Nghiên Cứu Sự Hoạt Hóa Giai Đoạn Sớm Của Tế Bào Hình Sao Gan Trong Mối Quan Hệ Với Sự Tự Thực

Luận án tiến sĩ kỹ thuật phân tích công nghệ sinh học nghiên cứu sự hoạt hoá giai đoạn sớm in vitro và in vivo của tế bào hình sao gắn, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực

• Tác giả: Lê Văn Trình
• Người hướng dẫn: PGS. Trương Hải Nhung
• Trường học: Đại học Quốc gia TP. HCM
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Sự Hoạt Hóa Giai Đoạn Sớm Của Tế Bào Hình Sao Gan Trong Mối Quan Hệ Với Sự Tự Thực
• Loại tài liệu: Doctoral Thesis
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Bệnh lý xơ gan và tế bào hình sao
• 2.2. Tế bào hình sao gan: tên gọi và lịch sử nghiên cứu
• 2.3. Tế bào hình sao gan: hình thái và cấu trúc
• 2.4. Tế bào hình sao gan: marker phân tử
• 2.5. Tế bào hình sao gan: chức năng sinh lý
• 2.6. Vai trò của tế bào hình sao gan trong bệnh lý xơ gan
• 2.7. Điều trị bệnh lý xơ gan nhắm trúng đích tế bào hình sao
• 2.8. Sự tự thực bào và vai trò của sự tự thực bào ở gan
• 2.8.1. Sự tự thực bào
• 2.8.2. Quá trình tự thực bào
• 2.8.3. Các phương pháp đánh giá sự tự thực bào
• 2.8.4. Vai trò của sự tự thực bào ở các tế bào gan góp phần vào bệnh lý xơ gan
• 2.9. Mô hình nghiên cứu tế bào hình sao gan in vitro
• 2.9.1. Phân lập tế bào hình sao gan sơ cấp
• 2.9.2. Các mô hình nuôi cấy tế bào hình sao gan in vitro
• 2.9.3. Mô hình dòng tế bào hình sao gan thương mại
• 2.9.4. Tình hình nghiên cứu về vấn đề đặt ra bởi đề tài
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU — PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Vật liệu — Hóa chất - Dụng cụ - Trang thiết bị
• 3.2. Hóa chất, dụng cụ
• 3.3. Cách tiếp cận và thiết kế nghiên cứu
• 3.4. Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy HSC in vitro
• 3.4.1. Xây dựng quy trình phân lập HSC từ gan chuột BALB/c
• 3.4.2. Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy HSC in vitro
• 3.4.3. Đánh giá mối liên hệ và vai trò của sự tự thực bào trong sự hoạt hóa giai đoạn sớm HSC in vitro
• 3.4.4. Tạo mô hình chuột tổn thương gan cấp tính và đánh giá trạng thái hoạt hóa ở HSC in vivo
• 3.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của tác nhân ức chế sự tự thực bào lên chuột mô hình và giai đoạn sớm của sự hoạt hóa HSC in vivo
• 3.5. Phương pháp thực hiện
• 3.6. Trình bày dữ liệu và phân tích thống kê
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ - BIÊN LUẬN
• 4.1. Xây dựng quy trình phân lập tế bào hình sao gan từ chuột BALB/c
• 4.2. Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy HSC in vitro
• 4.3. Ảnh hưởng của LPS và CQ lên sự tăng sinh và hình thái của HSC in vitro
• 4.4. Tác động của CQ và LPS lên sự tự thực bào ở HSC hoạt hóa in vitro
• 4.5. Tạo mô hình chuột tổn thương gan cấp tính
• 4.5.1. Mô hình chuột BDL
• 4.5.2. Mô hình chuột CCl4
• 4.6. Khảo sát mức độ hoạt hóa và sự tự thực bào ở HSC từ chuột tổn thương gan
• 4.6.1. Sự hoạt hóa HSC trên mô hình chuột BDL
• 4.6.2. Sự hoạt hóa HSC trên mô hình chuột CCl4
• 4.6.3. Ảnh hưởng của CQ lên chuột BDL
• 4.6.4. Ảnh hưởng của CQ lên chuột CCl4
• 4.7. Tóm lược kết quả của luận án
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC BÀI BÁO, CÔNG TRÌNH KHOA HỌC
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Hoạt Hóa Tế Bào Sao Gan Giai Đoạn Sớm

Nghiên cứu về hoạt hóa tế bào hình sao gan (HSC) giai đoạn sớm là chìa khóa để hiểu và điều trị xơ gan. Xơ gan là kết quả cuối cùng của nhiều bệnh lý gan mạn tính, đặc trưng bởi sự thay thế mô gan khỏe mạnh bằng mô sẹo. Tế bào hình sao gan đóng vai trò quan trọng trong quá trình này, chuyển từ trạng thái ngủ yên sang trạng thái hoạt động, sản xuất collagen và các thành phần chất nền ngoại bào khác (ECM). Nghiên cứu này tập trung vào giai đoạn khởi đầu của sự hoạt hóa HSC, một giai đoạn quan trọng trong việc ngăn chặn sự tiến triển của xơ gan. Các yếu tố như sự tự thực bào và các tác nhân viêm như lipopolysaccharide (LPS) có ảnh hưởng lớn đến quá trình này. Nghiên cứu này đặt mục tiêu khám phá mối liên hệ giữa các yếu tố này và sự hoạt hóa HSC giai đoạn sớm, từ đó mở ra các phương pháp điều trị mới.

1.1. Vai Trò Tế Bào Hình Sao Gan Trong Bệnh Lý Xơ Gan

Tế bào hình sao gan (HSC) là tế bào đặc trưng của gan, chịu trách nhiệm chính trong việc dự trữ vitamin A. Trong điều kiện gan khỏe mạnh, HSC ở trạng thái ngủ yên. Khi gan bị tổn thương, HSC được kích hoạt, chuyển đổi thành nguyên bào sợi cơ (MFB) và bắt đầu sản xuất ECM, gây ra xơ gan. Nghiên cứu cho thấy khoảng 80% MFB trong gan tổn thương có nguồn gốc từ HSC. Sự chuyển đổi này được chia thành hai giai đoạn: khởi đầu và duy trì. Giai đoạn khởi đầu là then chốt, quyết định liệu HSC có tiếp tục tiến triển thành MFB gây xơ hóa hay không. Các marker hoạt hóa như α-SMA và collagen tăng lên trong giai đoạn này. Sự hiểu biết sâu sắc về giai đoạn này có thể giúp phát triển các phương pháp can thiệp hiệu quả hơn.

1.2. Cơ Chế Tự Thực Bào và Ảnh Hưởng Lên Tế Bào Gan

Sự tự thực bào là một quá trình sinh lý nội bào quan trọng, cho phép tế bào loại bỏ các thành phần hư hỏng hoặc không cần thiết, duy trì sự cân bằng nội môi. Trong gan, sự tự thực bào đóng vai trò kép, có thể bảo vệ hoặc gây hại tùy thuộc vào bối cảnh. Trong một số trường hợp, sự tự thực bào có thể giúp loại bỏ các tế bào gan bị tổn thương, ngăn ngừa viêm và xơ hóa. Tuy nhiên, trong một số tình huống khác, sự tự thực bào có thể thúc đẩy sự sống sót của các tế bào xơ, góp phần vào sự tiến triển của xơ gan. Mối quan hệ phức tạp giữa sự tự thực bào và bệnh lý gan cần được nghiên cứu kỹ lưỡng để tìm ra các phương pháp điều trị tiềm năng.

