ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, việc sử dụng các thuốc chống đông máu trong dự phòng và điều trị các bệnh do nguyên nhân huyết khối đóng vai trò rất quan trọng. Các thuốc chống đông máu nhƣ heparin, wafarin,. đều cho thấy hiệu quả điều trị tốt. Tuy nhiên mặt hạn chế của các thuốc này là có thể gây nhiều tác dụng phụ nhƣ: giảm tiểu cầu, dị ứng… [16].
Y- dƣợc học thế giới và trong nƣớc đang có xu hƣớng sử dụng các thuốc có nguồn gốc thực vật để nhằm hạn chế các tác dụng không mong muốn này. Việt Nam có hai loài sâm mọc tự nhiên ở vùng núi cao phía Tây Bắc là Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. Feng) thuộc họ Ngũ gia bì - Araliace theo kinh nghiệm dân gian là có tác dụng giảm đau, hoạt huyết, bổ máu [13]. Tuy nhiên cho đến nay các nghiên cứu về tác dụng sinh học này còn rất hạn chế.
Cả 2 loài đều là những cây thuốc đặc biệt quý hiếm và đang có nguy cơ tuyệt chủng ở nƣớc ta. Các nghiên cứu ban đầu về thành phần hóa học của Sâm vũ diệp (SVD) và Tam thất hoang (TTH) cho thấy trong rễ và lá loài cây này có chứa saponin khung dammaran và oleanan với hàm lƣợng cao [50,57]. Đặc biệt, saponin trong một số cây thuộc chi Panax L. đã đƣợc chứng minh là có tác dụng trên chức năng đông máu [40,44].
Để làm rõ cơ sở khoa học và giá trị sử dụng của loài SVD và TTH, góp phần sử dụng hợp lý hóa tài nguyên thiên nhiên và áp dụng các giải pháp khoa học công nghệ nhằm phát triển dƣợc liệu của vùng, đặc biệt là nghiên cứu tác dụng trên quá trình đông máu, tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết Sâm vũ diệp và Tam thất hoang trên in vitro”. Mục tiêu của đề tài là: - Xây dựng mô hình đánh giá tác dụng chống đông máu trên in vitro - Nghiên cứu tác dụng chống đông máu trên in vitro của các phân đoạn dịch chiết SVD và TTH thông qua các chỉ số PT và APTT 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1. Sinh lý quá trình đông máu Đông máu là trạng thái tự bảo vệ của cơ thể, là chuỗi các phản ứng hóa học của các yếu tố đông máu có trong huyết tƣơng, các mô tổn thƣơng và tiểu cầu [25,36,39]. Sau khi ra khỏi lòng mạch 2 - 4 phút, máu đông lại.
Trong máu và trong các mô có khoảng hơn 50 chất có ảnh hƣởng tới quá trình đông máu. Các chất kích thích quá trình gây đông máu gọi là các chất gây đông máu. Các chất ức chế quá trình gây đông máu gọi là các chất chống đông. Máu có đông hay không là phụ thuộc vào sự cân bằng giữa các chất gây đông máu và các chất chống đông máu.
Bình thƣờng, các chất chống đông máu chiếm ƣu thế, các chất gây đông ở dạng tiền chất không có hoạt tính, vì vậy máu không đông trong quá trình lƣu thông trong mạch máu. Khi máu, mạch máu bị tổn thƣơng, khi máu lấy ra ngoài cơ thể, các chất gây đông máu đƣợc hoạt hóa và trở nên ƣu thế, đông máu đƣợc thực hiện [11,15,25,36]. Định nghĩa Đông máu là quá trình chuyển máu ở thể lỏng sang thể đặc, mà thực chất là chuyển fibrinogen ở dạng hòa tan trong huyết tƣơng thành fibrin ở dạng không hòa tan dƣới xúc tác của thrombin [20,25]. Cơ chế đông máu Lý thuyết dòng thác đông máu từ năm 1979 [15] là sự hoạt hoá theo chuỗi từ các tiền yếu tố zymogen thành dạng enzym hoạt hoá.Quá trình đông máu diễn ra qua 3 giai đoạn (Hình 1.1) [20,25,36]: - Giai đoạn I: Hình thành phức hợp prothrombinase.
