Phân tích cấu trúc một số flavonoid glycoside từ loài lãnh công rợt (Fissistigma pallens)

Luận văn phân tích cấu trúc flavonoid glycoside từ lãnh công rợt Fissistigma pallens

• Tác giả: Lê Xuân Phương
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Nhiệm
• Trường học: Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Phân tích cấu trúc một số flavonoid glycoside từ loài lãnh công rợt (Fissistigma pallens)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Thái Nguyên

Tóm tắt

I. Tổng quan flavonoid glycoside từ lãnh công rợt Fissistigma pallens

Cây lãnh công rợt có tên khoa học là Fissistigma pallens, thuộc chi Fissistigma và họ Na Annonaceae. Loài thực vật này phân bố chủ yếu tại các vùng rừng nhiệt đới vùng núi đá vôi ở Việt Nam và Trung Quốc. Trong y học cổ truyền, các loài thuộc chi Fissistigma thường được dùng để chữa đau nhức xương khớp, sốt rét và viêm nhiễm mạn tính. Thành phần hóa học của chi này rất phong phú, bao gồm alkaloid, tinh dầu và đặc biệt là các hợp chất phenolic.

Flavonoid glycoside là nhóm chất chuyển hóa thứ cấp quan trọng được phân lập từ lá và cành của cây. Khung cấu trúc chính của nhóm chất này được cấu tạo từ khung diphenylpropane C6-C3-C6 đặc trưng liên kết với mạch đường đơn hoặc đường đôi. Cấu trúc glycoside làm tăng đáng kể độ tan trong môi trường nước và ảnh hưởng trực tiếp đến sinh khả dụng của hợp chất. Các nghiên cứu hóa thực vật hiện đại chứng minh sự đa dạng về các dạng glycoside của kaempferol và quercetin trong dịch chiết của loài thảo dược này. Sự hiện diện của các flavonoid glycoside tạo nên nền tảng giá trị dược liệu to lớn, đồng thời khẳng định tiềm năng nghiên cứu phân lập chuyên sâu.

1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố loài Fissistigma pallens

Cây lãnh công rợt thuộc dạng dây leo gỗ hoặc cây bụi leo, có cành non phủ lớp lông mịn màu nâu nhạt. Lá cây mọc so le, phiến lá thuôn dài hình bầu dục hoặc hình mác, đầu lá nhọn, gốc lá tròn. Mặt trên lá nhẵn bóng, mặt dưới thường mờ nhạt hơn với hệ gân phụ nổi rõ. Hoa mọc đơn độc hoặc thành từng cụm nhỏ ở nách lá, mang đài hoa dày và cánh hoa có màu vàng nhạt hoặc xanh lục. Quả dạng quả tụ, gồm nhiều phân quả hình cầu chứa hạt bên trong. Về mặt địa lý thực vật, loài cây này thường xuất hiện dưới tán rừng mưa nhiệt đới thường xanh và sườn núi đá vôi ẩm ướt ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam.

1.2. Vai trò sinh học của flavonoid glycoside trong dược liệu

Flavonoid glycoside đóng vai trò phòng vệ tự nhiên thiết yếu cho thực vật trước tia cực tím và tác nhân gây hại từ môi trường. Trong cơ thể sinh vật, các hợp chất này thể hiện hoạt tính chống oxy hóa vượt trội nhờ khả năng bẫy gốc tự do. Cấu trúc liên kết đường tại vị trí C-3 hoặc C-7 giúp phân tử điều hòa tính thấm qua màng sinh học và hạn chế độc tính tế bào. Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng ức chế phản ứng viêm mạnh mẽ thông qua việc ngăn chặn các cytokine tiền viêm. Ngoài ra, flavonoid glycoside còn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, bảo vệ gan và hỗ trợ ngăn ngừa sự tăng sinh bất thường của tế bào ung thư trong các mô hình thử nghiệm.

II. Phân tích cấu trúc flavonoid glycoside ở loài Fissistigma pallens

Việc phân tích cấu trúc flavonoid glycoside từ loài Fissistigma pallens đối mặt với nhiều thách thức kỹ thuật. Các hợp chất này thường tồn tại ở dạng hỗn hợp phức tạp với hàm lượng tương đối thấp trong mẫu thực vật thô. Sự tương đồng cao về mặt cấu trúc hóa học giữa các dẫn xuất aglycone và các đồng phân mạch đường gây khó khăn cho việc phân lập tinh khiết. Ngoài ra, việc xác định chính xác vị trí liên kết glycoside, cấu hình không gian anomer alpha hoặc beta của từng gốc đường đòi hỏi dữ liệu phổ đa chiều rõ nét.

Trong nghiên cứu luận văn, bốn hợp chất flavonoid glycoside chính đã được phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc gồm FP1, FP2, FP3 và FP4. Hợp chất FP1 và FP2 đều là các dẫn xuất monodesmosidic mang aglycone kaempferol kết hợp với galactose và rhamnose, nhưng khác biệt nhau ở vị trí liên kết giữa hai gốc đường. Cụ thể, FP1 có liên kết 1→2 trong khi FP2 sở hữu liên kết 1→6. Hợp chất FP3 được xác định là kaempferol-3-rutinoside, và FP4 là rutin mang aglycone quercetin liên kết với gốc rutinose. Việc làm sáng tỏ trật tự liên kết này giải quyết hoàn toàn bài toán phân biệt các đồng phân vị trí phức tạp trong hóa học tự nhiên.

