Tổng quan luận án

Xu hướng sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc từ thảo dược tự nhiên ngày càng gia tăng nhằm hạn chế các phản ứng bất lợi của thuốc tổng hợp hóa dược. Việt Nam sở hữu hệ thực vật phong phú với hơn 12.000 loài thực vật bậc cao, trong đó có khoảng 4.000 loài được ghi nhận sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền. Tuy nhiên, việc khai thác nguồn dược liệu vẫn còn nhiều hạn chế khi phần lớn cây thuốc chưa được nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học và tác dụng dược lý thực nghiệm để cung cấp các luận cứ khoa học cho quá trình hiện đại hóa dược phẩm.

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), loài thực vật thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae), được di thực từ Trung Quốc vào Việt Nam từ những năm 1960 và sinh trưởng tốt ở khu vực Tây Bắc. Rễ Đan sâm là vị thuốc kinh điển trong y học cổ truyền phương Đông, chủ yếu dùng trong điều trị bệnh tim mạch và thúc đẩy tuần hoàn máu. Những phát hiện về hoạt tính chống ung thư của các hợp chất nhóm tanshinon trong Đan sâm đã mở ra một hướng khảo sát sinh học mới. Do đặc điểm thành phần hóa học và tác dụng sinh học của dược liệu biến đổi phụ thuộc vào điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu tại vùng trồng, việc thiếu vắng các công trình nghiên cứu hệ thống về thành phần hóa học gắn liền với hoạt tính kháng ung thư của Đan sâm di thực tại Việt Nam chính là khoảng trống khoa học mà luận án tập trung giải quyết.

Luận án xác định 02 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Xác định được cấu trúc hóa học của một số hợp chất và hàm lượng các Tanshinon chính trong rễ Đan sâm.
  2. Đánh giá được tác dụng chống ung thư in vitro của cao chiết và các hợp chất phân lập từ rễ Đan sâm.

Về đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Toàn cây Đan sâm phục vụ công tác giám định thực vật học và rễ Đan sâm phục vụ nghiên cứu hóa học, sinh học; các dòng tế bào ung thư thực nghiệm từ Ngân hàng tế bào của Viện nghiên cứu RIKEN (Nhật Bản) bao gồm HL-60, U937, THP-1, Jurkat (ung thư máu), DLD-1, COLO 205, Caco-2, HCT-15 (ung thư ruột), PC-3, LNCaP FGC (ung thư tuyến tiền liệt), MCF-7 (ung thư vú) và HepG2 (ung thư biểu mô tế bào gan).
  • Phạm vi không gian: Mẫu thực vật và dược liệu thu hái tại Trạm nghiên cứu trồng cây thuốc Sa Pa, thị trấn Sa Pa, tỉnh Lào Cai (tiêu bản lưu trữ mã số TB-10654; mẫu dược liệu mã số ĐS-KYD-2016). Các thực nghiệm hóa học, chuẩn hóa và thử nghiệm sinh học được triển khai tại Viện Dược liệu, Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Kiểm nghiệm, Nghiên cứu dược và Trang thiết bị Y tế Quân đội cùng Đại học Quốc tế Nagasaki (Nhật Bản).
  • Phạm vi thời gian: Mẫu nghiên cứu thực vật và dược liệu rễ cây Đan sâm được thu thập tập trung vào tháng 10 năm 2016 (mẫu tiêu bản thực vật thu hái ngày 27/10/2016).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các tư liệu khoa học từ phân loại thực vật, thành phần hóa học đến dược lý thực nghiệm và lâm sàng của cây Đan sâm:

Đặc điểm thực vật và sinh thái

Loài Salvia miltiorrhiza Bunge thuộc chi Hoa xôn (Salvia), phân họ Nepetoideae, họ Hoa môi (Lamiaceae). Họ Lamiaceae gồm khoảng 250 chi và hơn 7.000 loài trên thế giới, trong đó tại Việt Nam ghi nhận trên 40 chi và 145 loài. Chi Salvia là một trong những chi lớn nhất với hơn 900 loài, riêng tại Việt Nam có 08 loài mang tên Xôn. Đan sâm là cây cỏ sống lâu năm, cao 30–80 cm, thân vuông có lông ngắn màu vàng trắng nhạt; lá kép mọc đối 3–5 lá chét; rễ hình trụ màu đỏ nâu đường kính 0,5–1,5 cm; cụm hoa mọc chùm dài 10–20 cm với hoa tràng xanh tím nhạt hai môi; quả nhỏ dài 3 mm, rộng 1,5 mm. Cây có nguồn gốc tự nhiên tại Trung Quốc (nhiều nhất ở Tứ Xuyên), Nhật Bản, Triều Tiên. Theo nghiên cứu của Viện Dược liệu, Đan sâm di thực vào Việt Nam sinh trưởng tốt ở cả vùng đồng bằng lẫn núi cao; chu kỳ sinh trưởng ở đồng bằng (Hà Nội, Phú Thọ) là 240 ngày cho năng suất cao hơn vùng núi cao (Sa Pa, Tam Đảo) có chu kỳ 330 ngày.

Thành phần hóa học đã công bố

Các công bố khoa học quốc tế ghi nhận gần 200 hợp chất từ Đan sâm, tập trung ở các nhóm chính:

  • Nhóm Diterpenoid: Gần 100 hợp chất (kí hiệu 1–99), chia thành 3 phân nhóm cấu trúc. Phân nhóm 1 gồm 41 hợp chất tanshinon mang nhóm mang màu ortho-naphthoquinon (vị trí 1,2-dion) tạo sắc đỏ đặc trưng như Tanshinon IIA (9), Tanshinon I (19), Cryptotanshinon (23), Miltiron (1), Tanshindiol A, B, C; đặc biệt có hợp chất dimer neo-przewaquinon A (37) cấu tạo từ hai đơn vị tanshinon IIA. Phân nhóm 2 gồm 22 hợp chất abietan diterpenoid mang nhóm mang màu para-naphthoquinon (vị trí 1,4-dion) như Danshenxinkun A–G (42–47, 59, 60), Sibiriquinon A, B (61, 62); Lin HC và cộng sự đã phân lập 02 hợp chất fatty tanshinon liên kết với acid oleic gồm oleoyl neocryptotanshinon (48) và oleoyl danshenxinkun A (50) có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu. Phân nhóm 3 gồm 36 diterpenoid khác (64–99) không mang khung naphthoquinon, tiêu biểu có ferruginol (64), sugiol (65), neotanshinlacton (68) và 05 hợp chất chứa nguyên tử nitơ hiếm gặp gồm salvianan (69), neosalvianen (70), salvianen (71), salviadion (72) và salviamin G (73).
  • Nhóm Acid phenolic thân nước: Có 35 hợp chất (100–134) gồm các acid monophenolic mang khung phenylpropanoid (C6-C3) hoặc vòng phenyl như danshensu (102), acid caffeic (100), acid isoferulic (101), acid protocatechuic (131) và các acid polyphenolic như acid rosmarinic (106), acid salvianolic A (117), B (127), C, D, E, F, G; magnesium lithospermat B (129) và ammonium-potassium lithospermat B (130) là hai dạng muối vô cơ - hữu cơ tự nhiên.
  • Các nhóm chất khác và tinh dầu: 12 hợp chất thuộc nhóm triterpenoid (acid ursolic, acid oleanolic), sterol (β-sitosterol, daucosterol), flavonoid (luteolin, baicalin), acid succinic và lignan; hoa Đan sâm chứa 33 thành phần tinh dầu bay hơi đã được định danh bằng sắc ký khí khối phổ (GC-MS).
Phân nhóm hóa học Số lượng hợp chất Đặc điểm cấu trúc nhận diện Hợp chất tiêu biểu
Diterpenoid Phân nhóm 1 41 Mang nhóm ortho-naphthoquinon (vị trí 1,2) Tanshinon IIA, Tanshinon I, Cryptotanshinon
Diterpenoid Phân nhóm 2 22 Mang nhóm para-naphthoquinon (vị trí 1,4) Danshenxinkun A-G, Sibiriquinon A, B
Diterpenoid Phân nhóm 3 36 Không chứa khung naphthoquinon; có cấu trúc chứa N Salvianan, Salviamin G, Ferruginol, Sugiol
Acid phenolic thân nước 35 Khung C6-C3, dẫn xuất danshensu, acid caffeic, dạng muối Acid salvianolic B, Danshensu, Magnesium lithospermat B
Nhóm chất khác 12 Triterpenoid, phytosterol, flavonoid, acid hữu cơ, lignan Acid ursolic, Luteolin, Baicalin, β-sitosterol
Tinh dầu (trong hoa) 33 Monoterpen, sesquiterpen, acid béo bay hơi Caryophyllen, Borneol acetat, Germacren B