II. Thách Thức Nghiên Cứu Hoạt Hóa Tế Bào Hình Sao Gan Giai Đoạn Sớm

Nghiên cứu về hoạt hóa tế bào hình sao gan giai đoạn sớm đối mặt với nhiều thách thức. Việc phân lập và nuôi cấy HSC in vitro đòi hỏi các kỹ thuật phức tạp để duy trì kiểu hình ngủ yên của tế bào và ngăn chặn sự tự hoạt hóa. Các mô hình tổn thương gan cấp tính và mạn tính trên động vật cần được thiết lập và chuẩn hóa để đảm bảo tính tái lập và độ tin cậy của kết quả. Việc đánh giá sự tự thực bào trong HSC in vitro và in vivo cũng đòi hỏi các phương pháp phân tích phức tạp như Western blot, immunohistochemistry và kính hiển vi điện tử. Bên cạnh đó, các tác nhân ức chế sự tự thực bào có thể có tác dụng phụ trên các tế bào khác trong gan, gây khó khăn trong việc giải thích kết quả. Cần có các nghiên cứu sâu hơn để vượt qua những thách thức này và đạt được những hiểu biết chính xác hơn về cơ chế hoạt hóa HSC giai đoạn sớm.

2.1. Khó Khăn Trong Phân Lập và Nuôi Cấy Tế Bào Sao Gan

Việc phân lập tế bào hình sao gan (HSC) từ gan động vật đòi hỏi quy trình phức tạp, bao gồm truyền dịch, tiêu hóa enzyme và ly tâm mật độ. Quá trình này có thể gây tổn thương tế bào và ảnh hưởng đến khả năng sống sót và chức năng của HSC. Hơn nữa, HSC rất dễ bị tự hoạt hóa trong điều kiện nuôi cấy in vitro, mất đi kiểu hình ngủ yên và bắt đầu sản xuất ECM. Điều này gây khó khăn trong việc nghiên cứu giai đoạn sớm của sự hoạt hóa HSC. Các nhà nghiên cứu đã phát triển nhiều phương pháp nuôi cấy khác nhau, bao gồm sử dụng chất nền đặc biệt, bổ sung các yếu tố tăng trưởng và điều chỉnh nồng độ oxy để duy trì kiểu hình ngủ yên của HSC.

2.2. Hạn Chế Trong Mô Hình Chuột Tổn Thương Gan Cấp Tính

Mô hình chuột tổn thương gan cấp tính như tiêm carbon tetrachloride (CCl4) hoặc thắt ống dẫn mật (BDL) thường được sử dụng để nghiên cứu sự hoạt hóa HSC in vivo. Tuy nhiên, các mô hình này có những hạn chế nhất định. Ví dụ, tiêm CCl4 gây ra tổn thương gan lan tỏa, ảnh hưởng đến nhiều loại tế bào khác nhau, trong khi BDL gây ra ứ mật, dẫn đến các thay đổi phức tạp trong gan. Hơn nữa, sự đáp ứng của chuột đối với các tác nhân gây tổn thương gan có thể khác nhau tùy thuộc vào chủng, tuổi và giới tính. Việc lựa chọn mô hình phù hợp và kiểm soát các yếu tố gây nhiễu là rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hoạt Hóa Tế Bào Sao Gan và Tự Thực Bào

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp tiếp cận in vitro và in vivo để khám phá mối liên hệ giữa hoạt hóa tế bào hình sao gan và sự tự thực bào. In vitro, HSC được phân lập từ gan chuột và nuôi cấy trong điều kiện khác nhau để kích thích sự hoạt hóa. Sự biểu hiện của các marker hoạt hóa HSC như α-SMA và collagen được đánh giá bằng Western blot và immunocytochemistry. Sự tự thực bào được đánh giá bằng cách đo lường nồng độ LC3-II và p62. In vivo, chuột được gây tổn thương gan bằng CCl4 hoặc BDL. Các mẫu gan được thu thập ở các thời điểm khác nhau để đánh giá sự hoạt hóa HSC và sự tự thực bào bằng immunohistochemistry và RT-PCR. Các tác nhân ức chế sự tự thực bào như chloroquine (CQ) được sử dụng để xác định vai trò của sự tự thực bào trong sự hoạt hóa HSC.

3.1. Kỹ Thuật Phân Lập và Nuôi Cấy HSC In Vitro

Quy trình phân lập tế bào hình sao gan (HSC) bao gồm truyền dịch gan, tiêu hóa enzyme collagenase và ly tâm gradient mật độ Nycodenz. Tế bào HSC được nuôi cấy trên đĩa nhựa hoặc gel fibrin để mô phỏng môi trường in vivo. Môi trường nuôi cấy được bổ sung các yếu tố tăng trưởng như PDGF và TGF-β để kích thích sự hoạt hóa HSC. Sự thay đổi hình thái tế bào, sự tăng sinh và biểu hiện các marker hoạt hóa (α-SMA, collagen I) được đánh giá bằng kính hiển vi và Western blot. Các thí nghiệm kiểm soát được thực hiện để đảm bảo kết quả chính xác.

3.2. Đánh Giá Sự Tự Thực Bào Bằng Western Blot và IHC

Sự tự thực bào được đánh giá bằng cách đo lường mức độ protein LC3-II (một marker của autophagosomes) và p62 (một protein cargo được loại bỏ bởi autophagy). Western blot được sử dụng để định lượng mức độ các protein này trong mẫu tế bào hoặc mô. Immunohistochemistry (IHC) được sử dụng để xác định vị trí của các protein này trong tế bào và mô. Sự tăng nồng độ LC3-II và sự giảm nồng độ p62 cho thấy sự tăng cường tự thực bào. Các thí nghiệm kiểm soát bao gồm sử dụng các chất ức chế và kích thích autophagy để xác nhận kết quả.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Tự Thực Bào và Hoạt Hóa Tế Bào Sao Gan

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự tự thực bào được kích hoạt trong giai đoạn sớm của hoạt hóa tế bào hình sao gan (HSC) in vitro và in vivo. Trong các tế bào HSC được kích hoạt bằng LPS, nồng độ LC3-II tăng lên đáng kể, cho thấy sự tăng cường tự thực bào. Ngược lại, việc ức chế tự thực bào bằng CQ làm giảm sự biểu hiện của các marker hoạt hóa HSC như α-SMA và collagen. Tương tự, trong mô hình chuột tổn thương gan, sự tự thực bào được kích hoạt trong HSC trong vòng 2 ngày sau khi gây tổn thương. Việc tiêm CQ làm giảm tổn thương gan, giảm xơ hóa và giảm sự hoạt hóa HSC. Những kết quả này cho thấy rằng sự tự thực bào đóng vai trò quan trọng trong sự hoạt hóa HSC và có thể là một mục tiêu điều trị tiềm năng cho xơ gan.

4.1. Ảnh Hưởng Của LPS và CQ Lên Hoạt Hóa HSC In Vitro

Lipopolysaccharide (LPS) kích thích hoạt hóa tế bào hình sao gan (HSC) in vitro, dẫn đến sự tăng sinh, sự biểu hiện α-SMA và collagen I. Đồng thời, LPS cũng kích thích sự tự thực bào trong HSC, thể hiện qua sự tăng LC3-II. Chloroquine (CQ), một chất ức chế autophagy, làm giảm sự tăng sinh và biểu hiện marker hoạt hóa của HSC do LPS gây ra. Điều này cho thấy rằng autophagy đóng vai trò trong sự hoạt hóa HSC do LPS gây ra.

4.2. Tác Động Của CQ Lên Mô Hình Chuột Tổn Thương Gan

Trong mô hình chuột tổn thương gan do CCl4 hoặc BDL, tiêm Chloroquine (CQ) làm giảm các dấu hiệu tổn thương gan, bao gồm giảm nồng độ ALT và AST trong huyết thanh, giảm sự tích tụ collagen trong gan và giảm sự biểu hiện α-SMA trong tế bào hình sao gan. Điều này cho thấy rằng CQ có thể bảo vệ gan khỏi tổn thương và xơ hóa bằng cách ức chế sự tự thực bào và giảm hoạt hóa tế bào hình sao gan.

