trị cần được bảo tồn. Hệ thực vật tại đây ghi nhận có 6 kiểu thảm thực vật, với 1.234 loài thuộc 660 chi, 171 họ, 5 ngành thực vật bậc cao có mạch. Trong đó có 37 loài có trong Sách đỏ Việt Nam gồm 12 loài xếp loại trong nhóm nguy cấp (EN) và 25 loài trong nhóm sẽ nguy cấp (VU); 8 loài thực vật có trong Sách đỏ thế giới (IUCN Redlist 2019), trong đó có loài Sao Trung Quốc (Hopea chinensis (Merr. - Mazz) thuộc hạng CR (hạng rất nguy cấp); 55 loài nằm trong Nghị định 06/2019/NĐ-CP, trong đó loài lan Kim tuyến đá vôi nằm trong phụ lục IA nghiêm cấm thu hái sử dụng, trao đổi buôn bán để thu lợi nhuận; phụ lục IIA bao gồm 54 loài bị hạn chế khai thác, buôn bán nhằm mục tiêu thương mại.

Theo kết quả điều tra năm 2019, ở khu rừng đặc dụng Thần Sa - Phượng Hoàng đã ghi nhận 608 loài thực vật được sử dụng làm thuốc, thuộc 454 chi, 153 họ, 5 ngành thực vật bậc cao có mạch, ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) là ngành đa dạng nhất với 530 loài (chiếm 87,17%) thuộc 416 chi (chiếm 91,63%) và 160 họ (chiếm 88,40%), đã xác định được 38 loài có giá trị làm dược liệu quý hiếm cần được bảo tồn và phát triển thuộc Nghị định 06/2019, Sách đỏ Việt Nam 2017 và Danh lục đỏ IUCN (2019) được phân bố ở hầu hết diện tích của khu Bảo tồn Thiên nhiên [7]. 5 Khu Bảo tồn Thiên nhiên Thần Sa - Phượng Hoàng là nơi vẫn giữ được những nét văn hóa truyền thống, đặc trưng của các cộng đồng dân tộc. Hiện nay, tại vùng đệm của khu bảo tồn có 10 dân tộc đang sinh sống, tỷ lệ người dân tộc thiểu số chiếm trên 90%, trong đó người Tày, Nùng, Dao, Mông chiếm tỷ lệ cao. Với nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú kết hợp với sự đa dạng về dân tộc, văn hóa, tri thức truyền thống…, tạo nên kho tàng kiến thức, kinh nghiệm sử dụng cây cỏ làm thuốc của cộng đồng các dân tộc nơi đây rất phong phú, được tổng hợp, lưu truyền qua nhiều thế hệ.

Người dân địa phương tại khu Bảo tồn Thiên nhiên đã thường xuyên sử dụng cây thuốc để chữa bệnh thường gặp như đau đầu, rắn cắn, đau dạ dày, bệnh tiểu đường, bệnh ngoài da (mẩn ngứa, hắc lào, nhụn nhọt…), bệnh sỏi thận, bệnh viêm gan, bệnh phụ nữ (chậm kinh, rong kinh, viêm nhiễm, lợi sữa…), bệnh đường tiêu hóa (tiêu chảy, đau bụng, táo bón),… Bộ phận được thu hái làm thuốc chủ yếu là lá, thân, quả kết hợp nhiều cách chế biến như phơi khô sắc uống, hạ thổ ngâm rượu, đun nước tắm, giã nát đắp ngoài,. được sử dụng phổ biến trong cộng đồng dân tộc đang sinh sống tại đây. Theo kết quả của nhóm nghiên cứu Nguyễn Thị Thoa, cho thấy sự đa dạng về tác dụng chữa bệnh, cách thu hái, chế biến và cách dùng thuốc hằng ngày của 608 loài cây thuốc trong đó xác định được 31 nhóm bệnh/chứng (bệnh/thuốc) [8]. Cây Chua méo (Embelia laeta (L.) Mez) theo kinh nghiệm của người dân tộc Tày ở khu Bảo tồn Thiên nhiên Thần Sa - Phượng Hoàng sử dụng lá hoặc cả cây dùng để chữa bệnh liên quan đến gan, thận và thần kinh tọa.

Tài nguyên cây thuốc ở khu Bảo tồn Thiên nhiên Thần Sa - Phượng Hoàng phân bố trên núi đất, núi đá vôi, ở các đai cao khác nhau tạo nên sự đặc trưng riêng về hoạt chất dược liệu cũng như những giá trị trong y học để chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng địa phương. Tổng quan về cây Chua méo (Embelia laeta (L. Đặc điểm phân loại và phân bố 6 Thực vật được Takhtajan phân loại theo hệ thống đã mô tả chi tiết trong cuốn Flowering plants [9], theo đó cây Chua méo (Embelia laeta (L.) Mez) thuộc chi Embelia, họ Đơn nem (Myrsinaceae). Theo hệ thống phân loại thực vật đã phân chia chi Embelia theo từng thang phân loại chính thức như sau: Ngành Ngọc lan – Magnoliophyta Lớp Ngọc lan – Magnoliopsida Phân lớp Sổ - Dilleniidae Bộ Anh thảo – Primulales Họ Đơn nem – Myrsinaceae Chi Embelia Embelia là một chi cây bụi leo, có khoảng 130 loài xuất hiện ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới trên phạm vi rộng bao gồm châu Phi, Madagascar và từ Đông Á đến Quần đảo Thái Bình Dương cũng như Úc [10].

Cây Chua méo (Embelia laeta (L.) Mez) có tên gọi khác là Chua ngút, Chua ngút hóa trắng, Thùn mũn, Rè vui, Phỉ tử, Dây ngút, Vón vén, Dây quẫy, Xốm mun (Thái). Đặc điểm hình thái cây Chua méo thuộc nhóm cây bụi, cao 1-2 m. Thân cứng, màu nâu tím, mọc vươn dài. Cành lá sum sê, cành non mềm, có cạnh, màu tía, cành già hình trụ, hơi có khía, màu nâu.