Tác dụng chống ung thư

Các nghiên cứu in vitro và in vivo chỉ ra rằng Tanshinon I, Tanshinon IIA, Cryptotanshinon, Dihydrotanshinon I và Acid salvianolic B ức chế mạnh sự tăng sinh của nhiều dòng tế bào ung thư (vú, gan, phổi, ruột kết, dạ dày, tuyến tiền liệt, máu) thông qua cơ chế kích hoạt apoptosis nội sinh và ngoại sinh (tăng biểu hiện p53, p21, tỷ lệ Bax/Bcl-2, hoạt hóa caspase-3, caspase-8, caspase-9), ức chế chu kỳ tế bào ở các pha G0/G1, S hoặc G2/M, ngăn chặn các đường truyền tín hiệu PI3K/Akt/survivin và STAT3. Các hoạt chất này còn ức chế xâm lấn, di căn nhờ giảm MMP-2, MMP-9, NF-κB, uPA và ngăn chặn hình thành mạch máu tân tạo thông qua điều hòa VEGF và HIF-1α. Trên lâm sàng, Wu W (2016) cùng các thử nghiệm có đối chứng ghi nhận chế phẩm Đan sâm dạng tiêm hoặc Tanshinon IIA dạng uống (30 mg × 2 lần/ngày) và truyền tĩnh mạch (80 mg/ngày) mang lại hiệu quả thuyên giảm hoàn toàn bệnh lơ xê mi cấp thể tiền tủy bào kháng thuốc và giảm nguy cơ tái phát sau phẫu thuật ung thư biểu mô gan.

Khoảng trống nghiên cứu

Mặc dù dữ liệu quốc tế về Đan sâm rất phong phú, các nghiên cứu tại Việt Nam trước thời điểm thực hiện đề tài chỉ dừng lại ở việc di thực, khảo sát nông học và ứng dụng y học cổ truyền theo kinh nghiệm. Chưa có công trình khoa học nào công bố đầy đủ về quy trình chiết xuất, phân lập hợp chất, phương pháp định lượng đồng thời các tanshinon chính bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao và đánh giá cơ chế ức chế tế bào ung thư in vitro trên nguồn dược liệu Đan sâm trồng tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm tiếp cận

Luận án vận dụng lý thuyết hóa thực vật và dược lý học phân tử hiện đại. Con đường sinh tổng hợp diterpenoid quinon được xác định đi qua tiền chất mevalonat và methylerythritol phosphat, trong khi các acid phenolic đi qua con đường phenylpropanoid và tyrosine. Hoạt tính chống ung thư được khảo sát dựa trên lý thuyết về chu trình tế bào và quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis) gồm cả con đường nội sinh liên quan đến biến đổi màng ty thể và con đường ngoại sinh thông qua các thụ thể bề mặt.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Thẩm định tên khoa học

Thực hiện quan sát, mô tả hình thái thực vật tại thực địa và phòng thí nghiệm, làm tiêu bản mẫu cây, đối chiếu với khóa phân loại thực vật trong Thực vật chí Trung Quốc, Từ điển cây thuốc Việt Nam và Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Mẫu cây được giám định bởi PGS. Phạm Thanh Huyền tại Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu.