2.1. Cấu trúc hóa học của các hợp chất FP1 FP2 và FP3

Hợp chất FP1 mang tên khoa học là kaempferol-3-O-alpha-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-beta-D-galactopyranoside. Cấu trúc aglycone kaempferol được nhận diện qua hệ spin đối xứng A2B2 của vòng B tại vị trí C-2' và C-6'. Gốc đường rhamnose gắn vào C-2 của phân tử galactose, và galactose gắn trực tiếp vào vị trí C-3 của aglycone. Tương tự, hợp chất FP2 là kaempferol-3-O-alpha-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-beta-D-galactopyranoside. Điểm khác biệt mấu chốt nằm ở liên kết 1→6 giữa rhamnose và galactose, thể hiện qua độ chuyển dịch hóa học của C-6 đường galactose dịch chuyển về vùng trường thấp. Hợp chất FP3 là kaempferol-3-rutinoside, chứa mạch disaccharide rutinose gồm glucose liên kết 1→6 với rhamnose tại vị trí C-3 của khung kaempferol.

2.2. Đặc điểm cấu tạo phân tử của hợp chất FP4 rutin

Hợp chất FP4 được xác định chính xác là rutin, có công thức phân tử C27H30O16. Phổ khối lượng HR-ESI-MS cho pic ion phân tử tại m/z 633,1433 [M+Na]+, hoàn toàn phù hợp với lý thuyết tính toán. Khung aglycone của rutin là quercetin, sở hữu 5 nhóm hydroxyl tự do tại các vị trí C-5, C-7, C-3', C-4' và một liên kết glycoside tại C-3. Tín hiệu phổ proton cho thấy hệ tương tác spin ABX đặc trưng của vòng B với ba proton thơm. Mạch đường của rutin là rutinose, tạo thành từ gốc beta-D-glucopyranosyl và alpha-L-rhamnopyranosyl qua liên kết 1→6. Khối phổ và phổ cộng hưởng từ hạt nhân khẳng định FP4 trùng khớp hoàn toàn với mẫu chuẩn rutin tự nhiên.

III. Phương pháp xác định flavonoid glycoside ở Fissistigma pallens

Quy trình phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc các flavonoid glycoside đòi hỏi sự kết hợp đồng bộ giữa kỹ thuật sắc ký và các phương pháp quang phổ hiện đại. Mẫu lá hoặc cành khô của cây Fissistigma pallens được chiết hồi lưu bằng cồn methanol hoặc ethanol nhiệt độ thích hợp. Dịch chiết sau đó được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để thu cắn tổng. Cắn tổng được hòa tan phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate và n-butanol nhằm loại bỏ tạp chất kém phân cực.

Phân đoạn ethyl acetate và butanol giàu flavonoid được đưa qua hệ thống sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo RP-18. Kỹ thuật sắc ký rây phân tử Sephadex LH-20 giúp tinh sạch triệt để các hợp chất phenolic glycoside. Để xác định công thức phân tử chính xác, phương pháp phổ khối lượng độ phân giải cao HR-ESI-MS được áp dụng. Cuối cùng, việc giải mã cấu trúc lập thể dựa hoàn toàn vào hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D NMR, bao gồm 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC và HMBC. Tương tác dị nhân tầm xa HMBC cho phép xác định chính xác vị trí liên kết giữa các phân tử đường với khung aglycone.

3.1. Kỹ thuật sắc ký phân lập hợp chất tự nhiên

Quá trình phân lập flavonoid glycoside dựa trên nguyên lý tách phân bố và hấp phụ chọn lọc. Sắc ký cột pha thường sử dụng chất nhồi silica gel với hệ dung môi dichloromethane - methanol tăng dần độ phân cực. Các phân đoạn giàu glycoside tiếp tục được đưa lên sắc ký cột pha đảo RP-18 sử dụng pha động methanol - nước. Pha đảo giúp tách biệt hiệu quả các hợp chất có cực tính tương tự nhau nhưng khác biệt về kích thước phân tử và khung aglycone. Tiếp theo, sắc ký rây phân tử Sephadex LH-20 loại bỏ hoàn toàn sắc tố diệp lục và polyphenol cao phân tử. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng phân tích TLC hỗ trợ kiểm tra độ tinh khiết của từng phân đoạn trước khi đo phổ.

3.2. Ứng dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR và phổ khối lượng HR-ESI-MS đóng vai trò quyết định trong việc xác định công thức cấu tạo. Phổ 1H-NMR cung cấp thông tin về số lượng proton, độ dịch chuyển hóa học và hằng số tương tác spin J. Nhờ đó, cấu hình dạng anomer alpha hay beta của gốc đường được chỉ định rõ ràng qua giá trị J của proton anomer. Phổ 13C-NMR và DEPT phân loại chính xác các carbon bậc một, bậc hai, bậc ba và carbon bậc bốn. Phổ tương quan hai chiều HSQC ghép cặp trực tiếp giữa proton và carbon liên kết. Trong khi đó, phổ HMBC cung cấp tương tác tầm xa qua 2-3 liên kết, giúp định vị chính xác vị trí gắn gốc đường vào aglycone và điểm nối giữa các phân tử đường.

IV. Ứng dụng của flavonoid glycoside từ lãnh công rợt Fissistigma

Kết quả phân lập và xác định cấu trúc các flavonoid glycoside từ loài Fissistigma pallens mang lại nhiều đóng góp khoa học thiết thực. Nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu hóa thực vật chuẩn xác cho chi Fissistigma tại Việt Nam. Việc phát hiện các hợp chất như rutin, kaempferol-3-rutinoside cùng các dẫn xuất kaempferol diglycoside làm sáng tỏ cơ chế tác dụng sinh học của loài cây này trong y học dân gian. Các hợp chất flavonoid glycoside đã được chứng minh có khả năng trung hòa các gốc tự do mạnh mẽ, bảo vệ thành mạch và ngăn ngừa các tổn thương tế bào do stress oxy hóa.

