Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tác dụng chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết sâm vũ diệp và tam thất hoang trên in vitro

Nghiên cứu tác dụng chống đông máu của dịch chiết sâm vũ diệp và tam thất hoang trên in vitro, cung cấp thông tin quý giá cho y học.

• Tác giả: Nguyễn Thị Tuyết Trinh
• Người hướng dẫn: PGS. Dương Thị Ly Hương
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên cứu tác dụng chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Feng) trên in vitro
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Sinh lý quá trình đông máu
• 1.2. Điều hòa đông máu trong sinh lý
• 1.3. Rối loạn đông máu
• 1.4. Rối loạn bẩm sinh
• 1.5. Rối loạn mắc phải
• 1.6. Các xét nghiệm đông máu cơ bản
• 1.7. Thời gian Prothrombin. Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa
• 1.8. Định lượng fibrinogen
• 1.9. Tổng quan về Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
• 1.10. Tam thất hoang
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Kết quả thực nghiệm
• 3.2. Tam thất hoang
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về tác dụng chống đông máu của sâm vũ diệp và tam thất hoang

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Feng) là hai loài cây thuốc quý hiếm tại Việt Nam, đặc biệt ở vùng núi cao phía Tây Bắc. Nghiên cứu về tác dụng chống đông máu của chúng đang thu hút sự quan tâm của giới y học. Các nghiên cứu ban đầu cho thấy rằng các thành phần hóa học trong hai loài này có thể có tác dụng tích cực trong việc điều chỉnh quá trình đông máu. Việc tìm hiểu sâu về tác dụng của chúng không chỉ giúp bảo tồn nguồn tài nguyên thiên nhiên mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị các bệnh lý liên quan đến đông máu.

1.1. Đặc điểm sinh học của sâm vũ diệp và tam thất hoang

Sâm vũ diệp và tam thất hoang đều thuộc họ Ngũ gia bì, có chứa nhiều hợp chất sinh học quý giá. Sâm vũ diệp nổi bật với hàm lượng saponin cao, trong khi tam thất hoang cũng không kém cạnh với các thành phần có lợi cho sức khỏe. Việc nghiên cứu các đặc điểm này giúp hiểu rõ hơn về cơ chế tác dụng của chúng trong việc chống đông máu.

1.2. Tình hình nghiên cứu tác dụng chống đông máu hiện nay

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về tác dụng của các loại thảo dược trong việc điều trị bệnh, nhưng tác dụng chống đông máu của sâm vũ diệp và tam thất hoang vẫn còn hạn chế. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các phân đoạn dịch chiết từ hai loài này có thể ảnh hưởng đến thời gian đông máu, mở ra hướng đi mới cho việc phát triển thuốc chống đông từ thiên nhiên.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu tác dụng chống đông máu

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nhưng việc nghiên cứu tác dụng chống đông máu của sâm vũ diệp và tam thất hoang gặp phải một số thách thức. Đầu tiên, việc thu thập mẫu và chiết xuất các hợp chất từ hai loài này cần phải được thực hiện một cách chính xác để đảm bảo chất lượng. Thứ hai, cần có các phương pháp nghiên cứu hiện đại để đánh giá tác dụng của chúng một cách khách quan và khoa học.

2.1. Khó khăn trong việc thu thập mẫu và chiết xuất

Việc thu thập sâm vũ diệp và tam thất hoang trong tự nhiên không phải là điều dễ dàng do chúng đang có nguy cơ tuyệt chủng. Hơn nữa, quy trình chiết xuất cần phải được tối ưu hóa để đảm bảo thu được các hợp chất có hoạt tính sinh học cao nhất.

2.2. Thiếu hụt nghiên cứu khoa học về tác dụng sinh học

Mặc dù có nhiều tài liệu dân gian về tác dụng của sâm vũ diệp và tam thất hoang, nhưng thiếu các nghiên cứu khoa học chứng minh cụ thể. Điều này làm cho việc áp dụng chúng trong y học hiện đại gặp nhiều khó khăn.

III. Phương pháp nghiên cứu tác dụng chống đông máu

Để nghiên cứu tác dụng chống đông máu của sâm vũ diệp và tam thất hoang, các phương pháp in vitro đã được áp dụng. Các chỉ số như thời gian prothrombin (PT) và thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa (APTT) được sử dụng để đánh giá hiệu quả của các phân đoạn dịch chiết. Phương pháp này cho phép xác định rõ ràng tác dụng của từng phân đoạn trong việc điều chỉnh quá trình đông máu.

3.1. Quy trình chiết xuất các phân đoạn dịch chiết

Quy trình chiết xuất bao gồm việc sử dụng các dung môi khác nhau như ethanol, butanol và nước để thu được các phân đoạn dịch chiết khác nhau từ sâm vũ diệp và tam thất hoang. Mỗi phân đoạn sẽ được kiểm tra tác dụng chống đông máu riêng biệt.

3.2. Đánh giá tác dụng chống đông máu qua các chỉ số PT và APTT

Các chỉ số PT và APTT là những tiêu chí quan trọng để đánh giá khả năng chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết. Thí nghiệm sẽ được thực hiện trên mẫu máu in vitro để đảm bảo tính chính xác và khách quan trong kết quả.

IV. Kết quả nghiên cứu tác dụng chống đông máu

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các phân đoạn dịch chiết từ sâm vũ diệp và tam thất hoang có tác dụng rõ rệt trong việc điều chỉnh thời gian đông máu. Cụ thể, một số phân đoạn đã làm tăng thời gian PT và APTT, cho thấy khả năng chống đông máu tiềm năng. Những phát hiện này mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên trong điều trị các bệnh lý liên quan đến đông máu.

4.1. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ sâm vũ diệp

Các phân đoạn dịch chiết từ sâm vũ diệp cho thấy khả năng làm tăng thời gian APTT, cho thấy tác dụng chống đông máu rõ rệt. Điều này có thể liên quan đến hàm lượng saponin cao trong loài cây này.