2. Phương pháp hóa học

  • Chiết xuất và phân đoạn: Rễ khô được xay nhỏ, chiết siêu âm với ethanol 80% ở 40°C, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm được cao chiết tổng. Tiến hành chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với n-hexan, ethyl acetat và n-butanol.
  • Phân lập hợp chất: Sắc ký cột pha thuận sử dụng chất hấp phụ silica gel 60 (cỡ hạt 63–200 µm, Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản) và sắc ký cột pha đảo sử dụng ODS-A/RP-18 gel (30–50 µm, YMC Co., Nhật Bản). Kiểm tra dịch phân đoạn và độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng tráng sẵn silica gel F254 và RP18 F254 (Merck), phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 365 nm hoặc phun thuốc thử acid sulfuric (H2SO4) 10% trong cồn rồi hơ nóng.
  • Xác định cấu trúc hóa học: Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy Stuart SMP3; góc quay cực trên máy JASCO P-1020 Polarimeter; phổ UV-Vis trên máy UV-VIS Carry 80; phổ khối lượng ESI-MS trên hệ thống Agilent 1260 LC-MS/MS; phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS trên máy Agilent 910 TQ-FTMS; phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D NMR (1H-NMR đo ở 400 MHz và 500 MHz; 13C-NMR đo ở 100 MHz và 125 MHz) trên máy JEOL ECX 400 và Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer trong dung môi CDCl3 hoặc CD3OD.
  • Xây dựng quy trình định lượng HPLC: Sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu SPD-10AVP và HEWLETT-PACKARD 1100 (đầu dò DAD). Cột phân tích Phenomenex Luna 5u C18 100A (150 mm × 4,6 mm, 5 µm) có gắn cột bảo vệ Phenomenex C18 (4 mm × 30 mm ID). Pha động gồm Kênh A (nước chứa H3PO4 0,01%, pH ≈ 3,3) và Kênh B (acetonitril/methanol tỷ lệ 2/1, v/v). Chế độ gradient dung môi: 0–7,5 phút (70–95% B), 7,5–10 phút (95% B), 10–11 phút (95–70% B), 11–13 phút (70% B). Tốc độ dòng 1,5 mL/phút, nhiệt độ cột 25°C, thể tích tiêm 10 µL, bước sóng phát hiện 270 nm. Phương pháp được thẩm định các chỉ tiêu độ tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, LOD và LOQ theo hướng dẫn của ICH.

3. Phương pháp đánh giá tác dụng sinh học

  • Đánh giá khả năng ức chế tế bào ung thư: Sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ quang phổ MTT trên 12 dòng tế bào ung thư nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS. Tế bào được ủ với các nồng độ mẫu thử trong 24 giờ và 48 giờ. Mật độ quang được đo ở bước sóng 595 nm trên máy microplate reader. Mitoxantrone (độ tinh khiết ≥ 98%) làm chất đối chứng dương.
  • Phân tích hình thái nhân: Nhuộm nhân tế bào bằng thuốc nhuộm huỳnh quang Hoechst 33258 sau khi cố định tế bào bằng glutaraldehyde 1%, quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
  • Đánh giá phân mảnh DNA: Phân tách acid nhân bằng điện di trên gel agarose 2%, nhuộm ethidium bromid và quan sát sự phân mảnh dưới ánh sáng tử ngoại.
  • Phân tích Western Blot: Tách chiết protein màng và tế bào chất, điện di trên gel SDS-PAGE, chuyển lên màng lai PVDF. Ủ màng với kháng thể sơ cấp kháng caspase-3, caspase-8, caspase-9, sau đó ủ kháng thể thứ cấp liên hợp peroxidase và phát hiện tín hiệu bằng dung dịch Chemi-Lumi One L.
  • Đánh giá chức năng màng ty thể: Nhuộm tế bào bằng thuốc nhuộm huỳnh quang JC-1 và quan sát điện thế màng ty thể trên hệ thống kính hiển vi quét laser FV10i (Olympus). Tách phân đoạn ty thể và dịch nội bào bằng kỹ thuật siêu ly tâm ở tốc độ 100.000 × g trong 60 phút ở 4°C để kiểm tra sự giải phóng protein.

4. Nguồn dữ liệu và xử lý số liệu

Dữ liệu thu nhận từ các phép đo độc lập lặp lại ít nhất 3 lần. Số liệu được phân tích thống kê bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2016 và GraphPad Prism 6. Các đại lượng tính toán gồm giá trị trung bình, độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Ngưỡng có ý nghĩa thống kê được xác lập tại mức p < 0,05.

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề

Phần mở đầu thiết lập tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu từ sự kết hợp giữa tài nguyên dược liệu bản địa và nhu cầu phát triển thuốc kháng ung thư. Phần này công bố tên đề tài, đặt ra 02 mục tiêu khoa học cụ thể và vạch rõ 3 cụm nội dung nghiên cứu bao gồm: Thẩm định tên khoa học của mẫu nghiên cứu, Nghiên cứu về hóa học (chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc và định lượng HPLC các tanshinon) và Nghiên cứu tác dụng chống ung thư (thử nghiệm độc tính tế bào, nghiên cứu cơ chế apoptosis ở cấp độ tế bào và cấp độ phân tử).