V. Ứng Dụng Tiềm Năng Điều Trị Xơ Gan Bằng Ức Chế Tự Thực Bào

Nghiên cứu này cho thấy tiềm năng sử dụng các chất ức chế sự tự thực bào như Chloroquine (CQ) trong điều trị xơ gan. Tuy nhiên, CQ có thể gây ra tác dụng phụ trên các tế bào khác trong gan. Do đó, cần phát triển các hệ thống phân phối thuốc trúng đích để đưa các chất ức chế tự thực bào trực tiếp đến tế bào hình sao gan (HSC) hoạt hóa. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc xác định các cơ chế phân tử cụ thể mà qua đó sự tự thực bào điều chỉnh sự hoạt hóa HSC và tìm kiếm các mục tiêu điều trị khác liên quan đến con đường autophagy. Bên cạnh đó, việc kết hợp các chất ức chế tự thực bào với các phương pháp điều trị hiện có như kháng virus và ức chế miễn dịch có thể mang lại hiệu quả tốt hơn trong việc ngăn chặn sự tiến triển của xơ gan.

5.1. Phát Triển Hệ Thống Phân Phối Thuốc Trúng Đích HSC

Để giảm thiểu tác dụng phụ của các chất ức chế sự tự thực bào, cần phát triển các hệ thống phân phối thuốc trúng đích nhắm mục tiêu tế bào hình sao gan (HSC) hoạt hóa. Các hệ thống này có thể sử dụng các kháng thể, peptide hoặc các phân tử nhỏ có ái lực cao với các marker bề mặt đặc trưng của HSC hoạt hóa. Bằng cách đưa thuốc trực tiếp đến HSC, có thể giảm thiểu tác dụng phụ trên các tế bào khác trong gan và tăng hiệu quả điều trị.

5.2. Nghiên Cứu Cơ Chế Phân Tử Của Tự Thực Bào và HSC

Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc xác định các cơ chế phân tử cụ thể mà qua đó sự tự thực bào điều chỉnh hoạt hóa tế bào hình sao gan (HSC). Việc xác định các protein và con đường tín hiệu liên quan có thể giúp tìm ra các mục tiêu điều trị mới và phát triển các loại thuốc hiệu quả hơn. Các phương pháp tiếp cận hệ thống như genomics, proteomics và metabolomics có thể được sử dụng để khám phá các cơ chế phức tạp này.

VI. Kết Luận Tự Thực Bào Là Mục Tiêu Tiềm Năng Trị Xơ Gan

Nghiên cứu này đã chứng minh rằng sự tự thực bào đóng vai trò quan trọng trong hoạt hóa tế bào hình sao gan (HSC) giai đoạn sớm và có thể là một mục tiêu điều trị tiềm năng cho xơ gan. Việc ức chế tự thực bào bằng Chloroquine (CQ) làm giảm tổn thương gan, giảm xơ hóa và giảm sự hoạt hóa HSC. Tuy nhiên, cần có các nghiên cứu sâu hơn để xác định các cơ chế phân tử cụ thể mà qua đó sự tự thực bào điều chỉnh sự hoạt hóa HSC và phát triển các hệ thống phân phối thuốc trúng đích để giảm thiểu tác dụng phụ. Sự kết hợp giữa các phương pháp điều trị hiện có và các chất ức chế tự thực bào có thể mang lại hiệu quả tốt hơn trong việc ngăn chặn sự tiến triển của xơ gan.

6.1. Tổng Kết Các Kết Quả Nghiên Cứu Chính

Các kết quả nghiên cứu chính bao gồm việc xác định vai trò của sự tự thực bào trong giai đoạn sớm của hoạt hóa tế bào hình sao gan (HSC) in vitro và in vivo. Nghiên cứu đã chứng minh rằng việc ức chế autophagy bằng CQ có thể làm giảm tổn thương gan và xơ hóa trong mô hình chuột tổn thương gan. Những kết quả này cung cấp bằng chứng mạnh mẽ cho thấy autophagy là một mục tiêu điều trị tiềm năng cho xơ gan.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai Về Tế Bào Sao Gan và Tự Thực Bào

Các hướng nghiên cứu tương lai bao gồm việc xác định các cơ chế phân tử cụ thể mà qua đó sự tự thực bào điều chỉnh hoạt hóa tế bào hình sao gan (HSC), phát triển các hệ thống phân phối thuốc trúng đích để giảm thiểu tác dụng phụ của các chất ức chế autophagy và đánh giá hiệu quả của việc kết hợp các chất ức chế autophagy với các phương pháp điều trị hiện có cho xơ gan. Ngoài ra, cần nghiên cứu thêm về vai trò của các loại autophagy khác nhau (ví dụ: mitophagy, lipophagy) trong bệnh lý gan.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Xơ gan là hệ quả bệnh lý chung của các tổn thương gan mạn tính xuất phát từ nhiều nguyên nhân như nhiễm virus viêm gan B/C (HBV, HCV), lạm dụng thức uống có cồn, gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD/NASH) hay bệnh lý tự miễn. Trên quy mô toàn cầu, xơ gan là nguyên nhân tử vong thứ 14 trên thế giới và thứ 4 tại Châu Âu, cướp đi sinh mạng của khoảng 1,3 triệu người mỗi năm kèm theo 810 nghìn ca tử vong do ung thư biểu mô tế bào gan (HCC). Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính chiếm khoảng 12% và HCV khoảng 2% dân số, tạo ra gánh nặng bệnh lý rất lớn. Khi tế bào nhu mô gan (parenchymal cells - PC) hoại tử, mô gan tổn thương được thay thế bằng mô sẹo hình thành từ sự tích tụ chất nền ngoại bào (Extracellular Matrix - ECM) do nguyên bào sợi cơ (Myofibroblast - MFB) bài tiết. Các nghiên cứu định danh dòng tế bào (lineage tracing) đã chứng minh trên 80% MFB trong gan tổn thương có nguồn gốc trực tiếp từ tế bào hình sao gan (Hepatic Stellate Cells - HSC) – loại tế bào nằm tại khoảng Disse vốn dự trữ trên 80% lượng Vitamin A của cơ thể ở trạng thái tĩnh (quiescent).

Tiến trình chuyển dạng của HSC từ trạng thái im lặng (qHSC) sang trạng thái hoạt hóa (aHSC/MFB) bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn khởi đầu (initiation - giai đoạn sớm) và giai đoạn duy trì (perpetuation). Trong khi hầu hết các can thiệp lâm sàng truyền thống tập trung vào giai đoạn duy trì khi mạng lưới xơ đã định hình vững chắc, luận án của NCS. Lê Văn Trình (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM; mã số ngành: 9420201; thực hiện dưới sự tài trợ của Quỹ NAFOSTED mã số 108.30 và ĐHQG-HCM mã số C2021-18-10) tiên phong làm sáng tỏ cơ chế điều hòa giai đoạn khởi phát thông qua con đường tự thực bào (autophagy). Nghiên cứu giải quyết khoảng trống học thuật (research gap) quan trọng: Bản chất cơ chế phân tử và vai trò chức năng của sự tự thực bào trong thời điểm chuyển tiếp sớm của HSC in vitro và in vivo, từ đó thiết lập tiền đề cho các chiến lược can thiệp sớm ngăn ngừa xơ hóa.