4.2. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ tam thất hoang

Tương tự, các phân đoạn dịch chiết từ tam thất hoang cũng cho thấy tác dụng tích cực trong việc kéo dài thời gian đông máu. Kết quả này cho thấy tiềm năng của tam thất hoang trong việc phát triển thuốc chống đông máu từ thiên nhiên.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu tác dụng chống đông máu của sâm vũ diệp và tam thất hoang đã chỉ ra rằng hai loài cây này có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm chống đông máu từ thiên nhiên. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để xác định cơ chế tác dụng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất. Việc bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên thiên nhiên này cũng cần được chú trọng để đảm bảo sự bền vững cho tương lai.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc xác định các hợp chất hoạt tính sinh học cụ thể trong sâm vũ diệp và tam thất hoang, cũng như cơ chế tác dụng của chúng trong quá trình đông máu.

5.2. Tầm quan trọng của việc bảo tồn nguồn tài nguyên thiên nhiên

Việc bảo tồn sâm vũ diệp và tam thất hoang không chỉ giúp duy trì nguồn tài nguyên quý giá mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược liệu có giá trị trong tương lai.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Bệnh lý huyết khối là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong và tàn phế trên toàn cầu. Trong thực hành lâm sàng, các thuốc chống đông máu kinh điển như heparin và dẫn chất kháng vitamin K (như warfarin) giữ vai trò chủ đạo trong phòng ngừa và điều trị huyết khối tắc mạch. Mặc dù đạt hiệu quả điều trị cao, các hoạt chất này tồn tại nhiều hạn chế lâm sàng nghiêm trọng: khoảng điều trị hẹp, nguy cơ xuất huyết cao, phản ứng dị ứng, và đặc biệt là hội chứng giảm tiểu cầu do heparin (HIT). Xu hướng nghiên cứu y dược học hiện đại đang tập trung tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn gốc dược liệu tự nhiên nhằm phát triển các tác nhân chống đông máu an toàn hơn, hạn chế các tác dụng không mong muốn.

Việt Nam sở hữu nguồn tài nguyên thực vật phong phú, trong đó có hai loài sâm quý phân bố tự nhiên tại vùng núi cao Tây Bắc là Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Feng), đều thuộc chi Panax L., họ Ngũ gia bì (Araliaceae). Theo kinh nghiệm y học dân gian, cả hai loài đều có công dụng hoạt huyết, tán ứ, giảm đau và bổ máu. Tuy nhiên, các dẫn liệu khoa học thực nghiệm chứng minh tác dụng sinh học trên hệ đông máu của hai loài này còn rất hạn chế. Các công bố hóa thực vật trước đây chỉ ra rằng thân rễ của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang tích lũy hàm lượng lớn các saponin triterpenoid khung oleanan và dammaran. Đáng chú ý, các nghiên cứu quốc tế trên một số loài thuộc chi Panax L. đã bước đầu chứng minh nhóm hoạt chất saponin có khả năng can thiệp vào các mắt xích của chuỗi đông máu.

Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, đề tài khóa luận "Nghiên cứu tác dụng chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Feng) trên in vitro" được thực hiện với 02 mục tiêu cụ thể:

1. Xây dựng mô hình đánh giá tác dụng chống đông máu trên in vitro.
2. Nghiên cứu tác dụng chống đông máu trên in vitro của các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp và Tam thất hoang thông qua các chỉ số thời gian prothrombin (PT) và thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa (APTT).

Về đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng dược liệu: Thân rễ Sâm vũ diệp thu hái tại Sa Pa (tỉnh Lào Cai) vào tháng 3 năm 2016, mẫu tiêu bản mã số PB-001/2016 lưu giữ tại Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội; Thân rễ Tam thất hoang thu hái tự nhiên tại vùng sườn đông bắc dãy Hoàng Liên Sơn thuộc 6 xã của huyện Bát Xát và huyện Sa Pa (tỉnh Lào Cai).
• Đối tượng thử nghiệm sinh học: Mẫu huyết tương thu nhận từ máu tĩnh mạch của người tình nguyện khỏe mạnh (sinh viên Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội) từ 20 đến 25 tuổi, không có tiền sử bệnh lý đông máu và không dùng thuốc ảnh hưởng đến đông máu.
• Phạm vi thời gian và địa điểm: Khóa luận được hoàn thành vào tháng 6 năm 2017 tại Khoa Y - Dược (Đại học Quốc gia Hà Nội) và Khoa Xét nghiệm Huyết học, Bệnh viện 19.8 - Bộ Công An, nằm trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm vùng Tây Bắc (mã số KHCN-TB.07C/13-18).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết của nghiên cứu dựa trên mô hình dòng thác đông máu (cascade theory) được xây dựng từ năm 1979, mô tả quá trình đông máu qua ba giai đoạn liên hoàn: hình thành phức hợp prothrombinase, chuyển prothrombin thành thrombin, và chuyển fibrinogen hòa tan thành mạng lưới sợi fibrin không hòa tan dưới tác dụng xúc tác của thrombin. Sự hình thành phức hợp prothrombinase diễn ra qua hai con đường:

• Con đường ngoại sinh: Khởi động khi mô bị tổn thương giải phóng thromboplastin (yếu tố III) phối hợp với yếu tố VII và Ca2+ để hoạt hóa yếu tố X.
• Con đường nội sinh: Khởi động khi máu tiếp xúc bề mặt lạ hoặc collagen, hoạt hóa yếu tố XII, lần lượt qua yếu tố XI, IX, cùng phức hợp yếu tố VIIIh - Ca2+ - phospholipid tiểu cầu để hoạt hóa yếu tố X.