Chương 1: Tổng quan

Chương tổng quan tập hợp các cơ sở dữ liệu học thuật toàn diện về đối tượng nghiên cứu:

  • Hệ thống hóa phân loại thực vật học, sinh thái, vùng phân bố của Đan sâm tại Trung Quốc, Nhật Bản và quá trình di thực, phát triển giống tại Việt Nam từ thập niên 1960.
  • Khảo cứu thành phần hóa học với gần 200 hợp chất đã biết: chi tiết hóa cấu trúc 99 diterpenoid (phân loại thành 3 nhóm rõ rệt dựa trên sự hiện diện và vị trí của nhóm quinon cũng như dị vòng N), 35 dẫn xuất acid phenolic (danshensu, acid salvianolic A–G, magnesium lithospermat B), 12 hợp chất thuộc các nhóm triterpenoid, flavonoid, sterol và 33 thành phần tinh dầu hoa.
  • Rà soát kinh nghiệm sử dụng Đan sâm trong y học cổ truyền Việt Nam (qua các bài thuốc trị bệnh gan, suy tim, khớp, thần kinh trong tài liệu của Võ Văn Chi, Đỗ Tất Lợi, Viện Dược liệu) và y học cổ truyền thế giới (Thần nông bản thảo kinh, Dược điển Trung Quốc 2015, chế phẩm Fufang Đan sâm, Guanxin Đan sâm).
  • Phân tích cơ chế kháng ung thư của các hợp chất nhóm tanshinon (Tanshinon I, Tanshinon IIA, Cryptotanshinon, Dihydrotanshinon I) và acid salvianolic trên các mô hình in vitro, in vivo (IDC-xenografted, MDA-MB-231 xenograft, u phổi H1299) và các bằng chứng điều trị lâm sàng trên người bệnh ung thư máu.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này quy định chuẩn mực thực nghiệm và thiết kế kỹ thuật:

  • Cung cấp lý lịch mẫu nghiên cứu: tiêu bản thực vật mã số TB-10654 thu hái ngày 27/10/2016 tại Sa Pa; lô dược liệu rễ thu hái tháng 10/2016 mã số ĐS-KYD-2016 khối lượng 10 kg. Liệt kê 12 dòng tế bào ung thư chuẩn được cung cấp từ Ngân hàng tế bào RIKEN (Nhật Bản).
  • Mô tả toàn bộ danh mục hóa chất, chất chuẩn (Tanshinon I lô BCBS1432V hàm lượng 98,0%; Tanshinon IIA lô BCBT9460 hàm lượng 98,0%; Cryptotanshinon lô 116M4756V hàm lượng 98,0%), dung môi sắc ký và trang thiết bị đo đạc vật lý, phổ kế (NMR, HR-ESI-MS, UV, HPLC).
  • Chi tiết hóa quy trình công nghệ chiết xuất siêu âm, phân đoạn lỏng - lỏng, kỹ thuật sắc ký cột silica gel pha thuận và pha đảo ODS-A/RP-18.
  • Xây dựng thông số vận hành quy trình sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-DAD định lượng đồng thời 3 tanshinon trên cột Phenomenex Luna C18:
Thời gian (phút) Tỷ lệ Kênh B: Acetonitril/Methanol (2/1; v/v) (%) Tỷ lệ Kênh A: Nước chứa H3PO4 0,01% (%)
0 – 7,5 70 → 95 30 → 5
7,5 – 10 95 5
10 – 11 95 → 70 5 → 30
11 – 13 70 30
  • Mô tả chi tiết kỹ thuật nuôi cấy tế bào, thử nghiệm MTT, phương pháp nhuộm huỳnh quang Hoechst 33258, quy trình ly giải và điện di DNA trên gel agarose 2%, kỹ thuật Western Blot phát hiện enzym caspase-3, -8, -9, kỹ thuật đánh giá điện thế ty thể bằng thuốc nhuộm JC-1 và phương pháp ly tâm phân đoạn siêu tốc (100.000 × g) tách dịch nội bào và ty thể.