Các câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học của luận án:

• RQ1: Con đường tự thực bào (autophagy) có biến đổi biểu hiện đồng thì với các dấu ấn phân tử hoạt hóa trong giai đoạn khởi đầu của HSC in vitro và in vivo hay không?
• RQ2: Việc ức chế dược lý dòng thông lượng tự thực (autophagic flux) có khả năng ngăn chặn sự kích hoạt hình thái MFB và bảo tồn các giọt lipid (Lipid Droplets - LD) của HSC hay không?
• RQ3: Ức chế tự thực bào in vivo có làm suy giảm mức độ hoại tử mô và giảm mức lắng đọng collagen trong mô hình tổn thương gan cấp tính hay không?
• Hypothesis 1 (H1): Quá trình tự thực bào (đặc biệt là lipophagy) được kích hoạt sớm nhằm phân giải giọt lipid dự trữ để cung cấp năng lượng cho HSC tái cấu trúc tế bào chất và biểu hiện các protein co cơ (α-SMA) và ECM (Collagen I).
• Hypothesis 2 (H2): Sử dụng chất ức chế tự thực bào Chloroquine (CQ) ở nồng độ và liều lượng thích hợp sẽ phong bế tín hiệu khởi phát hoạt hóa của HSC và làm giảm tổn thương xơ hóa gan trên mô hình động vật.

Nghiên cứu được thiết kế đa tầng với phạm vi thực nghiệm chặt chẽ: Chuột BALB/c thuần chủng (>5 tháng tuổi, trọng lượng ~25g), dòng tế bào chuẩn NIH/3T3, hai mô hình tổn thương gan cấp tính bằng hóa chất (tiêm phúc mạc CCl₄ 2 mL/kg) và phẫu thuật thắt ống dẫn mật (Bile Duct Ligation - BDL). Các kết quả đột phá từ luận án đã được công bố trên 5 công trình khoa học thuộc danh mục tạp chí quốc tế ISI uy tín.

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu về tế bào hình sao gan trải qua lịch sử gần 150 năm, khởi nguồn từ mô tả đầu tiên của Kupffer (1876) bằng kỹ thuật nhuộm vàng chloride ($AuCl_3$), tiếp nối bởi Zimmerman (1950) với khái niệm pericyte, Ito và Suzuki với thuật ngữ tế bào dự trữ mỡ ("fat-storing cells"), Bronfenmajer (1966), Wake (1971), cho đến sự đồng thuận danh pháp quốc tế chính thức "Hepatic Stellate Cell" tại Baltimore vào năm 1996. Cơ chế bệnh sinh xơ gan hiện đại xác định mô sẹo xơ là sự tích tụ bất thường của Collagen type I, III, Fibronectin và Proteoglycan tại khoảng Disse, làm biến dạng cấu trúc tiểu thùy lục giác và phá hủy xoang gan.

Hai luồng quan điểm lớn đã tồn tại trong y văn quốc tế liên quan đến nguồn gốc tế bào của MFB:

1. Trường phái đa nguồn gốc: Cho rằng MFB phát sinh từ sự chuyển dạng biểu mô - trung mô (EMT) của tế bào nhu mô gan (Hepatocyte), tế bào biểu mô đường mật (Cholangiocyte/BEC) cùng với nguyên bào sợi vùng cửa (Portal Fibroblasts - PF) và tế bào gốc tủy xương.
2. Trường phái HSC là trung tâm: Được khẳng định vững chắc qua các nghiên cứu định danh di truyền của Mederacke et al. (2013) sử dụng hệ thống tái tổ hợp Cre-LoxP và chỉ thị huỳnh quang GFP gắn promoter Collagen α1(I), chứng minh HSC đóng góp hơn 80-90% tổng số MFB trong mọi mô hình tổn thương gan do độc chất lẫn ứ mật.

Về con đường tự thực bào (Macroautophagy - MaA) – cơ chế sinh lý bảo tồn ở sinh vật nhân thực được vinh danh giải Nobel Y sinh học 2016 của Yoshinori Ohsumi – các nghiên cứu ban đầu của Hernández-Gea et al. (2012) và Thoen et al. (2011) chỉ ra rằng tự thực bào cung cấp năng lượng ATP thông qua thoái hóa acid béo nội sinh từ giọt lipid (lipophagy) để thúc đẩy MFB tăng sinh và kháng apoptosis trong giai đoạn mạn tính. Tuy nhiên, một tranh biện khoa học lớn vẫn tồn tại: Liệu tự thực bào là tác nhân kích hoạt tiên phát bắt buộc trong giai đoạn sớm (initiation phase) khi HSC mới tiếp nhận kích thích viêm, hay chỉ là hiện tượng thích ứng thứ cấp trong giai đoạn duy trì (perpetuation phase)?

So sánh với các nghiên cứu quốc tế:

• Nghiên cứu của Hernández-Gea et al. (Cell Metabolism, 2012) chủ yếu khảo sát trên tế bào HSC đã chuyển dạng hoàn toàn hoặc dòng tế bào bất tử (LX-2, HSC-T6) nuôi cấy trên nền nhựa plastic cứng – môi trường vốn gây hiện tượng tự hoạt hóa ngoài ý muốn (autoactivation).
• Nghiên cứu của Thoen et al. (Autophagy, 2011) tập trung vào phân tích proteomic của tế bào nuôi cấy dài ngày (>7 ngày).

Luận án của Lê Văn Trình đã định vị xuất sắc khoảng trống này bằng cách: (1) Khảo sát động học tự thực bào ngay tại "cửa sổ thời gian vàng" (Day 2 in vivo và 24h in vitro); (2) Sử dụng mô hình nuôi cấy sơ cấp trên nền hydrogel Fibrin tự thân từ huyết tương đông lạnh nhằm duy trì hoàn hảo kiểu hình im lặng qHSC, triệt tiêu biến số tự hoạt hóa giả tạo do độ cứng của chất nền nuôi cấy plastic gây ra.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và bổ sung sâu sắc mô hình hoạt hóa hai giai đoạn kinh điển của Scott L. Friedman bằng cách tích hợp trực tiếp cơ chế tự thực bào (Autophagy signaling) vào giai đoạn khởi đầu:

• Proposition 1: Tín hiệu tiền viêm (đại diện bởi Lipopolysaccharide - LPS tác động qua thụ thể TLR4) cảm ứng sự gia tăng thông lượng tự thực bào (LC3-I chuyển hóa thành LC3-II, gia tăng thoái biến p62/SQSTM1) trước khi có sự bộc lộ rõ rệt của bộ máy co cơ sợi trung gian $\alpha$-SMA.
• Proposition 2: Giai đoạn chuyển dịch hình thái từ tế bào có gai phân nhánh sang dạng hình thoi (spindle-shape) đi kèm với sự tiêu biến các giọt lipid (chứa Retinyl palmitate) dưới sự điều hòa của dòng túi tự thực (Autophagosome - AP) dung hợp với Lysosome tạo thành Autolysosome (AL).
• Paradigm shift: Chuyển đổi cách nhìn nhận truyền thống xem tự thực bào như một phản ứng sinh tồn chung của mô sang nhận thức tự thực bào là "công tắc chuyển hóa năng lượng bắt buộc" điều khiển sự hoạt hóa sớm của HSC.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp ba lý thuyết nền tảng sinh học phân tử:

1. Lý thuyết hoạt hóa tế bào hình sao gan (Friedman's HSC Activation Theory): Phân định ranh giới giữa khởi phát (initiation) và duy trì (perpetuation).
2. Lý thuyết dòng thông lượng tự thực bào (Autophagic Flux Dynamics): Đánh giá sự chuyển dịch LC3-II/LC3-I và tích tụ p62 khi bị ức chế bẫy pH lysosome.
3. Lý thuyết dẫn truyền cơ sinh học vi môi trường (Mechanotransduction Theory): Ảnh hưởng của độ cứng chất nền (matrix stiffness) lên sự tự hoạt hóa của tế bào gốc và tế bào ngoại mạch.