- Giai đoạn II: Hình thành thrombin. - Giai đoạn III: Hình thành fibrin. Sự hình thành phức hợp prothrombinase Khởi động cho cơ chế đông máu là sự hình thành phức hợp prothrombinase. Đây là một cơ chế rất phức tạp và kéo dài nhất của quá trình đông máu.
Quá trình đƣợc xảy ra khi có chấn thƣơng thành mạch và mô, khi 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com có chấn thƣơng máu, khi có sự tiếp xúc của máu với tế bào nội mạc tổn thƣơng hoặc với sợi collagen của mạch máu, với các mô khác ngoài nội mạc hoặc với bất kỳ vật lạ nào [39,47,51]. Phức hợp prothrombinase có tác dụng chuyển đổi prothrombin thành thrombin bằng sự phân cắt liên tục và đặc hiệu [25,51]. Cơ chế lắp ráp và chuyển đổi prothrombin thành thrombin có tầm quan trọng đối với sức khoẻ con ngƣời, bởi vì sự phát triển thrombin không đủ là nguyên nhân gây bệnh Hemophilia và kết quả sản xuất thrombin quá mức gây nên huyết khối [11,51,54]. Sơ đồ quá trình đông máu [15] Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo hai cơ chế ngoại sinh và nội sinh.
Cơ chế ngoại sinh xuất hiện nếu có chấn thƣơng thành mạch hoặc các mô kế cận. Cơ chế nội sinh xuất hiện nếu có chấn thƣơng máu hoặc máu lấy ra ngoài cơ thể từ lòng mạch. Các yếu tố tham gia đƣờng đông máu nội sinh có trong lòng mạch, còn một số yếu tố tham gia đƣờng đông máu ngoại sinh không tồn tại trong máu lƣu hành trong điều kiện sinh lý bình thƣờng. Cả 2 con đƣờng đều có sự tham gia của yếu tố X hoạt hóa (Xh), yếu tố V hoạt hóa 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com (Vh), phospholipid mô, các phospholipid tiểu cầu và Ca2+ để tạo thành phức hợp prothrombinase.
Các yếu tố tham gia vào quá trình đông máu hầu hết đƣợc tổng hợp tại gan và giải phóng vào huyết tƣơng dƣới dạng tiền chất không hoạt động. Có các yếu tố đông máu sau [25,51,54]: - Yếu tố I: Fibrinogen - Yếu tố II: Prothrombin - Yếu tố III: Thromboplastin của mô - Yếu tố IV: Ion Ca2+ - Yếu tố V: Proaccelerin - Yếu tố VII: Proconvertin - Yếu tố VIII: Globulin A chống ƣa chảy máu (antihemophilic globin - AHG). - Yếu tố IX: Globulin B chống ƣa chảy máu (plasma thromboplastin component - PTC). - Yếu tố X: Stuart - Prower - Yếu tố XI: Globulin C chống ƣa chảy máu (plasma thromboplastin antecedent - PTA).
- Yếu tố XII: Hageman - Yếu tố XIII: Yếu tố ổn định fibrin (fibrin stabilizing factor - FSF) Trƣớc đây các tác giả thấy rằng có 12 yếu tố đông máu đƣợc đặt tên bằng số Lamã. Sau này có sự thay đổi: một số yếu tố III, IV, VI không tƣơng ứng với một protein riêng biệt nào, đồng thời lại có một số yếu tố khác đƣợc phát hiện thêm nhƣ: prekellicrein, kininogen có trọng lƣợng phân tử cao [21]. Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế ngoại sinh Mô bị tổn thƣơng giải phóng thromboplastin (yếu tố III) và phospholipid từ màng tế bào mô. Yếu tố X đƣợc hoạt hoá (Xh) nhờ yếu tố III, yếu tố VIIh (yếu tố VII đƣợc hoạt hoá nhờ yếu tố III), ion Ca2+ và phospholipid.
Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xh có sự 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com tham gia của yếu tố Vh (yếu tố V đƣợc hoạt hoá nhờ thrombin), ion Ca2+ và phospholipid. Yếu tố Vh làm tăng hoạt tính của yếu tố Xh. Phospholipid đóng vai trò là chất nền còn ion Ca2+ làm cầu nối giữa các yếu tố (Hình 1. Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế nội sinh Máu bị chấn thƣơng, máu tiếp xúc với collagen hoặc bề mặt vật lạ thì làm hoạt hoá yếu tố XII và giải phóng phospholipid tiểu cầu.
Yếu tố XIIh chuyển yếu tố XI thành yếu tố XIh (có sự tham gia của yếu tố Fletcher và Fitzgerald). Yếu tố XIh hoạt hóa yếu tố IX thành yếu tố IXh (có sự tham gia của yếu tố tiểu cầu). Yếu tố X đƣợc hoạt hoá có sự tham gia của yếu tố VIIIh (yếu tố VIII đƣợc hoạt hóa nhờ thrombin), yếu tố IXh, ion Ca2+ và phospholipid. Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xh có sự tham gia của phospholipid, yếu tố Vh (yếu tố V đƣợc hoạt hoá nhờ thrombin) và ion Ca2+.
Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế nội sinh chậm hơn rất nhiều (1 - 6 phút) so với cơ chế ngoại sinh (15 giây) (Hình 1. Sự hình thành thrombin Prothrombin là α2 - globulin có trong huyết tƣơng, do gan sản xuất, trọng lƣợng phân tử 68700, nồng độ trong máu bình thƣờng là 15mg/100ml máu [28,36,47]. Khi phức hợp prothrombinase hình thành nó sẽ chuyển prothrombin (yếu tố II), một zymogen không hoạt động thành thrombin (yếu tố IIh) [28,37]. Giai đoạn này cũng cần sự có mặt của ion Ca2+.
Sự hình thành thrombin từ prothrombin xảy ra trên bề mặt tiểu cầu và diễn ra rất nhanh, đƣợc tính bằng vài giây [11,28,37]. Thrombin là enzym trung tâm trong quá trình đông máu [28,37]. Số lƣợng thrombin đƣợc hình thành phải đủ lớn để đảm bảo cho quá trình đông máu nhƣng lại không đƣợc gây huyết khối [11,37]. Ngoài vai trò kích hoạt sự hình thành cục máu đông, thrombin đóng một vai trò điều chỉnh quan trọng trong quá trình đông máu.
Thrombin kết hợp với thrombomodulin hiện diện trên bề mặt tế bào nội bào tạo thành một phức hợp chuyển đổi protein C thành protein Ch (protein C hoạt hóa). Protein 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đồng phân protein S và protein Ch làm suy giảm các yếu tố Vh và VIIIh, do đó hạn chế hoạt động của 2 yếu tố này trong chuỗi đông máu [28,37]. Sự hình thành fibrin Fibrinogen là một protein hòa tan trong huyết tƣơng do gan sản xuất, trọng lƣợng phân tử 340000, nồng độ trong máu bình thƣờng là 100 - 700mg/100ml máu [36]. Bình thƣờng do kích thƣớc phân tử lớn, fibrinogen rất khó vào dịch kẽ.
Khi thành mạch tăng tính thấm (mô bị viêm) thì fibrinogen vào dịch kẽ và bị đông lại do các yếu tố gây đông máu cùng vào dịch kẽ [25,47,54]. Thrombin sau khi đƣợc hình thành đã chuyển fibrinogen thành fibrin đơn phân. Các fibrin đơn phân tự trùng hợp thành fibrin ở dạng sợi. Một mạng lƣới fibrin đã hình thành và đƣợc ổn định nhờ yếu tố XIII (yếu tố XIII tạo liên kết cộng hóa trị giữa các sợi fibrin) [25,36,47].
Giai đoạn này cũng có sự tham gia của ion Ca2+. Khi mạng lƣới fibrin phát triển, các tế bào máu đƣợc giữ lại trên lƣới fibrin và tạo nên cục máu đông. Chính mạng lƣới này dính vào vị trí tổn thƣơng của thành mạch để ngăn cản sự chảy máu [11,25,36]. Mạng lƣới fibrin giam giữ hồng cầu [37].