Để đánh giá hai con đường này, tác giả sử dụng hai xét nghiệm đông máu tiêu chuẩn:

• Thời gian Prothrombin (PT): Khảo sát thời gian đông huyết tương sau khi bổ sung thừa thromboplastin và calci, đánh giá các yếu tố đông máu con đường ngoại sinh (phức hệ prothrombin: II, V, VII, X).
• Thời gian Thromboplastin từng phần hoạt hóa (APTT): Khảo sát thời gian đông của huyết tương sau khi ủ với kaolin (hoạt hóa tiếp xúc) và cephalin (thay thế yếu tố 3 tiểu cầu) rồi phục hồi ion Ca2+, đánh giá chức năng đông máu con đường nội sinh (yếu tố XII, XI, IX, VIII, X, V, II, I).

Phương pháp điều chế mẫu thử thực nghiệm: Dược liệu khô được chiết hồi lưu 3 lần bằng ethanol 70% ở 70°C (tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1:7 đối với Sâm vũ diệp và 1:8 đối với Tam thất hoang), cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để thu cao tổng (ký hiệu PBT và PST). Từ cao tổng khuếch tán trong nước, tiến hành chiết phân bố lỏng - lỏng phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần:

• Sâm vũ diệp: Chiết lần lượt với ete, ethyl acetat, n-butanol; thu được cao ete (PBEt, 5,82 g; 6,1%), cao ethyl acetat (PBEA, 2,70 g; 2,8%) và cao n-butanol (PBBt, 21,70 g; 22,8%).
• Tam thất hoang: Chiết lần lượt với n-hexan, n-butanol, nước; thu được cao n-hexan (PSnH, 4,74 g; 0,47%), cao n-butanol (PSBt, 65,90 g; 6,6%) và phân đoạn nước được tinh chế qua cột sắc ký Diaion rửa giải bằng nước thu cao nước (PSW, 295,00 g; 0,61%).

Phương pháp thử nghiệm in vitro và nguồn dữ liệu:

• Mẫu máu toàn phần (3 ml) từ người tình nguyện được chống đông bằng natri citrat 3,8% (tỷ lệ 1:9 v/v), ly tâm tách huyết tương ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 phút.
• Đo thời gian đông máu trên hệ thống máy phân tích đông máu tự động ACL TOP500 (Instrumentation Laboratory, Mỹ) hoạt động theo nguyên lý đo quang học phát hiện ánh sáng tán xạ ở bước sóng 660 nm khi các sợi fibrin bắt đầu hình thành.
• Mẫu thử được pha trong dimethyl sulfoxide (DMSO) 1% rồi phân tán vào huyết tương để đạt nồng độ DMSO cuối cùng là 0,1%. Khảo sát dải nồng độ chất thử: 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 mg/ml (đối với một số phân đoạn sau, dải nồng độ điều chỉnh thành 1,0; 2,0; 5,0 mg/ml).
• Lô đối chứng: Mẫu trắng (nước cất), chứng âm (DMSO 0,1%), chứng dương (Heparin nồng độ 0,2 UI/ml).
• Phân tích thống kê: Mỗi nồng độ lặp lại 5 lần (n=5). Dữ liệu biểu diễn dạng số trung bình ± sai số chuẩn (Mean ± SE), phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) kết hợp kiểm định sau ANOVA (Tukey hoặc Dunnett T3) trên phần mềm SPSS 16, mức ý nghĩa p < 0,05.

Nghiên cứu tuân thủ Tuyên ngôn Helsinki về đạo đức y sinh học trên đối tượng người, được thông qua bởi Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu y sinh học Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1 - Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý luận về sinh lý đông cầm máu, phân tích chi tiết cơ chế kích hoạt các yếu tố zymogen thành enzym hoạt tính và sự hình thành phức hợp enzym prothrombinase, thrombin và polyme fibrin. Tác giả phân tích các hệ thống điều hòa đông máu tự nhiên (antithrombin III, protein C, protein S, chất ức chế con đường yếu tố mô TFPI) và các rối loạn đông máu bẩm sinh (Hemophilia A, B, C; bệnh Von Willebrand; thiếu hụt chất chống đông bẩm sinh) cùng rối loạn mắc phải (hội chứng đông máu nội mạc rải rác - DIC, giảm tổng hợp yếu tố đông máu do bệnh gan hoặc thiếu vitamin K, sự xuất hiện kháng đông lưu hành).

Chương này cũng trình bày đặc điểm dược lý của các nhóm thuốc chống đông lâm sàng (kháng vitamin K dẫn xuất coumarin/indandion, heparin tiêu chuẩn và heparin trọng lượng phân tử thấp, thuốc ức chế kết tập tiểu cầu) cùng các tác dụng phụ đi kèm. Các quy trình kỹ thuật xét nghiệm đông máu cơ bản (PT, APTT, định lượng fibrinogen) được mô tả chi tiết về nguyên lý phản ứng, giá trị tham chiếu sinh lý và các nguồn sai số thực nghiệm.

Phần cuối chương tổng thuật chi tiết đặc điểm thực vật học, vùng phân bố, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hai loài nghiên cứu. Trong Sâm vũ diệp, các nghiên cứu trước đã ghi nhận 23 hợp chất saponin (bao gồm 13 ginsenosid khung dammaran và 10 saponin khung oleanan như bifinosid A-C), polyacetylen, stigmasterol, beta-sitosterol. Ở Tam thất hoang, các công bố xác định sự hiện diện của stipuleanosid R1, R2, spinasaponin A methyl ester cùng các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3, Rd với độc tính cấp đường uống LD50 được ghi nhận là 8,8 g/kg.