Nghiên cứu xác lập các điều kiện biên (boundary conditions) chặt chẽ: Phân tích tập trung vào pha tổn thương cấp tính (acute liver injury) trong vòng 48 giờ đầu sau can thiệp, phân lập tác động riêng biệt trên HSC sơ cấp (primary HSC) thay vì các dòng biến đổi di truyền nhằm đảm bảo tính sinh lý nguyên bản.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án vận dụng quan điểm thực chứng (positivism) kết hợp thiết kế thực nghiệm đa cấp độ (multi-level design: In vitro - Ex vivo - In vivo), đảm bảo kiểm soát nghiêm ngặt các biến số gây nhiễu:

• Hệ thống In vitro: Tế bào HSC sơ cấp phân lập từ gan chuột BALB/c được nuôi cấy so sánh trên hai loại giá thể: đĩa nhựa truyền thống 2D (polystyrene cứng, độ cứng ~GPa) và màng hydrogel Fibrin chiết xuất từ huyết tương đông lạnh (độ mềm sinh học mô phỏng khoảng Disse sinh lý).
• Hệ thống In vivo: Chuột đực BALB/c Albino thuần chủng, 5 tháng tuổi, cân nặng chuẩn $25 \pm 2$ g, chia lô ngẫu nhiên vào các nhóm can thiệp tổn thương và đối chứng.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình phân lập và làm sạch HSC sơ cấp được chuẩn hóa tối ưu qua các bước:

1. Truyền dịch rửa và phân giải gan tại chỗ: Khảo sát so sánh hiệu quả thông qua tĩnh mạch cửa (Portal Vein - PV) sử dụng dung dịch đệm GBSS không chứa $Ca^{2+}$/EGTA để loại bỏ hoàn toàn hồng cầu và phá vỡ liên kết desmosome, tiếp nối bằng dung dịch Collagenase chứa $Ca^{2+}$.
2. Ly tâm gradient tỷ trọng Nycodenz: Khảo sát dải nồng độ Nycodenz (11%, 13%, 15%) để xác định điểm tỷ trọng tối ưu giúp phân tách HSC (nhờ chứa hàm lượng lipid cao nên có tỷ trọng nổi thấp) khỏi tế bào Kupffer (CLEC4F+), tế bào nội mô xoang gan (LSEC - CD31+) và tế bào nhu mô gan (PC).
3. Định danh và kiểm tra độ tinh sạch: Đánh giá hình thái tự phát huỳnh quang Vitamin A dưới ánh sáng cực tím ($\lambda = 328$ nm), nhuộm hóa tế bào miễn dịch (ICC) với kháng thể kháng Desmin (tiêu chuẩn vàng cho HSC) và $\alpha$-SMA. Độ tinh sạch của hỗn dịch phân lập đạt $>90%$ tế bào dương tính với Desmin.
4. Phương pháp tạo mô hình tổn thương in vivo:
   • Mô hình độc chất: Tiêm phúc mạc $CCl_4$ liều duy nhất 2 mL/kg (pha trong dầu khoáng theo tỷ lệ 1:1).
   • Mô hình phẫu thuật: Thắt hai nút chỉ ống mật chủ (Bile Duct Ligation - BDL) gây ứ mật cấp.
5. Phác đồ can thiệp ức chế tự thực bào: Chloroquine diphosphate (CQ) được sử dụng:
   • In vitro: Nồng độ $5,\mu\text{M}$ bổ sung đồng thời cùng LPS trong 24 giờ.
   • In vivo: Liều $60\text{ mg/kg}$ tiêm phúc mạc vào hai thời điểm: 24 giờ trước và 24 giờ sau khi gây tổn thương $CCl_4$ hoặc BDL.

Data và phân tích

Các công cụ đo lường và kỹ thuật phân tích tiên tiến được triển khai đồng bộ:

• Đo lường tăng sinh tế bào: Phép đo độ hấp thụ quang học (OD) tại bước sóng 450 nm sử dụng Cell Counting Kit-8 (CCK-8).
• Đánh giá hàm lượng lipid nội bào: Nhuộm Oil Red O (ORO) kết hợp định lượng mật độ quang huỳnh quang hiệu chỉnh tế bào tổng thể (Corrected Total Cell Fluorescence - CTCF) xử lý trên phần mềm ImageJ.
• Phân tích biểu hiện phân tử: Real-time RT-PCR định lượng mức biểu hiện mRNA của các gene mục tiêu: $\alpha$-SMA (Acta2), Collagen type I (Col1a1), LC3 (Map1lc3b), p62 (Sqstm1), chuẩn hóa theo gene nội suy Gapdh.
• Phân tích hình thái mô học: Nhuộm Hematoxylin & Eosin (H&E) đánh giá mức hoại tử tế bào gan vùng trung tâm tiểu thùy (CV) và phản ứng ống mật (DR); nhuộm Sirius Red chuyên biệt phát hiện bó sợi Collagen ngoại bào.
• Kính hiển vi điện tử quét (SEM) và hiển vi huỳnh quang đồng tiêu (Confocal Laser Scanning Microscopy): Phân tích siêu cấu trúc vi gai (spine), màng tế bào và cấu trúc mạng lưới sợi actin.
• Phân tích sinh hóa huyết thanh: Định lượng nồng độ men gan AST (Aspartate Aminotransferase), ALT (Alanine Aminotransferase) và Bilirubin toàn phần trên máy phân tích sinh hóa tự động.
• Xử lý thống kê: Phân tích ANOVA một chiều hoặc hai chiều kèm phép kiểm định sau Tukey-HSD, dữ liệu biểu diễn dưới dạng Mean ± SD với ngưỡng ý nghĩa thống kê được xác lập tại $p < 0.05$, $p < 0.01$ và $p < 0.001$.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Thiết lập thành công nền tảng nuôi cấy Fibrin gel duy trì trạng thái im lặng (qHSC): Khác biệt hoàn toàn với đĩa nhựa polystyrene 2D khiến HSC tự kích hoạt và chuyển dạng hoàn toàn thành MFB sau 7 ngày nuôi cấy, giá thể hydrogel Fibrin tạo ra từ huyết tương đông lạnh giúp HSC bảo tồn cấu trúc tế bào hình sao nhiều nhánh gai, duy trì các giọt lipid ORO+ và ức chế hoàn toàn sự bộc lộ của gene $\alpha$-SMA và Collagen I trong suốt 7 ngày ($p < 0.001$).
2. Khám phá sự gia tăng mạnh mẽ của dòng thông lượng tự thực trong pha khởi động in vitro: Khi kích hoạt HSC sơ cấp bằng LPS, mức độ chuyển đổi LC3-I sang LC3-II gia tăng gấp 2,8 lần đi kèm với sự suy giảm rõ rệt của giọt lipid dự trữ. Khi xử lý kết hợp với Chloroquine $5,\mu\text{M}$ (chất làm kiềm hóa lysosome ngăn chặn sự dung hợp AP-AL), thông lượng tự thực bị chặn đứng, dẫn đến sự tích lũy của p62 và giữ lại lượng giọt lipid nội bào ở mức tương đương nhóm đối chứng chưa kích hoạt ($p < 0.01$).
3. Xác định chính xác thời điểm vàng khởi phát hoạt hóa HSC in vivo tại Ngày 2: Trên cả hai mô hình chuột $CCl_4$ và BDL, các dấu ấn sao chép phân tử của sự hoạt hóa ($\alpha$-SMA, Collagen I) đồng thời tăng vọt cùng với marker tự thực LC3-II tại mốc 48 giờ (Day 2) sau tổn thương cấp. Nhuộm hóa mô miễn dịch xác nhận các tế bào dương tính kép Desmin+/$\alpha$-SMA+ khu trú dày đặc quanh vùng hoại tử trung tâm tiểu thùy ở chuột $CCl_4$ và vùng cửa ở chuột BDL.
4. Hiệu quả đảo ngược tổn thương và giảm xơ hóa vượt trội của Chloroquine in vivo: Phác đồ tiêm 2 liều CQ $60\text{ mg/kg}$ làm giảm có ý nghĩa thống kê nồng độ men gan huyết thanh AST và ALT (giảm $>45%$, $p < 0.01$), ức chế diện tích nhuộm dương tính Sirius Red (giảm $>55%$ diện tích lắng đọng collagen, $p < 0.001$), đồng thời làm giảm biểu hiện $\alpha$-SMA trong mô gan tổn thương cấp tính ở cả hai mô hình $CCl_4$ và BDL.