Trong lĩnh vực công nghiệp dược phẩm và chăm sóc sức khỏe, nguồn flavonoid từ lãnh công rợt là nguyên liệu tiềm năng để phát triển các chế phẩm hỗ trợ điều trị bệnh tim mạch, viêm khớp và suy giảm miễn dịch. Rutin và dẫn xuất kaempferol glycoside có thể ứng dụng trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe hoặc mỹ phẩm chống lão hóa da. Hơn nữa, việc hoàn thiện quy trình chiết xuất và phân lập tạo tiền đề để chuẩn hóa dược liệu, phục vụ công tác kiểm nghiệm và bảo tồn nguồn gen thực vật quý hiếm trong nước.

4.1. Tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm và y học

Các flavonoid glycoside từ lá cây lãnh công rợt sở hữu tiềm năng phát triển thuốc điều trị rất lớn. Khả năng chống oxy hóa mạnh của rutin giúp tăng cường sức bền mao mạch và ngăn ngừa xơ vữa động mạch. Các dẫn xuất kaempferol glycoside ức chế chọn lọc các enzym trung gian gây viêm, mở ra hướng phát triển thuốc hỗ trợ điều trị viêm khớp và thấp khớp tự miễn. Hơn nữa, những hợp chất này có nguồn gốc tự nhiên nên thể hiện độ an toàn cao và hạn chế tối đa độc tính phụ trên đường tiêu hóa so với thuốc chống viêm tổng hợp. Dữ liệu này chứng minh cơ sở khoa học của kinh nghiệm dân gian trong việc sử dụng chi Lãnh công chữa bệnh xương khớp.

4.2. Định hướng nghiên cứu và phát triển sản phẩm

Công tác nghiên cứu tiếp theo cần tập trung khảo sát hoạt tính sinh học in vitro và in vivo toàn diện của từng flavonoid glycoside tinh khiết. Cần tối ưu hóa quy trình chiết xuất quy mô bán công nghiệp bằng dung môi thân thiện môi trường để gia tăng hiệu suất thu hồi hoạt chất. Việc đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và khả năng hấp thu qua đường uống là bước đệm cần thiết trước khi phát triển viên nang hoặc dung dịch uống bảo vệ sức khỏe. Đồng thời, việc ứng dụng chất chỉ thị hóa học FP1, FP2 và rutin giúp tiêu chuẩn hóa quy trình kiểm tra chất lượng nguồn dược liệu Fissistigma pallens thu hái từ tự nhiên.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thế giới thực vật từ lâu đã khẳng định vai trò then chốt đối với nền y dược học hiện đại. Theo thống kê của ngành y tế, tại các quốc gia có nền công nghiệp phát triển, khoảng 25% tổng số thuốc kê trong đơn đều chứa các hoạt chất có nguồn gốc từ thảo mộc thiên nhiên. Việt Nam sở hữu kho tàng tài nguyên sinh vật vô cùng trù phú với gần 13.000 loài thực vật bậc cao, trong đó hơn 4.000 loài được nhân dân ứng dụng làm thuốc phòng và trị bệnh. Họ Na (Annonaceae) là một trong những họ thực vật lớn thuộc bộ Mộc lan (Magnoliales), bao gồm khoảng 2.300 đến 2.500 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới. Riêng chi Lãnh công (Fissistigma) ghi nhận hơn 50 loài trên phạm vi toàn cầu, và tại Việt Nam hiện đã định danh được 22 loài phân bố trải dài khắp các vùng sinh thái.

Trong số đó, loài Lãnh công rợt (Fissistigma pallens) là loài dây leo thân gỗ đặc trưng, phân bố tại hơn 15 tỉnh thành như Nghệ An, Thanh Hóa, Hòa Bình, Lào Cai và Thừa Thiên Huế. Theo kinh nghiệm dân gian, thân cành và rễ của loài cây này thường xuyên được sử dụng để điều trị phong tê thấp, tiêu viêm, hoạt huyết và chữa lành các vết bầm tím do chấn thương lao động. Dù vậy, trước năm 2018, các nghiên cứu hóa thực vật về loài này còn rất khiêm tốn, mới chỉ dừng lại ở việc phân lập được 2 hợp chất là afzelin và fissispallin. Đề tài luận văn thạc sĩ chuyên ngành Hóa phân tích của tác giả Lê Xuân Phương đã tập trung giải quyết bài toán cấp thiết: Xử lý 5,0 kg mẫu dược liệu thu hái vào tháng 4 năm 2016 tại huyện Quế Phong, tỉnh Nghệ An nhằm chiết xuất, phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc hóa học của các flavonoid glycoside. Nghiên cứu thuộc khuôn khổ đề tài Quỹ NAFOSTED mã số 104.79, đóng góp dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân chuẩn xác cho 4 hợp chất tự nhiên, nâng cao giá trị sử dụng của hệ thảo dược bản địa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng lý thuyết phân loại thực vật học họ Na (Annonaceae) với 120 đến 130 chi trên toàn cầu, cùng hệ thống phân loại hóa thực vật chi Fissistigma gồm 22 loài tại Việt Nam. Khung lý thuyết cốt lõi thứ hai là hóa học các hợp chất tự nhiên, tập trung vào nhóm flavonoid có cấu trúc khung carbon C6-C3-C6 (vòng A, B và C), cụ thể là phân nhóm flavonol gắn các đơn vị đường qua liên kết glycoside tại vị trí C-3.