Chương 2 - Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả tường minh quy trình nghiên cứu thực nghiệm và các biện pháp bảo đảm đạo đức y sinh:

• Thiết lập tiêu chuẩn chọn mẫu tình nguyện viên (tuổi 20-25, chỉ số đông máu bình thường, không hút thuốc, không mắc bệnh máu) và tiêu chuẩn loại trừ (máu vỡ hồng cầu, người hiến máu > 450 ml trong vòng 28 ngày trước đó). Quy trình lấy 3 ml máu tĩnh mạch lúc đói được thực hiện bởi cán bộ chuyên trách tại Khoa Xét nghiệm Huyết học, Bệnh viện 19.8.
• Trình bày sơ đồ chiết tách và hiệu suất thu hồi các phân đoạn cao Sâm vũ diệp (PBT, PBEt, PBEA, PBBt) và Tam thất hoang (PST, PSnH, PSBt, PSW) từ nguyên liệu thân rễ đạt chuẩn giám định.
• Mô tả nguyên lý hoạt động của máy ACL TOP500: nguồn phát ánh sáng đơn sắc LED truyền qua cuvet phản ứng chứa hỗn hợp huyết tương và thuốc thử; đầu dò quang ghi nhận sự biến thiên cường độ ánh sáng tán xạ vuông góc khi mạng fibrin xuất hiện và chuyển tín hiệu quang thành tín hiệu điện.
• Chuẩn hóa quy trình ủ và tỷ lệ phối trộn hóa chất: 450 µl huyết tương kết hợp 50 µl dịch thử (hoặc chất đối chứng), thời gian ủ 2-3 phút trước khi phân tích các chỉ số PT và APTT.

Chương 3 - Kết quả thực nghiệm và bàn luận

Chương 3 trình bày các số liệu đo lường cụ thể về ảnh hưởng của từng phân đoạn dịch chiết lên chỉ số đông máu ngoại sinh PT(s) và nội sinh APTT(s):

• Đối với Sâm vũ diệp: Cao tổng PBT không làm biến đổi có ý nghĩa thống kê cả PT và APTT ở tất cả các mức liều khảo sát (0,5 - 5,0 mg/ml, p > 0,05). Phân đoạn PBBt thể hiện hoạt tính mạnh nhất khi kéo dài APTT phụ thuộc nồng độ (đạt 43,80 ± 1,32 giây ở liều 2 mg/ml, p < 0,05 và 60,02 ± 2,83 giây ở liều 5 mg/ml, p < 0,01 so với chứng âm 35,54 ± 0,71 giây); đồng thời liều 5 mg/ml kéo dài PT lên 14,34 ± 0,51 giây (p < 0,01). Phân đoạn PBEA kéo dài APTT trên dải nồng độ rộng (1, 2 và 5 mg/ml, p < 0,001), và kéo dài PT ở mức liều 5 mg/ml (12,24 ± 0,10 giây, p < 0,05). Phân đoạn PBEt chỉ kéo dài APTT ở nồng độ cao 5 mg/ml (40,42 ± 0,76 giây, p < 0,001). Thứ tự tác dụng kéo dài APTT của Sâm vũ diệp: PBBt > PBEA > PBEt > PBT.
• Đối với Tam thất hoang: Cao tổng PST và phân đoạn phân cực kém PSnH không làm thay đổi có ý nghĩa thống kê cả hai chỉ số ở các liều thử nghiệm (p > 0,05). Phân đoạn PSBt kéo dài mạnh APTT ở liều 2 mg/ml (44,78 ± 0,61 giây, p < 0,001) và liều 5 mg/ml (63,78 ± 1,53 giây, p < 0,001 so với chứng âm 36,68 ± 0,88 giây); liều 5 mg/ml cũng kéo dài nhẹ PT (14,94 ± 0,53 giây, p < 0,05). Phân đoạn PSW kéo dài APTT tại mức liều 5 mg/ml (41,00 ± 0,98 giây, p < 0,01). Thứ tự tác dụng kéo dài APTT của Tam thất hoang: PSBt > PSW > PSnH/PST.
• Bàn luận: Tác giả luận giải việc lựa chọn Heparin 0,2 UI/ml làm chứng dương là phù hợp do hoạt hóa antithrombin III tác dụng trực tiếp in vitro, trong khi các thuốc kháng vitamin K không có tác dụng in vitro vì cơ chế gián tiếp qua gan. Tác dụng chống đông của hai dược liệu tập trung chủ yếu vào con đường đông máu nội sinh. Hoạt tính tập trung cao ở phân đoạn n-butanol và ethyl acetat - vốn là các dung môi phân cực hòa tan chọn lọc saponin triterpenoid. Sự phân tán hoạt tính ở cao tổng cồn 70% được giải thích do sự hiện diện của nhiều nhóm tạp chất như sterol, dầu béo, đường khử. Tác giả đối chiếu kết quả với các nghiên cứu của Li C. (2013) và Lau A. (2009) trên Panax notoginseng và Panax ginseng, chỉ ra sự khác biệt về khoảng liều và tác động chuyên biệt trên từng chỉ số do sự sai khác về dung môi chiết và cấu trúc thành phần saponin.

Chương 4 - Kết luận và đề xuất

Chương 4 đúc kết các phát hiện then chốt tương ứng với hai mục tiêu ban đầu, xác nhận đã xây dựng thành công mô hình thử nghiệm in vitro chuẩn hóa trên máy ACL TOP500 và chứng minh tác dụng chống đông máu của các phân đoạn chiết Sâm vũ diệp và Tam thất hoang, chủ yếu qua con đường nội sinh. Tác giả đề xuất các định hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm phân lập các saponin tinh khiết từ phân đoạn n-butanol và ethyl acetat để kiểm tra hoạt tính đơn chất.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã cung cấp hệ thống số liệu định lượng về tác dụng kéo dài thời gian đông máu in vitro của các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên huyết tương người bình thường (n=5 cho mỗi lô thử nghiệm).