Implications đa chiều

• Giá trị học thuật (Theoretical Advances): Bổ sung mảnh ghép cơ chế chuyển hóa năng lượng (metabolic-energetic coupling) vào thuyết hoạt hóa tế bào trung mô; chứng minh tự thực bào đóng vai trò là "cơ chế kích hoạt đầu nguồn" (upstream trigger) trong bệnh sinh xơ hóa gan.
• Đổi mới phương pháp luận (Methodological Innovations): Cung cấp quy trình phân lập HSC từ chuột BALB/c đạt độ sạch cao và mô hình nuôi cấy ex vivo trên gel Fibrin có khả năng tái lập vi môi trường sinh lý học, giải quyết triệt để rào cản tự hoạt hóa ngoài ý muốn vốn làm sai lệch dữ liệu thử nghiệm sàng lọc thuốc suốt nhiều thập kỷ.
• Ứng dụng y dược học (Practical Applications): Mở ra triển vọng tái định vị thuốc (drug repurposing) đối với các hợp chất ức chế tự thực bào đã được phê duyệt an toàn lâm sàng (như dẫn xuất chloroquine/hydroxychloroquine) trong điều trị phòng ngừa biến chứng tổn thương gan cấp tính tiến triển thành xơ gan.
• Định hướng công nghệ dẫn thuốc (Nanomedicine Pathway): Đặt nền tảng sinh học cho việc phát triển các hệ thống mang hạt nano (nanoparticle, liposome) hướng đích màng tế bào HSC (nhắm vào thụ thể PDGFR-$\beta$, Integrin $\alpha v\beta3$, IGF-IIR) chứa thuốc ức chế tự thực bào, nhằm tối đa hóa hiệu lực tại chỗ và triệt tiêu tác dụng phụ trên tế bào nhu mô gan bình thường.

Limitations và Future Research

Luận án thẳng thắn chỉ rõ các giới hạn học thuật cần tiếp tục hoàn thiện:

1. Giới hạn mô hình nghiên cứu: Phân tích mới tập trung trên pha tổn thương cấp tính (2 ngày) và mô hình động vật gặm nhấm (chuột BALB/c); chưa đánh giá tác động kéo dài của thuốc ức chế tự thực bào trên mô hình xơ gan mạn tính đa chu kỳ (8-12 tuần).
2. Tính đặc hiệu của công cụ dược lý: Chloroquine là chất ức chế tự thực bào toàn thân tác động thông qua cơ chế nâng pH lysosome không đặc hiệu; chưa sử dụng các mô hình động vật biến đổi gen chuyên biệt mô (Conditional Knockout mice) như bất hoạt chọn lọc gene Atg5 hoặc Atg7 riêng trên dòng tế bào HSC (dưới promoter Lrat hoặc Gfap).
3. Chưa phân lập chi tiết cơ chế tín hiệu cơ sinh học: Cơ chế chính xác về mặt vật lý - sinh hóa giúp giá thể hydrogel Fibrin ức chế con đường tự hoạt hóa nội tại của HSC vẫn cần các bằng chứng sâu hơn về mặt lực học chất nền (substrate elasticity) và tín hiệu nội bào qua trục YAP/TAZ.

Chương trình nghiên cứu tương lai (5-10 năm):

• Thiết lập hệ thống chuột chuyển gen biến đổi đặc hiệu mô (Lrat-Cre; Atg7^flox/flox) để khẳng định tuyệt đối vai trò nội tại của tự thực bào trong HSC.
• Phát triển hệ hạt nano hướng đích (Targeted Nanoparticles) bọc màng lipid gắn kháng thể kháng phân tử bề mặt chuyên biệt của aHSC (như Synaptophysin, PDGFR-$\beta$) mang siRNA ức chế tự thực bào.
• Mở rộng thử nghiệm trên mẫu mô gan người từ nguồn sinh thiết lâm sàng bằng công nghệ mô hình gan thu nhỏ trên chip (Liver-on-a-chip 3D).

Tác động và ảnh hưởng

• Ảnh hưởng học thuật: Công trình đóng góp 5 bài báo quốc tế thuộc danh mục ISI, tạo lập nguồn trích dẫn học thuật quan trọng cho cộng đồng nghiên cứu bệnh lý học gan mật và tế bào gốc trong khu vực và quốc tế.
• Tác động công nghệ sinh học: Quy trình chế tạo hydrogel Fibrin từ huyết tương có khả năng chuyển giao cho các phòng thí nghiệm y sinh học để thiết lập kit nuôi cấy sơ cấp HSC đạt chuẩn thực nghiệm.
• Ý nghĩa y tế cộng đồng: Đóng góp luận cứ khoa học thực nghiệm trực tiếp vào chiến lược kiểm soát bệnh gan mạn tính tại Việt Nam – quốc gia có tỷ lệ lưu hành virus viêm gan và tiêu thụ đồ uống có cồn thuộc nhóm cao nhất khu vực Đông Nam Á.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và nhà khoa học trẻ: Tiếp cận quy trình thực nghiệm chuẩn hóa từng bước về phân lập, tinh sạch HSC sơ cấp và thiết kế mô hình bệnh học gan in vivo.
• Các giáo sư, chuyên gia đầu ngành gan mật: Có thêm khung lý thuyết thực chứng về vai trò của tự thực bào trong can thiệp sớm bệnh lý xơ hóa.
• Các đơn vị R&D Dược phẩm: Khai thác dữ liệu sàng lọc tiền lâm sàng để phát triển các thế hệ thuốc kháng xơ nhắm trúng đích tế bào hình sao gan.
• Các nhà hoạch định chính sách y tế: Có thêm cơ sở dịch tễ - sinh học để đánh giá tầm quan trọng của việc điều trị can thiệp bảo vệ gan ở giai đoạn sớm trước khi hình thành xơ gan không hồi phục.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo và mang tính đột phá nhất của luận án là gì?

Luận án đã mở rộng mô hình hoạt hóa tế bào hình sao gan hai giai đoạn của Friedman bằng cách chứng minh quá trình tự thực bào (Macroautophagy/Lipophagy) không đơn thuần là phản ứng thứ cấp đi kèm mà là "động cơ biến dưỡng bắt buộc" trong giai đoạn khởi đầu (Day 2 in vivo, 24h in vitro), thúc đẩy tiêu biến giọt lipid để cung cấp vật chất và năng lượng cho quá trình biệt hóa sang MFB.

2. Đổi mới phương pháp luận nuôi cấy in vitro của luận án vượt trội hơn các công bố quốc tế trước đây như thế nào?

Luận án đã khắc phục triệt để nhược điểm "tự hoạt hóa ngoài ý muốn" (spontaneous autoactivation) trên đĩa nhựa plastic 2D của các nghiên cứu truyền thống (như Xu et al., Hernández-Gea et al.) bằng việc sáng tạo môi trường nuôi cấy hydrogel Fibrin từ huyết tương đông lạnh. Nền giá thể này giúp duy trì trạng thái im lặng (qHSC) nguyên bản suốt 7 ngày với đầy đủ giọt lipid ORO+ và không bộc lộ $\alpha$-SMA.