Bên cạnh đó, nghiên cứu vận dụng sâu sắc lý thuyết phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (NMR) để giải mã cấu trúc phân tử. Trên thang đo độ dịch chuyển hóa học, phổ proton 1H-NMR được khảo sát trong dải từ 0 đến 14 ppm nhằm xác định hệ proton vòng thơm và proton anomer của mạch đường. Phổ carbon 13C-NMR trải rộng từ 0 đến 230 ppm kết hợp kỹ thuật DEPT-135 và DEPT-90 cho phép phân loại chính xác các nguyên tử carbon bậc 1, 2, 3 và 4. Khái niệm tương tác dị hạt nhân tầm xa qua 2 đến 3 liên kết hóa học (HMBC) cùng tương tác trực tiếp một liên kết (HSQC) đóng vai trò then chốt để xác lập trật tự liên kết giữa khung aglycone và các chuỗi disaccharide.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm được thu thập từ cỡ mẫu 5,0 kg cành lá khô loài Lãnh công rợt (Fissistigma pallens) thu hái tự nhiên tại xã Tiền Phong, huyện Quế Phong, tỉnh Nghệ An. Phương pháp chọn mẫu tuân thủ nghiêm ngặt tiêu chuẩn thực vật học: thu thập các cành lá bánh tẻ đồng nhất, không sâu bệnh, được giám định danh pháp chính xác bởi các chuyên gia thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, mẫu tiêu bản được lưu trữ mã số NCCT-P14 tại Viện Hóa sinh biển. Toàn bộ mẫu được làm sạch tạp cơ học và sấy khô ở nhiệt độ ổn định 50 độ C nhằm bảo vệ các liên kết glycoside nhạy cảm khỏi bị thủy phân do nhiệt độ cao.

Quy trình chiết xuất sử dụng 8,0 lít methanol nguyên chất cho mỗi lần ngâm chiết, lặp lại 3 chu kỳ liên tiếp ở 50 độ C với sự hỗ trợ của thiết bị siêu âm gia nhiệt (mỗi chu kỳ kéo dài 2 giờ). Dịch chiết sau khi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đã thu được 400 g cặn tổng. Quá trình chiết phân bố lỏng - lỏng với 2 lít nước cất, n-hexane và ethyl acetate đã tạo ra 3 phân đoạn chính: 14,0 g cặn n-hexane, 91,0 g cặn ethyl acetate và 305,0 g cặn nước. Lý do lựa chọn hệ thống sắc ký cột hấp phụ nhựa Diaion HP-20 (rửa giải gradient nước - methanol: 25%, 50%, 75% và 100%) kết hợp cột silica gel pha đảo RP-18 là nhằm giải quyết độ phân cực rất cao của các flavonoid glycoside, hạn chế tối đa hiện tượng hấp phụ vĩnh viễn trên pha tĩnh thông thường. Các phương pháp phổ hiện đại gồm HR-ESI-MS và NMR tần số 400 MHz được lựa chọn vì mang lại độ phân giải tuyệt đối, cho phép xác định chính xác khối lượng phân tử và cấu hình không gian mà không làm biến tính mẫu thử. Toàn bộ timeline nghiên cứu được tiến hành khép kín trong 26 tháng, từ tháng 4 năm 2016 đến tháng 6 năm 2018.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Từ phân đoạn cặn nước giàu hoạt chất, nghiên cứu đã phân lập thành công 4 hợp chất flavonoid glycoside tinh khiết dạng bột vô định hình màu vàng, ký hiệu từ FP1 đến FP4. Hợp chất FP1 thu được 7,0 mg với công thức phân tử C27H30O15, phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS ghi nhận pic ion phân tử tại m/z 617,1488 (phù hợp tuyệt đối với tính toán lý thuyết cho C27H30O15Na là 617,1482 Da). Cấu trúc của FP1 được xác định là Kaempferol-3-O-alpha-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-beta-D-galactopyranoside, đặc trưng bởi liên kết disaccharide 1→2 tại vị trí C-3 của khung kaempferol.

Hợp chất FP2 thu được 10,0 mg, mang công thức phân tử C27H30O15 tương đồng với FP1. Điểm khác biệt mấu chốt được ghi nhận trên phổ 13C-NMR khi tín hiệu carbon methylene C-6'' của phân tử đường galactose dịch chuyển từ 62,2 ppm (ở FP1) lên 67,4 ppm (ở FP2), tăng 5,2 ppm do ảnh hưởng từ hiệu ứng thế liên kết glycoside. Từ các tương tác dị hạt nhân HMBC, hợp chất FP2 được xác định là Kaempferol 3-O-alpha-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-beta-D-galactopyranoside. Hai hợp chất còn lại được làm sáng tỏ gồm FP3 là Kaempferol-3-rutinoside (C27H30O15, m/z 617,1489) và FP4 thu được 8,0 mg là Rutin (C27H30O16, m/z 633,1433) mang khung aglycone quercetin với tín hiệu carbon carbonyl tại 179,5 ppm.

Thảo luận kết quả

Sự tồn tại đồng thời của 4 hợp chất flavonol glycoside cho thấy sự hoạt động phong phú của hệ thống enzym glycosyltransferase trong mô lá cây Lãnh công rợt. Các enzym này có khả năng xúc tác quá trình gắn các phân tử đường đơn như beta-D-galactose, beta-D-glucose và alpha-L-rhamnose vào vị trí C-3 của aglycone kaempferol và quercetin, tạo nên cả hai dạng liên kết nhánh 1→2 và liên kết thẳng 1→6.

Toàn bộ quá trình phân bố hoạt chất có thể được trực quan hóa rõ nét thông qua biểu đồ tròn thể hiện tỷ lệ khối lượng các phân đoạn chiết từ 400 g cặn tổng số. Trong đó, phân đoạn n-hexane chỉ chiếm 3,5%, phân đoạn ethyl acetate chiếm 22,75%, trong khi phân đoạn nước chứa flavonoid glycoside chiếm tỷ trọng áp đảo lên tới 76,25% (tương đương 305,0 g). Đồng thời, một bảng ma trận đối chiếu số liệu phổ NMR đo tại tần số 400 MHz (proton) và 100 MHz (carbon) giữa 4 hợp chất cho thấy sự tương quan chặt chẽ về độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử carbon khung aglycone, làm nổi bật bước nhảy dịch chuyển hóa học 5,2 ppm của liên kết 1→6. Khi so sánh với các tài liệu công bố trước đó của các nhà khoa học trong và ngoài nước, nếu như các nghiên cứu trước chỉ tìm thấy flavonoid monoglycoside đơn giản là afzelin trên loài này, thì công trình hiện tại đã lần đầu tiên phát hiện các dẫn xuất diglycoside phức tạp. Đặc biệt, hợp chất FP2 lần đầu tiên được ghi nhận sự hiện diện trong chi Fissistigma kể từ khi được phân lập từ loài Strychnos variabilis vào năm 1986.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm phát huy tối đa giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn của công trình nghiên cứu, bốn khuyến nghị chiến lược được đề xuất:

Thứ nhất, Viện Hóa sinh biển và các trung tâm nghiên cứu dược liệu cần chuẩn hóa quy trình chiết xuất xanh quy mô pilot trong vòng 12 tháng tới. Quy trình cần thay thế dung môi hữu cơ độc hại bằng hệ dung môi ethanol kết hợp nước ở nhiệt độ 50 độ C, hướng tới mục tiêu gia tăng hiệu suất thu hồi flavonoid glycoside thêm 15% đến 20%, đồng thời đảm bảo độ tinh sạch của sản phẩm đạt trên 95%.

Thứ hai, nhóm nghiên cứu đề tài NAFOSTED cần thực hiện đánh giá hoạt tính sinh học in vitro đối với 4 hợp chất FP1, FP2, FP3 và FP4 trong thời hạn 18 tháng. Mục tiêu trọng tâm là thử nghiệm khả năng kháng viêm và gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào ung thư gồm KB, Hep-G2, MCF-7 và LU, phấn đấu xác định các giá trị ức chế IC50 đạt dưới ngưỡng 10 microgam/ml nhằm phục vụ định hướng phát triển tân dược.

Thứ ba, Cục Quản lý Dược phối hợp cùng các trường đại học khối y dược xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng dược liệu Lãnh công rợt trong vòng 24 tháng. Việc ứng dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1290 để định lượng hai chất điểm chỉ là rutin và kaempferol-3-rutinoside sẽ giúp kiểm soát hàm lượng hoạt chất tối thiểu đạt 0,5% khối lượng khô trong nguyên liệu thương phẩm.

Thứ tư, Sở Khoa học và Công nghệ cùng Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn các tỉnh miền núi phía Bắc cần quy hoạch vùng trồng bảo tồn từ 50 đến 100 hecta cây Lãnh công rợt trong giai đoạn 2026-2030. Giải pháp này giúp kiểm soát tình trạng khai thác tự nhiên thiếu bền vững và gìn giữ nguồn gen cho 22 loài thuộc chi Fissistigma tại Việt Nam.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn thạc sĩ mang lại giá trị thực tiễn và học thuật cho 4 nhóm đối tượng cụ thể:

Nhóm học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa phân tích, Hóa dược: Tài liệu cung cấp hướng dẫn thực nghiệm chi tiết về kỹ thuật giải phổ 1D và 2D-NMR với hơn 27 pic carbon và hàng chục tương tác HMBC phức tạp. Nghiên cứu sinh có thể áp dụng trực tiếp phương pháp luận này để rút ngắn khoảng 30% đến 40% thời gian phân tích cấu trúc các hợp chất tự nhiên mới.

Nhóm cán bộ nghiên cứu tại các viện hóa thực vật và dược liệu: Đề tài cung cấp giải pháp làm sạch mẫu phân cực cao bằng cột Diaion HP-20 và pha đảo RP-18, giúp tối ưu hóa 100% quy trình phân lập flavonoid diglycoside cho hơn 50 loài thuộc chi Fissistigma và họ Na tại khu vực Đông Nam Á.

Nhóm chuyên viên R&D tại các doanh nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng: Khai thác nguồn hoạt chất rutin và các dẫn xuất kaempferol dồi dào từ lá Lãnh công rợt để sản xuất các chế phẩm hỗ trợ điều trị viêm khớp, bảo vệ thành mạch, giúp doanh nghiệp tiết kiệm 20% đến 25% chi phí nguyên liệu so với việc nhập khẩu hoạt chất tinh khiết.

Nhóm giảng viên đại học và nhà quản lý tài nguyên dược liệu: Công trình là nguồn tài liệu tham khảo giá trị phục vụ công tác giảng dạy chuyên đề Hóa học hợp chất tự nhiên, đồng thời hỗ trợ hoạch định chiến lược bảo tồn bền vững cho hơn 4.000 loài thực vật làm thuốc tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nghiên cứu lại tập trung phân lập flavonoid từ phân đoạn cặn nước thay vì phân đoạn ethyl acetate?

Trong tổng số 400 g cặn chiết methanol ban đầu, phân đoạn cặn nước chiếm tỷ trọng vượt trội lên tới 305,0 g, tương đương 76,25% tổng khối lượng. Đây là nơi tập trung các flavonoid glycoside có độ phân cực cao. Nhờ phối hợp cột nhựa hấp phụ Diaion HP-20 và cột sắc ký pha đảo RP-18, nghiên cứu đã loại bỏ triệt để đường tự do và phân lập thành công 4 hợp chất tinh khiết có hoạt tính sinh học quý.

Sự khác biệt cấu trúc then chốt giữa hai hợp chất đồng phân FP1 và FP2 được xác định như thế nào?

Hai hợp chất FP1 và FP2 có cùng công thức phân tử C27H30O15 và khối lượng m/z 617,1488 nhưng khác biệt ở trật tự gắn kết đường. Trên phổ carbon-13, nhóm methylene C-6'' của đường galactose ở FP1 xuất hiện tại 62,2 ppm, trong khi ở FP2 tín hiệu này dịch chuyển mạnh lên 67,4 ppm do hiệu ứng thế của liên kết 1→6 với rhamnose, được chứng minh qua tương tác dị hạt nhân HMBC 400 MHz.

Hệ thống thiết bị hiện đại nào đóng vai trò quyết định trong việc giải mã cấu trúc phân tử?