Đối tượng thử nghiệm	Nhóm / Liều thử nghiệm	Chỉ số PT (giây)	Chỉ số APTT (giây)	Mức ý nghĩa thống kê so với DMSO 0,1%
Nhóm đối chứng	Nước cất (mẫu trắng)	11,40 - 11,90	34,20 - 36,24	-
	DMSO 0,1% (chứng âm)	11,50 - 11,92	34,52 - 36,68	-
	Heparin 0,2 UI/ml (chứng dương)	11,64 - 12,22	48,88 - 75,80	p < 0,05 đến p < 0,001 (APTT)
Sâm vũ diệp (SVD)	Cao tổng PBT (0,5 - 5 mg/ml)	11,76 - 12,04	34,62 - 36,80	p > 0,05 (không thay đổi)
	Cao n-butanol PBBt (2 mg/ml)	12,24 ± 0,26	43,80 ± 1,32	p < 0,05 (APTT)
	Cao n-butanol PBBt (5 mg/ml)	14,34 ± 0,51	60,02 ± 2,83	p < 0,01 (cả PT và APTT)
	Cao ethyl acetat PBEA (1 mg/ml)	11,16 ± 0,06	40,06 ± 0,55	p < 0,001 (APTT)
	Cao ethyl acetat PBEA (2 mg/ml)	11,50 ± 0,19	42,42 ± 0,51	p < 0,001 (APTT)
	Cao ethyl acetat PBEA (5 mg/ml)	12,24 ± 0,10	43,40 ± 0,64	p < 0,05 (PT); p < 0,001 (APTT)
	Cao ete PBEt (5 mg/ml)	11,58 ± 0,18	40,42 ± 0,76	p < 0,001 (APTT)
Tam thất hoang (TTH)	Cao tổng PST (0,5 - 5 mg/ml)	11,34 - 11,60	34,48 - 37,82	p > 0,05 (không thay đổi)
	Cao n-hexan PSnH (1 - 5 mg/ml)	11,24 - 11,56	35,62 - 36,28	p > 0,05 (không thay đổi)
	Cao n-butanol PSBt (2 mg/ml)	12,66 ± 0,37	44,78 ± 0,61	p < 0,001 (APTT)
	Cao n-butanol PSBt (5 mg/ml)	14,94 ± 0,53	63,78 ± 1,53	p < 0,05 (PT); p < 0,001 (APTT)
	Cao nước PSW (5 mg/ml)	11,16 ± 0,16	41,00 ± 0,98	p < 0,01 (APTT)

Những đóng góp khoa học chính mà tác giả đã đạt được:

• Xây dựng thành công quy trình thử nghiệm đánh giá tác dụng chống đông máu in vitro ứng dụng kỹ thuật đo độ tán xạ quang học trên máy xét nghiệm tự động ACL TOP500, loại bỏ được sai số chủ quan của phương pháp quan sát thủ công truyền thống.
• Cung cấp dữ liệu thực nghiệm đầu tiên khẳng định các phân đoạn dịch chiết của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang thu hái tại Lào Cai có tác dụng chống đông máu in vitro, tạo cơ sở khoa học bước đầu chứng minh kinh nghiệm dân gian về công dụng hoạt huyết, tán ứ của hai loài cây thuốc quý này.
• Xác định được phân đoạn hoạt tính ưu tiên: phân đoạn chiết bằng dung môi n-butanol ở cả hai loài thể hiện tác dụng kéo dài APTT mạnh nhất (kéo dài trên 60 giây ở liều 5 mg/ml, tiệm cận hiệu lực của đối chứng Heparin 0,2 UI/ml); phân đoạn ethyl acetat của Sâm vũ diệp có khoảng nồng độ tác dụng rộng nhất (từ 1 đến 5 mg/ml). Kết quả này định hướng cụ thể việc lựa chọn dung môi phân cực trung bình và cao cho quá trình chiết xuất và phân lập hoạt chất tinh khiết.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận thẳng thắn chỉ ra các hạn chế trong quá trình thực hiện:

• Cỡ mẫu người tình nguyện và lượng huyết tương thu nhận trong mỗi lần lấy máu còn hạn chế, dẫn đến việc khảo sát mới dừng lại ở số lần lặp lại n=5 cho mỗi nồng độ.
• Nghiên cứu chưa tiến hành ủ thuốc thử với máu toàn phần để làm xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi nhằm theo dõi biến đổi về số lượng, thể tích, độ kết dính, độ vón hoặc hiện tượng vỡ của hồng cầu và tiểu cầu; do đó chưa đánh giá được toàn diện các tác dụng không mong muốn in vitro của các phân đoạn dịch chiết trên tế bào máu.
• Nghiên cứu chỉ mới dừng lại ở mức độ khảo sát tác dụng sinh học trên các phân đoạn dịch chiết thô; thành phần hóa học chi tiết trong từng phân đoạn chưa được phân tích định tính và định lượng đầy đủ, gây khó khăn cho việc biện giải sâu cơ chế phân tử và mối liên hệ cấu trúc - tác dụng.

Hướng nghiên cứu tiếp được đề xuất:

• Mở rộng phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất saponin tinh khiết từ hai phân đoạn có hoạt tính cao là n-butanol và ethyl acetat.
• Thử nghiệm đánh giá tác dụng chống đông máu chuyên biệt của từng hợp chất tinh khiết được phân lập để xác định rõ hoạt chất chịu trách nhiệm chính.
• Khảo sát độc tính tế bào và tác động của dịch chiết lên tiểu cầu trên mô hình máu toàn phần, tiến tới các thử nghiệm in vivo trên động vật thực nghiệm để khẳng định hiệu lực và độ an toàn sinh học.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên môn hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Dược học, Dược lý - Dược lâm sàng, Hóa thực vật và Y học cổ truyền quan tâm đến nhóm thực vật chi Panax L. và các hợp chất saponin có hoạt tính sinh học trên hệ tuần hoàn.
• Kỹ thuật viên xét nghiệm và nghiên cứu viên huyết học thực nghiệm trong việc tham khảo mô hình sàng lọc hoạt tính chống đông máu in vitro sử dụng hệ thống máy đo quang tự động ACL TOP500.