3. Phát hiện bất ngờ nhất về mặt dữ liệu thực nghiệm là gì?

Đó là sự đồng thì hoàn hảo (synchronicity) giữa đỉnh tăng vọt của thông lượng tự thực (LC3-II) và đỉnh bộc lộ mRNA $\alpha$-SMA/Collagen I đúng tại mốc 48 giờ (Day 2) trên cả hai mô hình chuột khác biệt hoàn toàn về cơ chế tổn thương (độc chất $CCl_4$ hoại tử trung tâm tiểu thùy và phẫu thuật thắt ống mật BDL gây ứ mật vùng cửa).

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập thực nghiệm (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?

Toàn bộ thông số thực nghiệm được mô tả chi tiết với độ lặp lại cao: Tốc độ và áp lực truyền dịch qua tĩnh mạch cửa, nồng độ enzym Collagenase tối ưu, nồng độ gradient tỷ trọng Nycodenz (13%), nồng độ ức chế Chloroquine in vitro ($5,\mu\text{M}$) và liều lượng in vivo ($60\text{ mg/kg}$ tiêm phúc mạc tại mốc -24h và +24h).

5. Lộ trình phát triển nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình ra sao?

Trọng tâm 10 năm tới bao gồm: (1) Tạo dòng chuột chuyển gen bất hoạt chọn lọc gene tự thực bào trên HSC (Lrat-Cre; Atg5^fl/fl); (2) Phát minh hệ phân phát thuốc kích thước nano hướng đích thụ thể màng HSC nhằm hóa giải độc tính tế bào của các chất ức chế tự thực bào; (3) Thử nghiệm tiền lâm sàng pha 1/2 trên mô hình động vật linh trưởng và mẫu mô sinh thiết người.

Kết luận

1. Thiết lập quy trình chuẩn hóa: Xây dựng thành công quy trình phân lập tế bào hình sao gan sơ cấp từ chuột BALB/c đạt độ tinh sạch cao ($>90%$ Desmin+) và mô hình nuôi cấy duy trì trạng thái im lặng in vitro bằng hydrogel Fibrin huyết tương suốt 7 ngày.
2. Khám phá vai trò tự thực bào sớm: Xác nhận con đường tự thực bào (LC3-II, thoái giáng p62) được kích hoạt sớm và đồng thì với sự mất giọt lipid cùng sự gia tăng biểu hiện của $\alpha$-SMA và Collagen I trong pha khởi động hoạt hóa HSC in vitro.
3. Xác định mốc động học in vivo: Định vị mốc 48 giờ (Day 2) sau tổn thương cấp tính ($CCl_4$ và BDL) là thời điểm then chốt của giai đoạn khởi phát hoạt hóa HSC in vivo đi kèm sự bùng phát dòng tự thực bào.
4. Chứng minh hiệu quả dược lý của Chloroquine: Phong bế tự thực bào bằng Chloroquine ($5,\mu\text{M}$ in vitro và 2 liều $60\text{ mg/kg}$ in vivo) ức chế hữu hiệu sự chuyển dạng MFB, bảo tồn hàm lượng lipid nội bào, hạ men gan AST/ALT và giảm rõ rệt diện tích xơ hóa mô gan.
5. Mở ra hướng điều trị trúng đích mới: Đặt nền móng lý thuyết và công nghệ vững chắc cho việc phát triển các liệu pháp sinh học phân tử và hệ dẫn thuốc nano nhắm đích con đường tự thực bào tại tế bào hình sao gan nhằm phòng ngừa và đảo ngược tiến trình xơ hóa gan.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: MO DAU Giới thiệu Gan là một nội quan lớn nhất của cơ thể, thực hiện gần 500 chức năng khác nhau. Gan cũng là cơ quan chịu nhiều tác nhân gây ton thương như nhiễm virus viêm gan, sử dụng chất cồn, nhiễm mỡ, di truyền, và tự miễn. Tén thương mạn tính là quá trình tôn thương gan lặp lại trong thời gian dài, kết quả cuối cùng thường dẫn tới xơ gan. Xơ gan là nguyên nhân gây chết thứ 4 ở Châu Âu và thứ 14 trên thế giới.

Hiện nay, xơ gan chưa có thuốc điều trị đặc hiệu trên lâm sàng và ghép gan là chỉ định duy nhất cho bệnh nhân xơ gan giai đoạn cuối. Tuy nhiên, thiếu mô ghép, chỉ phí cao, gây xâm lấn, và thải loại. là các trở ngại của phương pháp này. Do đó, nhu cầu về các liệu pháp điều trị mới cho bệnh xơ gan là luôn cần thiết.

Dé phát triển liệu pháp ngăn ngừa, điều trị, chan đoán được hiệu quả và chính xác thì luôn cần các nghiên cứu về cơ chế bệnh ở cấp độ phân tử, tế bảo, và mô. Hơn một thập kỷ trở lại đây, các công bố về cơ chế bệnh lý của xơ gan đã dần chỉ ra được tế bào giữ vai trò then chốt trong tiến trình xơ hóa gan đó là tế bào hình sao gan (HSC). Khi gan bị ton thương, HSC đã trải qua hiện tượng hoạt hóa (activation) hay chuyên dang (transformation) thành nguyên bào sợi cơ (MFB). MEB là tế bao sản xuất các chất nền ngoại bảo (ECM), cấu trúc chính của mô xơ.

Trong gan khỏe mạnh, HSC nằm ở khoảng Disse và dự trữ trên 80% lượng vitamin A của gan. Khi gan tôn thương, HSC hoạt hóa thành MFB do các phân tử tín hiệu tiết ra từ phản ứng viêm và các tế bào ton thương. Gần đây, sự hoạt hóa của HSC được các nhà nghiên cứu thông nhất chia thành hai giai đoạn là giai đoạn khởi phat (initiation — giai đoạn sớm) và giai đoạn duy trì (perpetuation). Giai đoạn khởi phát là giai đoạn tế bào chuyên dạng từ hình sao sang nguyên bao sợi và giai đoạn duy trì là giai đoạn tế bao tôn tại ở dang MFB dé tăng sinh và tiết ECM, gây xơ hóa gan.

Các tín hiệu từ vi môi trường gan tôn thương sẽ cảm ứng các con đường nội bào của HSC, hay còn gọi là đáp ứng của tế bào trong quá trình hoạt hóa. Như vậy, các con đường tín hiệu nội bào này là cơ chê bệnh lý quan trọng cân được làm rõ, đây là đối tượng mà nghiên cứu này quan tâm. Một con đường sinh lý nội bào quan trọng trong tế bào nhân thực mới được phát hiện là sự tự thực bào (autophagy). Vai trò của sự tự thực bào là dọn dẹp, phân hủy vật chất tích tụ, và các bào quan bị sai hỏng dé cung cấp nguyên liệu và năng lượng giúp tế bào tăng sinh, biệt hóa, sống sót khi điều kiện môi trường bắt lợi.

Trong quá trình hoạt hóa của HSC, sự tự thực bào cũng được một số nghiên cứu chỉ ra là con được phân hủy giọt lipid, làm nguồn năng lượng tế bào hoạt hóa. Do đó, tác động ức chế tự thực bảo trên MEB làm tế bào giảm tăng sinh, đi vào chu trình chết. Tuy nhiên, mối liên hệ và ảnh hưởng của sự tự thực trong giai đoạn sớm của sự chuyền dang hay hoạt hóa HSC vẫn chưa được làm rõ. Trong khi giai đoạn này là giai đoạn quan trọng ở bước khởi phát quá trình xơ hóa gan.