Chương 3: Thực nghiệm và kết quả

Chương này trình bày các kết quả thực nghiệm thu được:

  • Thẩm định thực vật học: Xác nhận mẫu cây nghiên cứu thu tại Sa Pa (Lào Cai) có đầy đủ các đặc điểm hình thái và giải phẫu đặc trưng của loài Salvia miltiorrhiza Bunge, thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae). Mẫu tiêu bản TB-10654 được giám định bởi chuyên gia phân loại thực vật PGS. Phạm Thanh Huyền và được lưu giữ tại Viện Dược liệu cùng Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội.
  • Chiết xuất và phân đoạn: Từ 500 g rễ khô (độ ẩm 8,3%), chiết siêu âm với ethanol 80% thu được 122,3 g cao chiết tổng. Từ 100 g cao tổng hòa tan trong nước (500 mL) và chiết phân bố lần lượt với các dung môi thu được: phân đoạn n-hexan (Hex, 6,1 g), phân đoạn ethyl acetat (EtOAc, 26,4 g) và phân đoạn n-butanol (BuOH, 21,2 g).
  • Phân lập các hợp chất từ phân đoạn n-hexan: Sử dụng 6,0 g cao Hex đưa lên cột sắc ký silica gel (50 mm × 300 mm), rửa giải bằng hệ dung môi Hex-EtOAc (5:1, v/v, thể tích 2.500 mL), phân tách được 7 phân đoạn ký hiệu từ H1 đến H7.
  • Phân lập các hợp chất từ phân đoạn EtOAc: Sử dụng 25 g cao EtOAc đưa lên cột sắc ký silica gel (kích thước đường kính trong 85 mm × chiều cao 90 mm), rửa giải gradient dung môi Hex-EtOAc (tỷ lệ thể tích 5:1 → 0:1, thể tích 400 mL cho mỗi phân đoạn), thu được 7 phân đoạn ký hiệu từ E1 đến E7. Tiếp tục lấy phân đoạn E5 (khối lượng 8,3 g) đưa lên cột silica gel (50 mm × 350 mm), rửa giải bằng hệ dung môi chloroform - methanol (CHCl3-MeOH, 15:1, v/v, thể tích 1.200 mL), tách ra được 6 phân đoạn nhỏ (E5.1 đến E5.6) dựa trên sắc ký lớp mỏng. Phân đoạn nhỏ E5.2 (khối lượng 230 mg) tiếp tục được tinh chế qua cột pha đảo C18 (20 mm × 400 mm) với pha động MeOH-H2O (7:2, v/v, thể tích 450 mL), qua đó thu nhận được hợp chất số 7.

Kết quả và những đóng góp mới

Dựa trên các nội dung thực nghiệm được công bố trong văn bản, luận án đạt được các kết quả và đóng góp khoa học cụ thể sau:

Đóng góp về mặt lý luận và khoa học

  • Thẩm định chính xác tên khoa học của mẫu Đan sâm di thực trồng tại Trạm nghiên cứu trồng cây thuốc Sa Pa (Lào Cai) là Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Hoa môi (Lamiaceae), thiết lập và lưu trữ bộ tiêu bản chuẩn mang mã số TB-10654 tại hai cơ sở nghiên cứu chuyên ngành ở Việt Nam.
  • Thiết lập quy trình phân đoạn hóa học có hệ thống từ rễ Đan sâm Việt Nam: từ cao ethanol tổng phân tách thành các phân đoạn n-hexan, ethyl acetat và n-butanol; phân đoạn thành công 7 phân đoạn chính từ cao n-hexan (H1–H7) và 7 phân đoạn chính từ cao ethyl acetat (E1–E7).
  • Tinh chế thành công hợp chất tinh khiết (chất số 7) từ phân đoạn nhỏ E5.2 thông qua việc kết hợp sắc ký cột pha thuận silica gel và sắc ký cột pha đảo C18.
  • Xây dựng quy trình phân tích định lượng đồng thời 3 tanshinon chính (Tanshinon I, Tanshinon IIA, Cryptotanshinon) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-DAD trên cột pha đảo Phenomenex Luna C18 sử dụng chương trình gradient dung môi acid phosphoric loãng và hỗn hợp acetonitril/methanol, được thẩm định theo hướng dẫn quốc tế ICH.
  • Xây dựng hoàn chỉnh chuỗi phương pháp thực nghiệm sinh học từ cấp độ tế bào (đo mật độ quang MTT, nhuộm huỳnh quang nhân Hoechst 33258) đến cấp độ phân tử (phân mảnh DNA, Western Blot định lượng caspase-3, -8, -9, màng ty thể JC-1) để đánh giá tác dụng kháng ung thư của dịch chiết và các hợp chất phân lập từ Đan sâm.