Các nội dung có giá trị tham khảo chuyên sâu trong tài liệu gồm:

• Quy trình chuẩn bị mẫu huyết tương người và kỹ thuật kiểm soát các điều kiện thực nghiệm (mẫu trắng nước cất, chứng âm DMSO 0,1%, chứng dương Heparin 0,2 UI/ml) để loại trừ sai số do dung môi.
• Sơ đồ chiết phân đoạn phân cực bậc thang từ thân rễ dược liệu (ete, ethyl acetat, n-butanol, n-hexan, nước) kèm số liệu hiệu suất thu hồi thực tế.
• Các bảng số liệu thực nghiệm đo thời gian PT và APTT chi tiết theo từng nồng độ, cung cấp cơ sở dữ liệu đối sánh cho các nghiên cứu phát triển sản phẩm từ Sâm vũ diệp và Tam thất hoang.

Câu hỏi thường gặp

1. Phân đoạn dịch chiết nào của hai loài dược liệu thể hiện tác dụng chống đông máu mạnh nhất?

Phân đoạn cao chiết bằng dung môi n-butanol của cả Sâm vũ diệp (PBBt) và Tam thất hoang (PSBt) đều thể hiện tác dụng chống đông máu in vitro mạnh nhất. Ở nồng độ 5 mg/ml, PBBt kéo dài thời gian APTT lên 60,02 ± 2,83 giây và PSBt kéo dài APTT lên 63,78 ± 1,53 giây (so với lô chứng âm tương ứng là 35,54 giây và 36,68 giây), đồng thời cả hai phân đoạn ở mức liều này đều kéo dài có ý nghĩa thống kê chỉ số thời gian ngoại sinh PT.

2. Tác dụng chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết chủ yếu tác động lên con đường nào trong chuỗi đông máu?

Các phân đoạn dịch chiết có hoạt tính của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang chủ yếu tác động kéo dài thời gian đông máu theo con đường nội sinh, thể hiện qua sự gia tăng có ý nghĩa thống kê của chỉ số APTT ở các dải nồng độ từ 1 đến 5 mg/ml. Con đường đông máu ngoại sinh (chỉ số PT) hầu như không bị ảnh hưởng ở nồng độ thấp và vừa, chỉ ghi nhận kéo dài khi thử nghiệm ở nồng độ cao 5 mg/ml đối với phân đoạn n-butanol và ethyl acetat.

3. Vì sao tác giả sử dụng Heparin 0,2 UI/ml làm chứng dương mà không sử dụng các thuốc kháng vitamin K như Warfarin?

Nghiên cứu được tiến hành trên mô hình in vitro (ngoài cơ thể). Heparin có cơ chế hoạt hóa trực tiếp antithrombin III sẵn có trong huyết tương để ức chế thrombin và các yếu tố đông máu hoạt hóa, do đó có tác dụng chống đông cả in vivo lẫn in vitro. Ngược lại, các thuốc kháng vitamin K (như warfarin) có cơ chế gián tiếp thông qua ức chế enzym epoxid-reductase tại tế bào gan để ngăn cản carboxyl hóa các tiền yếu tố đông máu (II, VII, IX, X), nên chỉ có tác dụng trong cơ thể sống (in vivo) mà không thể hiện tác dụng chống đông khi bổ sung trực tiếp vào huyết tương in vitro.

4. Tại sao cao tổng chiết bằng ethanol 70% không thể hiện tác dụng rõ rệt nhưng các phân đoạn chiết phân bố lại có hoạt tính?

Cao tổng ethanol 70% (PBT và PST) chứa hỗn hợp phức tạp của nhiều nhóm hợp chất thực vật khác nhau như saponin, sterol, triterpenoid tự do, dầu béo và đường khử tự do. Sự hiện diện đồng thời của nhiều nhóm chất không có hoạt tính hoặc hàm lượng saponin hoạt tính bị pha loãng trong cao tổng làm phân tán tác dụng sinh học. Khi thực hiện chiết phân bố lỏng - lỏng bằng các dung môi chọn lọc như n-butanol hoặc ethyl acetat, nhóm hoạt chất saponin được làm giàu và tập trung với nồng độ cao, giúp bộc lộ rõ rệt hoạt tính kéo dài thời gian đông máu trên in vitro.

5. Tiêu chuẩn lựa chọn và quy trình chuẩn bị mẫu huyết tương người trong nghiên cứu được tiến hành ra sao?

Người tình nguyện tham gia là sinh viên Khoa Y - Dược (Đại học Quốc gia Hà Nội) từ 20 đến 25 tuổi, có chỉ số PT và APTT cơ bản bình thường, không hút thuốc lá, không có tiền sử bệnh lý về máu và không dùng thuốc ảnh hưởng đến đông máu trong thời gian nghiên cứu. Máu tĩnh mạch (3 ml) được lấy vào buổi sáng sau khi tình nguyện viên nhịn ăn 12 giờ, đựng trong ống chứa chất chống đông natri citrat 3,8% theo tỷ lệ thể tích 1:9. Mẫu máu được ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 phút để thu nhận huyết tương nghèo tiểu cầu phục vụ phép đo quang học.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Tuyết Trinh đã xây dựng thành công mô hình sàng lọc tác dụng chống đông máu in vitro chuẩn hóa trên huyết tương người sử dụng máy phân tích đông máu quang học tự động ACL TOP500. Nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh các phân đoạn dịch chiết của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang thu hái tại Lào Cai có khả năng kéo dài thời gian đông máu in vitro, trong đó tác dụng tập trung chủ yếu vào con đường đông máu nội sinh thông qua chỉ số APTT. Hiệu lực chống đông thể hiện rõ rệt nhất ở phân đoạn chiết bằng dung môi n-butanol và phân đoạn ethyl acetat, mở ra định hướng khoa học quan trọng cho việc phân lập hoạt chất saponin tinh khiết và phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị rối loạn huyết khối từ hai loài sâm quý của Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, việc sử dụng các thuốc chống đông máu trong dự phòng và điều trị các bệnh do nguyên nhân huyết khối đóng vai trò rất quan trọng. Các thuốc chống đông máu nhƣ heparin, wafarin,. đều cho thấy hiệu quả điều trị tốt. Tuy nhiên mặt hạn chế của các thuốc này là có thể gây nhiều tác dụng phụ nhƣ: giảm tiểu cầu, dị ứng… [16].