Tác động tới sự hoạt hóa của HSC ở giai đoạn này là tiềm năng dé ngăn ngừa tiến trình xơ hóa gan. Mục tiêu của nghiên cứu này là tìm hiểu vai trò của quá trình tự thực bào trong giai đoạn sớm của sự hoạt hóa HSC nhăm hướng tới đề xuất các liệu pháp can thiệp trúng đích mới cho điều trị bệnh lý xơ hóa gan. Giả thuyết của chúng tôi là sự tự thực thúc đây sự hoạt hoá HSC ở giai đoạn sớm, dẫn tới việc chuyên dạng MFB, khởi phát cho tiến trình xơ hoá ở gan. Lý do chọn đề tài Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của sự sống, trong sinh lý và bệnh lý nói chung, nghiên cứu ở cấp độ tế bao luôn giữ vai trò chủ chốt giúp làm rõ cơ chế bệnh.

Ở bệnh lý xơ gan, HSC là một công cụ nghiên cứu cần thiết phục vụ cho việc tìm hiểu, giải thích cơ chế bệnh. Cơ sở cho việc phát triển các thuốc ngăn ngừa và điều trị, tìm ra marker phân tử phục vụ chân đoán bệnh hiệu quả. Hiện nay, nhiều thuốc đặc trị cho bệnh lý xơ gan đã và đang được thử nghiệm lâm sàng. Các thuốc này hầu hết đều là các phân tử tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên HSC hoạt hóa.

Do đó, HSC là đối tượng nghiên cứu mà chúng tôi lựa chọn cho đề tài này. Kết hợp với các công bố gần đây về một con đường sinh lý nội bào quan trọng của tế bào nhân thực là sự tự thực bào. Chúng tôi tiễn hành dé tài “Nghiên cứu sự hoạt hóa giai đoạn sớm in vitro và in vivo của tế bào hình sao gan trong môi quan hệ với sự tự thực” nhăm làm rõ thêm môi liên hệ của sự tự thực và sự hoạt hóa HSC và thử nghiệm tác động can thiệp vảo sự tự thực bảo trong quá trình hoạt hóa HSC in vitro va in vivo. Câu hỏi nghiên cứu Tác động can thiệp vao sự tự thực bao có ảnh hưởng tới giai đoạn sớm của sự hoạt hóa HSC in vitro và in vivo hay không? Đồng thời, tác động này dẫn tới tinh trạng bệnh lý gan cấp tính thế nào? Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá được mối liên hệ của sự tự thực bào lên giai đoạn sớm của sự hoạt hóa HSC in vitro và in vivo trong quá trình chuyên dạng thành nguyên bào sợi cơ dẫn tới quá trình xơ hóa gan.

Đối tượng nghiên cứu: Chuột BALB/c Albino, trên 5 tháng tuổi, khối lượng trung bình 25 gram. Dòng tế bào NIH/3T3: Dòng tế bào thương mại, có nguồn gốc từ nguyên bào sợi phôi chuột được sử dụng làm tế bào đối chứng cho các thử nghiệm cần thiết. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu gồm 4 nội dung: Nội dung 1: Nghiên cứu phân lập và nuôi cay HSC in vitro Nội dung 2: Đánh gia mối liên hệ và vai trò của su tự thực bào trong sự hoạt hóa giai đoạn sớm HSC in vitro Nội dung 3: Tao mô hình chuột ton thương gan cấp tinh và đánh giá trạng thai hoạt hóa ở HSC in vivo Nội dung 4: Khao sát ảnh hưởng cua tác nhân ức chế sự tự bào thực lên chuột mô hình và giai đoạn sớm của sự hoạt hóa HSC in vivo Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của nghiên cứu Xơ gan là căn bệnh gây nhiều hậu quả nghiêm trọng cho đời sống con người. Do đó, nghiên cứu làm rõ cơ chế phát sinh bệnh để phát triển liệu pháp mới cho điều trị là rất cần thiết.

Nghiên cứu này tiến hành trên đối tượng tế bào hình sao, một tế bào giữ vai trò chính trong bệnh lý xơ gan nói riêng và gan nói chung. Một con đường nội bào mới được phát hiện gần đây điều khiển quá sinh lý, bệnh lý của tế bào và cơ thê đó là sự tự thực bào. Vai trò quan trọng vả tiềm năng ứng dụng to lớn của sự tự thực đã được khẳng định bằng giải Nobel về sinh lý học năm 2016. Chủ đề nghiên cứu về mối liên hệ giữa cơ chế tự thực và sự hoạt hóa HSC dẫn đến bệnh lí xơ gan sẽ là hướng tiếp cận mới có ý nghĩa khoa học và thực tiễn trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh xơ gan.

CHƯƠNG 2: TONG QUAN TAI LIEU 2.1 Bénh ly xo gan va té bao hinh sao 2.1 Gan và bệnh ly xơ gan Cấu trúc giải phẫu Ở động vật có vú, gan là một nội quan lớn nhất trong cơ thé, có màu đỏ sam, năm ở góc phần tư trên bên phải của ô bụng. Gan được chia thành nhiều thùy (lobe), ở người là 2 thùy, ở động vat gam nhắm là 5 thùy. Đi kèm với gan là túi mật (gall bladder), nơi chứa dịch mật do tế bào gan (hepatocyte) sản xuất để tiết vào ruột non qua ống mật chủ (common bile duct - CBD). Ngoài động mạch gan (hepatic artery — HA) dẫn máu vào nuôi gan, tĩnh mạch chủ dưới (inferior vein cava — IVC) dẫn máu từ các nội quan và gan về tim, thì gan còn có hệ tĩnh mạch cửa (portal vein -PV) dẫn máu từ màng ruột vào [1] (hình 2.

Chi tiết hơn cấu trúc của gan là hình ảnh giải phẫu vi thé mô gan, ở cấp độ tế bào trong cấu trúc mô gan giữa các loài động vật có vú là tương tự nhau. Cụ thể, hình 2.1 cho thấy mô gan được cau tạo bởi các đơn vi cấu trúc và chức năng, gọi là tiêu thùy gan (lobule). Tiểu thùy gan có hình lục giác (hexagonal), chứa các tế bào nhu mô (parenchymal - PC) gan được bao quanh bởi các vách (septa) là mô liên kết. Các đỉnh của hình lục giác là bộ ba cửa (portal triad), tâm của nó là tinh mạch trung tâm (central vein - CV).

Bộ ba cửa gồm có các mạch nhánh của HA, PV và BD. Trong gan, tế bào được chia thành 2 nhóm gồm tế bào nhu mô và tế bào không nhu mô (NPC - nonparenchymal) (hình 2. PC hay còn gọi là tế bao gan chiếm khoảng 50% về số lượng và 80% về khối lượng/thể tích của gan. Tế bào gan thực hiện tat cả các chức năng của gan như sinh tổng hop protein, bién dưỡng, san xuất acid mật, dữ trữ các chất.

NPC gồm các loại tế bào khác của gan ngoại trừ PC gồm có: HSC dự trữ Vitamin A (VitA), tế bào nội mạch xoang gan (liver sinusoidal endothelial cell - LSEC) cau trac thành mạch xoang gan, tế bao kuffer (KC) thực bao ở gan, tế bào biểu mô ống mật (bile endothelial cell - BEC) cau trúc BD, nguyên bào sợi cơ (myofibroblast MFB) cấu trúc các mach mau trong gan. Lobule Tiểu thùy gan Portal vein (Tĩnh mạch cửa] Hepatocyte (tế bào gan) Sinusoid (Xoang gan} Central vein (Tĩnh mach trung tam) Hepatic artery (Động mach trung tam) Bile canaliculus (Kênh dan mat) Bile duct tỐng mật) Hepatocyte LSEC HSC Té bao hinh sao Created in BioRender.1: Hình mô phỏng cấu trúc tiểu thùy gan ở người và sự sắp xếp các loại tế bào trong tiểu thầy gan. Gan được tạo nên bởi các đơn vị cau trúc và chức năng là tiểu thùy (lobule).