Kiến nghị và đề xuất giải pháp

  • Đề xuất ứng dụng quy trình phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao đã xây dựng vào công tác kiểm nghiệm tiêu chuẩn chất lượng và định lượng hoạt chất chính cho nguồn dược liệu Đan sâm trồng trong nước.
  • Tiếp tục mở rộng phân lập và giải mã cấu trúc hóa học của các hợp chất còn lại trong các phân đoạn H1–H7, E1–E7 và phân đoạn n-butanol để làm phong phú dữ liệu hóa học của cây Đan sâm tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Văn bản luận án cho thấy một số giới hạn và gợi mở các hướng nghiên cứu kế tiếp:

  • Phạm vi phân lập hợp chất: Các thực nghiệm phân lập trong văn bản mới dừng lại ở phân đoạn n-hexan (tách thành H1–H7) và phân đoạn ethyl acetat (tách thành E1–E7, phân đoạn phụ E5 thành E5.1–E5.6 và tinh chế thu nhận chất số 7 từ E5.2). Việc phân lập triệt để và giải mã đầy đủ cấu trúc hóa học của các phân đoạn còn lại chưa được hoàn tất trong phần văn bản này.
  • Phạm vi mô hình khảo nghiệm: Nghiên cứu tập trung chủ yếu vào các mô hình in vitro trên tế bào ung thư nuôi cấy nhân tạo, chưa mở rộng đánh giá hiệu lực trên các mô hình khối u ghép dị loài (xenograft) in vivo đối với các hợp chất tinh khiết phân lập từ nguồn mẫu Việt Nam.
  • Nguồn mẫu dược liệu: Mẫu thực vật khảo sát mới được thu thập tập trung tại một thời điểm (tháng 10/2016) và tại một địa điểm duy nhất (Trạm Sa Pa, Lào Cai), cần khảo sát thêm các thời điểm thu hái và các vùng sinh thái đồng bằng, trung du khác để có bức tranh so sánh toàn diện về hàm lượng hoạt chất.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật đối với các nhóm đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên ngành Dược học, Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Cung cấp tổng quan tài liệu chi tiết về phân loại diterpenoid quinon và acid phenolic; là tài liệu chuẩn mực về phương pháp phân đoạn, sắc ký cột pha thuận/pha đảo và xác định cấu trúc phân tử.
  • Các nhà nghiên cứu dược lý và ung thư thực nghiệm: Cung cấp quy trình chi tiết các bước thử nghiệm cơ chế chết tế bào apoptosis in vitro từ việc nhuộm nhân huỳnh quang, điện di DNA, đo huỳnh quang màng ty thể đến kỹ thuật lai Western Blot phát hiện enzym caspase.
  • Cán bộ kiểm nghiệm và quản lý chất lượng dược liệu: Tham khảo trực tiếp các thông số kỹ thuật tối ưu hóa của quy trình HPLC (pha động, chương trình gradient, bước sóng, loại cột) để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở định lượng đồng thời Tanshinon I, Tanshinon IIA và Cryptotanshinon trong rễ Đan sâm.

Câu hỏi thường gặp

1. Dược liệu rễ cây Đan sâm dùng trong thực nghiệm được thu hái ở đâu và có lý lịch như thế nào?

Dược liệu rễ Đan sâm được thu hái tại Trạm nghiên cứu trồng cây thuốc Sa Pa, thị trấn Sa Pa, tỉnh Lào Cai vào tháng 10 năm 2016, với khối lượng ban đầu là 10 kg. Dược liệu sau khi rửa sạch được sấy khô ở nhiệt độ 45–50°C, thái lát mỏng và lưu trữ tại Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội dưới mã số mẫu ĐS-KYD-2016. Tiêu bản thực vật toàn cây mang mã số TB-10654 được PGS. Phạm Thanh Huyền giám định tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge.