Y- dƣợc học thế giới và trong nƣớc đang có xu hƣớng sử dụng các thuốc có nguồn gốc thực vật để nhằm hạn chế các tác dụng không mong muốn này. Việt Nam có hai loài sâm mọc tự nhiên ở vùng núi cao phía Tây Bắc là Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Feng) thuộc họ Ngũ gia bì - Araliace theo kinh nghiệm dân gian là có tác dụng giảm đau, hoạt huyết, bổ máu [13]. Tuy nhiên cho đến nay các nghiên cứu về tác dụng sinh học này còn rất hạn chế.

Cả 2 loài đều là những cây thuốc đặc biệt quý hiếm và đang có nguy cơ tuyệt chủng ở nƣớc ta. Các nghiên cứu ban đầu về thành phần hóa học của Sâm vũ diệp (SVD) và Tam thất hoang (TTH) cho thấy trong rễ và lá loài cây này có chứa saponin khung dammaran và oleanan với hàm lƣợng cao [50,57]. Đặc biệt, saponin trong một số cây thuộc chi Panax L. đã đƣợc chứng minh là có tác dụng trên chức năng đông máu [40,44].

Để làm rõ cơ sở khoa học và giá trị sử dụng của loài SVD và TTH, góp phần sử dụng hợp lý hóa tài nguyên thiên nhiên và áp dụng các giải pháp khoa học công nghệ nhằm phát triển dƣợc liệu của vùng, đặc biệt là nghiên cứu tác dụng trên quá trình đông máu, tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên in vitro”. Mục tiêu của đề tài là: - Xây dựng mô hình đánh giá tác dụng chống đông máu trên in vitro - Nghiên cứu tác dụng chống đông máu trên in vitro của các phân đoạn dịch chiết SVD và TTH thông qua các chỉ số PT và APTT 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1. Sinh lý quá trình đông máu Đông máu là trạng thái tự bảo vệ của cơ thể, là chuỗi các phản ứng hóa học của các yếu tố đông máu có trong huyết tƣơng, các mô tổn thƣơng và tiểu cầu [25,36,39]. Sau khi ra khỏi lòng mạch 2 - 4 phút, máu đông lại.

Trong máu và trong các mô có khoảng hơn 50 chất có ảnh hƣởng tới quá trình đông máu. Các chất kích thích quá trình gây đông máu gọi là các chất gây đông máu. Các chất ức chế quá trình gây đông máu gọi là các chất chống đông. Máu có đông hay không là phụ thuộc vào sự cân bằng giữa các chất gây đông máu và các chất chống đông máu.

Bình thƣờng, các chất chống đông máu chiếm ƣu thế, các chất gây đông ở dạng tiền chất không có hoạt tính, vì vậy máu không đông trong quá trình lƣu thông trong mạch máu. Khi máu, mạch máu bị tổn thƣơng, khi máu lấy ra ngoài cơ thể, các chất gây đông máu đƣợc hoạt hóa và trở nên ƣu thế, đông máu đƣợc thực hiện [11,15,25,36]. Định nghĩa Đông máu là quá trình chuyển máu ở thể lỏng sang thể đặc, mà thực chất là chuyển fibrinogen ở dạng hòa tan trong huyết tƣơng thành fibrin ở dạng không hòa tan dƣới xúc tác của thrombin [20,25]. Cơ chế đông máu Lý thuyết dòng thác đông máu từ năm 1979 [15] là sự hoạt hoá theo chuỗi từ các tiền yếu tố zymogen thành dạng enzym hoạt hoá.Quá trình đông máu diễn ra qua 3 giai đoạn (Hình 1.1) [20,25,36]: - Giai đoạn I: Hình thành phức hợp prothrombinase.

- Giai đoạn II: Hình thành thrombin. - Giai đoạn III: Hình thành fibrin. Sự hình thành phức hợp prothrombinase Khởi động cho cơ chế đông máu là sự hình thành phức hợp prothrombinase. Đây là một cơ chế rất phức tạp và kéo dài nhất của quá trình đông máu.

Quá trình đƣợc xảy ra khi có chấn thƣơng thành mạch và mô, khi 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] có chấn thƣơng máu, khi có sự tiếp xúc của máu với tế bào nội mạc tổn thƣơng hoặc với sợi collagen của mạch máu, với các mô khác ngoài nội mạc hoặc với bất kỳ vật lạ nào [39,47,51]. Phức hợp prothrombinase có tác dụng chuyển đổi prothrombin thành thrombin bằng sự phân cắt liên tục và đặc hiệu [25,51]. Cơ chế lắp ráp và chuyển đổi prothrombin thành thrombin có tầm quan trọng đối với sức khoẻ con ngƣời, bởi vì sự phát triển thrombin không đủ là nguyên nhân gây bệnh Hemophilia và kết quả sản xuất thrombin quá mức gây nên huyết khối [11,51,54]. Sơ đồ quá trình đông máu [15] Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo hai cơ chế ngoại sinh và nội sinh.

Cơ chế ngoại sinh xuất hiện nếu có chấn thƣơng thành mạch hoặc các mô kế cận. Cơ chế nội sinh xuất hiện nếu có chấn thƣơng máu hoặc máu lấy ra ngoài cơ thể từ lòng mạch. Các yếu tố tham gia đƣờng đông máu nội sinh có trong lòng mạch, còn một số yếu tố tham gia đƣờng đông máu ngoại sinh không tồn tại trong máu lƣu hành trong điều kiện sinh lý bình thƣờng. Cả 2 con đƣờng đều có sự tham gia của yếu tố X hoạt hóa (Xh), yếu tố V hoạt hóa 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] (Vh), phospholipid mô, các phospholipid tiểu cầu và Ca2+ để tạo thành phức hợp prothrombinase.

