CHƯƠNG 1: MO DAU Giới thiệu Gan là một nội quan lớn nhất của cơ thể, thực hiện gần 500 chức năng khác nhau. Gan cũng là cơ quan chịu nhiều tác nhân gây ton thương như nhiễm virus viêm gan, sử dụng chất cồn, nhiễm mỡ, di truyền, và tự miễn. Tén thương mạn tính là quá trình tôn thương gan lặp lại trong thời gian dài, kết quả cuối cùng thường dẫn tới xơ gan. Xơ gan là nguyên nhân gây chết thứ 4 ở Châu Âu và thứ 14 trên thế giới.
Hiện nay, xơ gan chưa có thuốc điều trị đặc hiệu trên lâm sàng và ghép gan là chỉ định duy nhất cho bệnh nhân xơ gan giai đoạn cuối. Tuy nhiên, thiếu mô ghép, chỉ phí cao, gây xâm lấn, và thải loại. là các trở ngại của phương pháp này. Do đó, nhu cầu về các liệu pháp điều trị mới cho bệnh xơ gan là luôn cần thiết.
Dé phát triển liệu pháp ngăn ngừa, điều trị, chan đoán được hiệu quả và chính xác thì luôn cần các nghiên cứu về cơ chế bệnh ở cấp độ phân tử, tế bảo, và mô. Hơn một thập kỷ trở lại đây, các công bố về cơ chế bệnh lý của xơ gan đã dần chỉ ra được tế bào giữ vai trò then chốt trong tiến trình xơ hóa gan đó là tế bào hình sao gan (HSC). Khi gan bị ton thương, HSC đã trải qua hiện tượng hoạt hóa (activation) hay chuyên dang (transformation) thành nguyên bào sợi cơ (MFB). MEB là tế bao sản xuất các chất nền ngoại bảo (ECM), cấu trúc chính của mô xơ.
Trong gan khỏe mạnh, HSC nằm ở khoảng Disse và dự trữ trên 80% lượng vitamin A của gan. Khi gan tôn thương, HSC hoạt hóa thành MFB do các phân tử tín hiệu tiết ra từ phản ứng viêm và các tế bào ton thương. Gần đây, sự hoạt hóa của HSC được các nhà nghiên cứu thông nhất chia thành hai giai đoạn là giai đoạn khởi phat (initiation — giai đoạn sớm) và giai đoạn duy trì (perpetuation). Giai đoạn khởi phát là giai đoạn tế bào chuyên dạng từ hình sao sang nguyên bao sợi và giai đoạn duy trì là giai đoạn tế bao tôn tại ở dang MFB dé tăng sinh và tiết ECM, gây xơ hóa gan.
Các tín hiệu từ vi môi trường gan tôn thương sẽ cảm ứng các con đường nội bào của HSC, hay còn gọi là đáp ứng của tế bào trong quá trình hoạt hóa. Như vậy, các con đường tín hiệu nội bào này là cơ chê bệnh lý quan trọng cân được làm rõ, đây là đối tượng mà nghiên cứu này quan tâm. Một con đường sinh lý nội bào quan trọng trong tế bào nhân thực mới được phát hiện là sự tự thực bào (autophagy). Vai trò của sự tự thực bào là dọn dẹp, phân hủy vật chất tích tụ, và các bào quan bị sai hỏng dé cung cấp nguyên liệu và năng lượng giúp tế bào tăng sinh, biệt hóa, sống sót khi điều kiện môi trường bắt lợi.
Trong quá trình hoạt hóa của HSC, sự tự thực bào cũng được một số nghiên cứu chỉ ra là con được phân hủy giọt lipid, làm nguồn năng lượng tế bào hoạt hóa. Do đó, tác động ức chế tự thực bảo trên MEB làm tế bào giảm tăng sinh, đi vào chu trình chết. Tuy nhiên, mối liên hệ và ảnh hưởng của sự tự thực trong giai đoạn sớm của sự chuyền dang hay hoạt hóa HSC vẫn chưa được làm rõ. Trong khi giai đoạn này là giai đoạn quan trọng ở bước khởi phát quá trình xơ hóa gan.
Tác động tới sự hoạt hóa của HSC ở giai đoạn này là tiềm năng dé ngăn ngừa tiến trình xơ hóa gan. Mục tiêu của nghiên cứu này là tìm hiểu vai trò của quá trình tự thực bào trong giai đoạn sớm của sự hoạt hóa HSC nhăm hướng tới đề xuất các liệu pháp can thiệp trúng đích mới cho điều trị bệnh lý xơ hóa gan. Giả thuyết của chúng tôi là sự tự thực thúc đây sự hoạt hoá HSC ở giai đoạn sớm, dẫn tới việc chuyên dạng MFB, khởi phát cho tiến trình xơ hoá ở gan. Lý do chọn đề tài Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của sự sống, trong sinh lý và bệnh lý nói chung, nghiên cứu ở cấp độ tế bao luôn giữ vai trò chủ chốt giúp làm rõ cơ chế bệnh.