Nghiên cứu sử dụng máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều 400 MHz tại Viện Hóa sinh biển để xác định cấu trúc 4 flavonoid. Sự kết hợp giữa phổ một chiều và phổ hai chiều như HSQC, HMBC giúp gán chính xác toàn bộ 27 tín hiệu carbon và xác định mạch liên kết glycoside. Đồng thời, hệ thống khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS giúp xác thực công thức phân tử với độ sai lệch dưới 0,001 Da.

Cây Lãnh công rợt có những công dụng chữa bệnh nổi bật nào theo kinh nghiệm dân gian?

Theo kinh nghiệm dân gian tại hơn 15 tỉnh thành, cây Lãnh công rợt là vị thuốc quý chữa thấp khớp và tổn thương cơ xương do lao động nặng. Thân cành của cây có tác dụng hoạt huyết, tiêu viêm; lá tươi thường được giã nát để đắp tan các vết bầm tím ngoài da. Người dân thường dùng độc vị hoặc kết hợp trong các bài thuốc cổ truyền với liều lượng khoảng 20 đến 40 g mỗi ngày.

Nghiên cứu mang lại đóng góp mới nào cho cơ sở dữ liệu hóa thực vật của chi Fissistigma?

Luận văn cung cấp trọn bộ số liệu phổ NMR và khối phổ của 4 flavonoid glycoside từ lá Lãnh công rợt. Đáng chú ý, hợp chất FP2 lần đầu tiên được phát hiện trong chi Fissistigma kể từ khi tìm thấy ở loài Strychnos variabilis năm 1986. Kết quả này bổ sung minh chứng khoa học đắt giá cho đề tài Quỹ NAFOSTED mã số 104.79 về nguồn dược liệu kháng viêm, chống ung thư tiềm năng.

Kết luận

• Chiết xuất thành công từ 5,0 kg cành lá Lãnh công rợt khô để thu được 400 g cặn tổng và phân lập tinh sạch 4 hợp chất flavonoid glycoside gồm FP1 (7,0 mg), FP2 (10,0 mg), FP3 và FP4 (8,0 mg).
• Giải mã chính xác cấu trúc hóa học của 4 hợp chất thông qua kỹ thuật hiện đại HR-ESI-MS và hệ thống cộng hưởng từ hạt nhân 2D-NMR 400 MHz.
• Ghi nhận lần đầu tiên sự xuất hiện của hợp chất Kaempferol 3-O-alpha-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-beta-D-galactopyranoside (FP2) trong chi Fissistigma kể từ năm 1986.
• Hoàn thiện bộ cơ sở dữ liệu phổ chi tiết cho 27 nguyên tử carbon và các proton anomer, làm sáng tỏ trật tự liên kết glycoside 1→2 và 1→6.
• Đóng góp trực tiếp vào mục tiêu nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của đề tài Quỹ NAFOSTED mã số 104.79.

Luận văn thạc sĩ của tác giả Lê Xuân Phương đã làm sáng tỏ cấu trúc hóa học của nhóm chất phân cực từ loài Lãnh công rợt (Fissistigma pallens), khẳng định tiềm năng dược liệu to lớn của 22 loài thuộc chi Fissistigma tại Việt Nam. Trong giai đoạn 6 đến 18 tháng tới, các nhóm nghiên cứu cần đẩy mạnh thử nghiệm hoạt tính kháng viêm và độc tế bào trên 4 dòng tế bào ung thư người để hoàn thiện hồ sơ tiền lâm sàng. Độc giả, nhà nghiên cứu và các đơn vị sản xuất dược phẩm hãy khai thác và trích dẫn ngay công trình khoa học giá trị này để thúc đẩy các dự án phát triển thuốc tự nhiên từ nguồn dược liệu Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Không chỉ các nước phương Đông mà các nước phương Tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dược liệu. Theo thống kê, ở các nước có nền công nghiệp phát triển, một phần tư số thuốc kê trong các đơn đều có chứa hoạt chất có nguồn gốc từ thảo mộc. Nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao đã được phân lập và đưa vào sử dụng với mục đích chữa bệnh.

Xu hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ các loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp. Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật đa dạng và phong phú, theo ước tính, nước ta có khoảng gần 13000 loài thực vật bậc cao trong đó có khoảng hơn 4000 loài được sử dụng làm thuốc. Việc sử dụng nguồn tài nguyên đó để phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khoẻ cho con người đã có từ lâu đời và ngày càng trở nên quan trọng. Ngoài sự đa dạng về thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam còn có giá trị to lớn ở chỗ chúng được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng để chữa nhiều loại bệnh khác nhau.

Các cây thuốc được sử dụng dưới hình thức độc vị hay phối hợp với nhau tạo nên các bài thuốc quý giá. Ngoài ra, hàng trăm cây thuốc đã được khoa học y - dược hiện đại chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng. Chi Fissistigma là một trong những chi quan trọng của họ Na (Annonaceae), với khoảng 50 loài, phân bố rộng rãi ở châu Á và Australia, đặc biệt là ở Đông Nam Á như Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam. Một số loài thuộc chi này dùng để làm thuốc chữa bệnh về cơ, chấn thương, viêm khớp, kháng viêm, kháng vi rút và chống khối u.

Xuất phát từ những cơ sở trên tôi đã chọn đề tài “Phân tích cấu trúc một số flavonoid glycoside từ loài lãnh công rợt (Fissistigma pallens)” với các mục 1 tiêu chính: 1. Xử lý mẫu và tạo dịch chiết 2. Phân lập các flavonoid glycoside từ lá loài lãnh công rợt (Fissistigma pallens) 3. Phân tích cấu trúc hóa học của các chất đã phân lập được.