2. Các hợp chất diterpenoid trong rễ Đan sâm được chia thành những nhóm cấu trúc nào?

Gần 100 diterpenoid trong Đan sâm được chia thành 3 phân nhóm:

  • Phân nhóm 1: 41 hợp chất tanshinon mang nhóm mang màu ortho-naphthoquinon (vị trí 1,2-dion) như Tanshinon IIA, Tanshinon I, Cryptotanshinon.
  • Phân nhóm 2: 22 hợp chất abietan diterpenoid mang nhóm mang màu para-naphthoquinon (vị trí 1,4-dion) như Danshenxinkun A–G, Sibiriquinon A, B.
  • Phân nhóm 3: 36 hợp chất diterpenoid khác không có khung naphthoquinon mang màu, trong đó ghi nhận 5 hợp chất chứa dị vòng nitơ hiếm gặp gồm salvianan, neosalvianen, salvianen, salviadion và salviamin G.

3. Trong số các diterpenoid của Đan sâm, hợp chất nào tồn tại dưới dạng dimer và những hợp chất nào thuộc nhóm fatty tanshinon?

  • Hợp chất diterpenoid duy nhất tồn tại dưới dạng dimer là neo-przewaquinon A (chất số 37), được cấu tạo từ hai đơn vị monomer tanshinon IIA liên kết với nhau.
  • Hai hợp chất fatty tanshinon duy nhất được phát hiện là oleoyl neocryptotanshinon (chất số 48) và oleoyl danshenxinkun A (chất số 50), có cấu trúc gồm phân tử diterpen liên kết với chuỗi acid béo mạch dài (acid oleic).

4. Quy trình HPLC định lượng đồng thời các tanshinon chính sử dụng điều kiện sắc ký nào?

Quy trình HPLC sử dụng cột Phenomenex Luna C18 100A (150 mm × 4,6 mm, 5 µm) có cột bảo vệ Phenomenex C18 (4 mm × 30 mm ID); nhiệt độ cột duy trì ở 25°C; đầu dò UV đo tại bước sóng 270 nm; tốc độ dòng 1,5 mL/phút; thể tích tiêm 10 µL. Pha động gồm Kênh A là nước chứa H3PO4 0,01% (pH ≈ 3,3) và Kênh B là acetonitril/methanol (2/1; v/v), chạy theo chương trình gradient dung môi từ 70% đến 95% kênh B trong thời gian 13 phút.

5. Cơ chế gây chết tế bào ung thư theo chương trình (apoptosis) của các Tanshinon được khảo sát qua những chỉ dấu phân tử nào?

Các nghiên cứu tổng quan và thiết kế thực nghiệm của luận án ghi nhận cơ chế apoptosis của các hợp chất tanshinon (đặc biệt là Tanshinon I, IIA, Cryptotanshinon) được thực hiện thông qua: kích hoạt protein p53, p21, p27; giảm hoạt hóa cyclin D1, cyclin B1, CDK2, CDK4; tăng tỷ lệ biểu hiện protein Bax/Bcl-2; kích hoạt các enzym caspase-3, caspase-8, caspase-9; gây phân cắt cơ chất PARP; làm mất điện thế màng ty thể (thử nghiệm JC-1) và giải phóng cytochrom c; đồng thời ức chế các con đường truyền tín hiệu sinh tồn PI3K/Akt/survivin và STAT3.

Kết luận

Luận án đã thẩm định tên khoa học của mẫu Đan sâm di thực tại Sa Pa (Lào Cai) là loài Salvia miltiorrhiza Bunge thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae), gắn liền với việc đăng ký lưu trữ mẫu tiêu bản thực vật và dược liệu chuẩn. Nghiên cứu đã thiết lập quy trình chiết xuất siêu âm bằng ethanol 80%, phân đoạn lỏng - lỏng thu nhận các phân đoạn n-hexan, ethyl acetat, n-butanol và bước đầu phân lập thành công các phân đoạn phụ cùng hợp chất tinh khiết qua hệ thống sắc ký cột silica gel kết hợp pha đảo C18. Đồng thời, luận án đã xây dựng và thẩm định quy trình sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-DAD định lượng đồng thời ba tanshinon chính (Tanshinon I, Tanshinon IIA, Cryptotanshinon) và chuẩn hóa hệ thống phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế tế bào ung thư, phân tích cơ chế apoptosis ở cấp độ tế bào và phân tử. Các dữ liệu thực nghiệm đã cung cấp luận cứ khoa học cụ thể cho việc kiểm soát chất lượng và định hướng khai thác giá trị trị liệu của nguồn dược liệu Đan sâm trồng tại Việt Nam.