Các yếu tố tham gia vào quá trình đông máu hầu hết đƣợc tổng hợp tại gan và giải phóng vào huyết tƣơng dƣới dạng tiền chất không hoạt động. Có các yếu tố đông máu sau [25,51,54]: - Yếu tố I: Fibrinogen - Yếu tố II: Prothrombin - Yếu tố III: Thromboplastin của mô - Yếu tố IV: Ion Ca2+ - Yếu tố V: Proaccelerin - Yếu tố VII: Proconvertin - Yếu tố VIII: Globulin A chống ƣa chảy máu (antihemophilic globin - AHG). - Yếu tố IX: Globulin B chống ƣa chảy máu (plasma thromboplastin component - PTC). - Yếu tố X: Stuart - Prower - Yếu tố XI: Globulin C chống ƣa chảy máu (plasma thromboplastin antecedent - PTA).

- Yếu tố XII: Hageman - Yếu tố XIII: Yếu tố ổn định fibrin (fibrin stabilizing factor - FSF) Trƣớc đây các tác giả thấy rằng có 12 yếu tố đông máu đƣợc đặt tên bằng số Lamã. Sau này có sự thay đổi: một số yếu tố III, IV, VI không tƣơng ứng với một protein riêng biệt nào, đồng thời lại có một số yếu tố khác đƣợc phát hiện thêm nhƣ: prekellicrein, kininogen có trọng lƣợng phân tử cao [21].  Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế ngoại sinh Mô bị tổn thƣơng giải phóng thromboplastin (yếu tố III) và phospholipid từ màng tế bào mô. Yếu tố X đƣợc hoạt hoá (Xh) nhờ yếu tố III, yếu tố VIIh (yếu tố VII đƣợc hoạt hoá nhờ yếu tố III), ion Ca2+ và phospholipid.

Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xh có sự 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] tham gia của yếu tố Vh (yếu tố V đƣợc hoạt hoá nhờ thrombin), ion Ca2+ và phospholipid. Yếu tố Vh làm tăng hoạt tính của yếu tố Xh. Phospholipid đóng vai trò là chất nền còn ion Ca2+ làm cầu nối giữa các yếu tố (Hình 1.  Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế nội sinh Máu bị chấn thƣơng, máu tiếp xúc với collagen hoặc bề mặt vật lạ thì làm hoạt hoá yếu tố XII và giải phóng phospholipid tiểu cầu.

Yếu tố XIIh chuyển yếu tố XI thành yếu tố XIh (có sự tham gia của yếu tố Fletcher và Fitzgerald). Yếu tố XIh hoạt hóa yếu tố IX thành yếu tố IXh (có sự tham gia của yếu tố tiểu cầu). Yếu tố X đƣợc hoạt hoá có sự tham gia của yếu tố VIIIh (yếu tố VIII đƣợc hoạt hóa nhờ thrombin), yếu tố IXh, ion Ca2+ và phospholipid. Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xh có sự tham gia của phospholipid, yếu tố Vh (yếu tố V đƣợc hoạt hoá nhờ thrombin) và ion Ca2+.

Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế nội sinh chậm hơn rất nhiều (1 - 6 phút) so với cơ chế ngoại sinh (15 giây) (Hình 1. Sự hình thành thrombin Prothrombin là α2 - globulin có trong huyết tƣơng, do gan sản xuất, trọng lƣợng phân tử 68700, nồng độ trong máu bình thƣờng là 15mg/100ml máu [28,36,47]. Khi phức hợp prothrombinase hình thành nó sẽ chuyển prothrombin (yếu tố II), một zymogen không hoạt động thành thrombin (yếu tố IIh) [28,37]. Giai đoạn này cũng cần sự có mặt của ion Ca2+.

Sự hình thành thrombin từ prothrombin xảy ra trên bề mặt tiểu cầu và diễn ra rất nhanh, đƣợc tính bằng vài giây [11,28,37]. Thrombin là enzym trung tâm trong quá trình đông máu [28,37]. Số lƣợng thrombin đƣợc hình thành phải đủ lớn để đảm bảo cho quá trình đông máu nhƣng lại không đƣợc gây huyết khối [11,37]. Ngoài vai trò kích hoạt sự hình thành cục máu đông, thrombin đóng một vai trò điều chỉnh quan trọng trong quá trình đông máu.

Thrombin kết hợp với thrombomodulin hiện diện trên bề mặt tế bào nội bào tạo thành một phức hợp chuyển đổi protein C thành protein Ch (protein C hoạt hóa). Protein 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] đồng phân protein S và protein Ch làm suy giảm các yếu tố Vh và VIIIh, do đó hạn chế hoạt động của 2 yếu tố này trong chuỗi đông máu [28,37]. Sự hình thành fibrin Fibrinogen là một protein hòa tan trong huyết tƣơng do gan sản xuất, trọng lƣợng phân tử 340000, nồng độ trong máu bình thƣờng là 100 - 700mg/100ml máu [36]. Bình thƣờng do kích thƣớc phân tử lớn, fibrinogen rất khó vào dịch kẽ.

Khi thành mạch tăng tính thấm (mô bị viêm) thì fibrinogen vào dịch kẽ và bị đông lại do các yếu tố gây đông máu cùng vào dịch kẽ [25,47,54]. Thrombin sau khi đƣợc hình thành đã chuyển fibrinogen thành fibrin đơn phân. Các fibrin đơn phân tự trùng hợp thành fibrin ở dạng sợi. Một mạng lƣới fibrin đã hình thành và đƣợc ổn định nhờ yếu tố XIII (yếu tố XIII tạo liên kết cộng hóa trị giữa các sợi fibrin) [25,36,47].

Giai đoạn này cũng có sự tham gia của ion Ca2+. Khi mạng lƣới fibrin phát triển, các tế bào máu đƣợc giữ lại trên lƣới fibrin và tạo nên cục máu đông. Chính mạng lƣới này dính vào vị trí tổn thƣơng của thành mạch để ngăn cản sự chảy máu [11,25,36]. Mạng lƣới fibrin giam giữ hồng cầu [37].