Tổng quan về họ Na (Annonaceae) Họ Na (Annonaceae) là một họ thực vật có hoa bao gồm các loại cây thân gỗ, cây bụi hay dây leo. Với khoảng 2300 đến 2500 loài thuộc 120 – 130 chi, đây là họ lớn nhất của bộ Mộc lan (Magnoliales). Họ này sinh trưởng chủ yếu ở vùng nhiệt đới, và chỉ có một ít loài sinh sống ở vùng ôn đới. Khoảng 900 loài ở Trung và Nam Mỹ, 450 loài ở châu Phi, 950 loài ở châu Á và châu Úc.

Các loài thuộc họ Annonaceae có lá đơn, mọc so le (mọc cách), có cuống lá va mép lá nhẵn. Lá mọc thành hai hàng dọc theo thân cây. Vết sẹo nơi đính lá thường nhìn thấy rõ các mạch dẫn. Cành thường ở dạng zic zắc.

Chúng không có các lá bẹ. Hoa đối xứng xuyên tâm (hoa đều) và thường là lưỡng tính. Ở phần lớn các loài thì 3 đài hoa nối với nhau ở gốc hoa. Có 6 cánh hoa có màu nâu hay vàng, nhiều nhị hoa mọc thành hình xoắn ốc cũng như nhiều nhụy hoa, mỗi nhụy có bầu nhụy dạng một ngăn chứa một hoặc nhiều tiểu noãn.

Hoa đôi khi mọc trực tiếp trên các cành lớm hoặc trên thân cây. Quả là nang, bế quả hay đa quả. Ở Việt Nam, họ Annonaceae có 29 chi bao gồm: Alphonsea, Anaxagorea, Annona, Anomianthus, Artabotrys, Cananga (Canangium), Cyathocalyx, Cyathostemma, Dasymaschalon, Desmos (Unona) , Drepananthus, Enicosanthella, Enicosanthum, Fissistigma, Friesodielsia (Oxymitra), Goniothalamus (Becariodendron), Meiogyne, Melodorum (Rauwenhoffia), Miliusa (Saccopetalum), Mitrella, Mitrephora, orophea, Phaeanthus, Polyalthia, Popowia, Pseuduvaria, Sageraea, Uvaria (Uvariella) và Xylopia với gần 179 loài. Giới thiệu về chi lãnh công (Fissistigma) 1.

Đặc điểm thực vật, phân bố Chi lãnh công (Fissistigma Griff.) là một chi lớn của họ Na (Annonaceae), có khoảng 80 loài, phân bố ở các nước nhiệt đới Châu Á, Úc, Châu Phi, Malaysya, Indonesya, Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam. Các loài trong 3 chi lãnh công (Fissistigma) là nguồn nguyên liệu để tách chiết các alkaloid có hoạt tính sinh học cao, có khả năng diệt khuẩn, chống ung thư. Ở Việt Nam mới chỉ có một số công trình nghiên cứu về mặt hóa học ở chi này. Hầu hết các loài thuộc chi Lãnh công (Fissistigma) đều có chứa tinh dầu hoặc hương thơm, song hàm lượng và thành phần hóa học của tinh dầu ở mỗi loài thường khác nhau.

Vị trí phân loại chi Fissistigma trong hệ thống phân loại thực vật Theo các khóa phân loại thực vật, chi Fissistigma có vị trí phân loại như sau: Ngành: Ngọc lan - Magonoliophyta Lớp: Ngọc lan - Magnoliopsida Lớp phụ: Ngọc lan - Magnolianae Bộ: Ngọc lan - Magnoliales Họ: Na - Annonaceae Chi: Fissistgma Chi lãnh công hay còn được gọi là chi mật hương, cách thư (Fisstigma) là một chi lớn thuộc họ Na (Annonaceae), có trên 50 loài. Phân bố chủ yếu ở Nam và Đông Nam Á. Theo sách Thực vật chí Việt Nam, ở nước ta, chi Fisstigma hiện tìm thấy 22 loài, được phân bố rộng rãi trên cả nước .1 Danh sách các loài thuộc chi Fissistigma ở Việt Nam STT Tên khoa học Tên Việt Nam Phân bố 1 Fissistigma Lãnh công nhiều lá Lạng Sơn, Vĩnh Phúc, bracteolatum Chatt. bắc Ninh Bình 2 Fissistigma capitatum Lãnh công hình đầu Lào Cai, Hà Giang Merr.

ex Li 3 Fissistigma Lãnh công Quảng Lạng Sơn shangtzeense Y. Li 4 Fissistigma thorelii Bổ béo trắng Lào Cai, Sơn La, Hòa 4 Pierre ex Fin. & Bình, Huế, Đà Nẵng, Gagnep Kon Tum, Đắc Lắc, Đồng Nai 5 Fissistigma latifolium Lãnh công lá lớn Quảng Ninh, Đà Nẵng (Dun. 6 Fissistigma Lãnh công lá nhọn Lào Cai, Hà Giang, acuminatissium Merr.

Ninh Thuận 7 Fissistigma Dời dơi, cách thư đa Lào Cai, Sơn La, Cao polyanthoides Merr. Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Phú Thọ, Hà Tây, Hòa Bình, Ninh Bình, Quảng Bình, Kon Tum, Đắc Lắc, Lâm Đồng. 8 Fissistigma Lãnh công sét Kiên Giang rubiginosum Merr. 9 Fissistigma balansae Lãnh công ba vì, Phú Thọ, Lâm Đồng Merr.

cách thư balansa 10 Fissistigma oldhamii Cách thư oldham Lào Cai, Hà Giang, (Hemsl. Cao Bằng, Quảng Trị, Kon Tum, Gia Lai, Đồng Nai 11 Fissistigma Lãnh công màu hung Lạng Sơn, Thái cupreonitens Merr. & Nguyên Chun 12 Fissistigma pallens Lãnh công rợt, cách Lào Cai, Yên Bái, (Fin & Gagnep) Merr. thư tái Lạng Sơn, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Quảng Ninh,Phú Thọ, Hà 5 Tây, Ninh Bình, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Trị, Huế, Lâm Đồng 13 Fissistigma tokinense Lãnh công bắc Quảng Ninh (Fin & Gagnep) Merr.

14 Fissistigma Lãnh công tái Lai Châu, Lào Cai, chloroneurum (Hand.- Yên Bái, Sơn La, Mazz) Tsiang Lạng Sơn, Hà Tây, Ninh Bình 15 Fissistigma petelotii Phát lãnh công Quảng Ninh, Hòa Merr. Binh 16 Fissistigma rufinerve Lãnh công gân hoe Lào Cai, Hà Giang, (Hook. & Thoms) Cao Bằng, Quảng Merr. Ninh, Khánh Hòa, Gia Lai 17 Fissistigma poilanei Cách thư poilane Lâm Đồng Y.

Li 18 Fissistigma bicolor Lãnh công (có) lông Vĩnh Phúc, Huế, Kon (Roxb. Tum, Gia Lai, Đắc Lắc, Lâm Đồng 19 Fissistigma Lãnh công lông mượt Hà Giang, Cao Bằng, vollosissimum Merr. Lạng Sơn, Quảng Ninh, Thái Nguyên, Bắc Giang, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An 20 Fissistigma macrulei Lãnh công lông đen Hà Tây, Thanh Hóa, Merr. Quảng Bình, Kon Tum, Gia Lai, Đắc 6 Lắc, Lâm Đồng 21 Fissistigma Lãnh công xám Sơn La, Yên Bái, glaucescens Quảng Ninh, Hòa Bình, Thanh Hóa, Quảng Trị, Quảng Nam, Khánh Hòa, Gia Lai.

22 Fissistigma Lãnh công tây Huế, Kon Tum, Gia taynguyenense Ban nguyên Lai, Đắc Lắc, Lâm Đồng 1. Giới thiệu về loài lãnh công rợt Fissistigma pallens (Fin. Phân bố Lãnh công rợt được phân bố ở một số vùng : Lào Cai (Phố Lu, Bắc Hà), Yên Bái (Bát Sát), Lạng Sơn (Hữu Lũng, Bắc Sơn), Bắc Cạn (Ba Bể), Quảng Ninh (Hà Cối, Chúc Phai), Phú Thọ (Cầu Hai), Hà Nội (Ba Vì, Thủ Pháp, Làng Cốc), Ninh Bình (Cúc Phương), Hoà Bình (Chợ Bờ, Núi Biều), Thanh Hoá (Yên Cát), Nghệ An (Phủ Quỳ, Kẻ Bọn, Quỳ Châu), Quảng Trị (Bến Trạm), Thừa Thiên Huế (Phú Lộc, Nam Đông), Lâm Đồng (Bảo Lộc, Lộc Nam). Ngoài ra còn có ở Trung Quốc (Quảng Đông).

Đặc điểm thực vật Cây leo thân gỗ cao tới 12 m, nhánh to không lông, đen đen. Lá có phiến to, nhẵn, cuống 2 cm. Gân bên 13-16 đôi. Hoa hay nhóm 3, đối diện với lá, cọng 4 cm, 3 cánh hoa trong ngắn.

Tâm bì nhiều, mang vào 30 noãn, gắn theo 2 hàng. Ra hoa tháng 2-7, có quả tháng 5-7. Công dụng theo kinh nghiệm dân gian Theo y học cổ truyền và kinh nghiệm dân gian, cây lãnh công rợt thường có tác dụng: 7 - Thân cành có tác dụng hoạt huyết, tiêu viêm. - Rễ chủ yếu dùng cho bệnh thấp khớp, thương tổn do lao động.

- Lá dùng cho để điều trị những chỗ bầm tím. Tổng quan các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Fissistigma Năm 1985, khi phân tích thành phần hóa học của loài Fissistigma oldhamii, Sheng-The Lu và cộng sự đã phân lập được 5 alkaloid là (-)- norannuradhapurine (1), (-)-calycinine (fissoldine) (2), (-)-anolobine (3), (-)- xylopine (4) và (+)-O-methylflavinantine (O-methylpallidine) (5). OCH3 O OCH3 H3CO H3CO NH O H N R1 R1 R2 R3 H3CO 1 OH OCH3 H R 2 H OCH3 OH N 3 H OH H O R3 4 H OCH3 H 5 R = CH3 6 H3CO 7 R=H R2 O Vào năm 1993, Wu và cộng sự đã phân tích thành phần hóa học loài loài F. oldhamii và đã phân lập được 5 hợp chất alkaloid: xylopine (4), calycinine (2), O-methylmoschatoline (6), N-methyl-2,3,6- trimethoxymorphinandien-7-one (5), và N-nor-2,3,6- trimethoxymorphinandien-7-one (7).

Năm 1994, cũng từ loài này Wu đã phân lập được 1 hợp chất alkaloid mới có cấu trúc khung 4 vòng là fissoldhimine (8). Yi-Chen Chia và cộng sự cũng thông báo phân tích và cho biết sự có mặt 3 hợp chất mới fissohamione (9) và stigmahamone I (10) và stigmahamone II (11) từ dịch chiết MeOH của loài này. oldhamii, Yi-Chen Chia và cộng sự đã phân lập được 11 hợp chất aristolactam là stigmalactam (12), piperolactam A (13), piperolactam C (14), aristolactam AII (15), aristolactam AIIIa (16), aristolactam BII (17), aristolactam BIII (18), aristolactam FII (19), goniothalactam (20), enterocarpam I (21), velutinam (22) và 2 hợp chất dioxoaporphine là noraristolodione (23) và norcepharadione B (24). Các thử nghiệm in vitro cho biết các hợp chất trên đều có hoạt tính kháng ngưng kết tiểu cầu .