Ở bệnh lý xơ gan, HSC là một công cụ nghiên cứu cần thiết phục vụ cho việc tìm hiểu, giải thích cơ chế bệnh. Cơ sở cho việc phát triển các thuốc ngăn ngừa và điều trị, tìm ra marker phân tử phục vụ chân đoán bệnh hiệu quả. Hiện nay, nhiều thuốc đặc trị cho bệnh lý xơ gan đã và đang được thử nghiệm lâm sàng. Các thuốc này hầu hết đều là các phân tử tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên HSC hoạt hóa.
Do đó, HSC là đối tượng nghiên cứu mà chúng tôi lựa chọn cho đề tài này. Kết hợp với các công bố gần đây về một con đường sinh lý nội bào quan trọng của tế bào nhân thực là sự tự thực bào. Chúng tôi tiễn hành dé tài “Nghiên cứu sự hoạt hóa giai đoạn sớm in vitro và in vivo của tế bào hình sao gan trong môi quan hệ với sự tự thực” nhăm làm rõ thêm môi liên hệ của sự tự thực và sự hoạt hóa HSC và thử nghiệm tác động can thiệp vảo sự tự thực bảo trong quá trình hoạt hóa HSC in vitro va in vivo. Câu hỏi nghiên cứu Tác động can thiệp vao sự tự thực bao có ảnh hưởng tới giai đoạn sớm của sự hoạt hóa HSC in vitro và in vivo hay không? Đồng thời, tác động này dẫn tới tinh trạng bệnh lý gan cấp tính thế nào? Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá được mối liên hệ của sự tự thực bào lên giai đoạn sớm của sự hoạt hóa HSC in vitro và in vivo trong quá trình chuyên dạng thành nguyên bào sợi cơ dẫn tới quá trình xơ hóa gan.
Đối tượng nghiên cứu: Chuột BALB/c Albino, trên 5 tháng tuổi, khối lượng trung bình 25 gram. Dòng tế bào NIH/3T3: Dòng tế bào thương mại, có nguồn gốc từ nguyên bào sợi phôi chuột được sử dụng làm tế bào đối chứng cho các thử nghiệm cần thiết. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu gồm 4 nội dung: Nội dung 1: Nghiên cứu phân lập và nuôi cay HSC in vitro Nội dung 2: Đánh gia mối liên hệ và vai trò của su tự thực bào trong sự hoạt hóa giai đoạn sớm HSC in vitro Nội dung 3: Tao mô hình chuột ton thương gan cấp tinh và đánh giá trạng thai hoạt hóa ở HSC in vivo Nội dung 4: Khao sát ảnh hưởng cua tác nhân ức chế sự tự bào thực lên chuột mô hình và giai đoạn sớm của sự hoạt hóa HSC in vivo Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của nghiên cứu Xơ gan là căn bệnh gây nhiều hậu quả nghiêm trọng cho đời sống con người. Do đó, nghiên cứu làm rõ cơ chế phát sinh bệnh để phát triển liệu pháp mới cho điều trị là rất cần thiết.
Nghiên cứu này tiến hành trên đối tượng tế bào hình sao, một tế bào giữ vai trò chính trong bệnh lý xơ gan nói riêng và gan nói chung. Một con đường nội bào mới được phát hiện gần đây điều khiển quá sinh lý, bệnh lý của tế bào và cơ thê đó là sự tự thực bào. Vai trò quan trọng vả tiềm năng ứng dụng to lớn của sự tự thực đã được khẳng định bằng giải Nobel về sinh lý học năm 2016. Chủ đề nghiên cứu về mối liên hệ giữa cơ chế tự thực và sự hoạt hóa HSC dẫn đến bệnh lí xơ gan sẽ là hướng tiếp cận mới có ý nghĩa khoa học và thực tiễn trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh xơ gan.
CHƯƠNG 2: TONG QUAN TAI LIEU 2.1 Bénh ly xo gan va té bao hinh sao 2.1 Gan và bệnh ly xơ gan Cấu trúc giải phẫu Ở động vật có vú, gan là một nội quan lớn nhất trong cơ thé, có màu đỏ sam, năm ở góc phần tư trên bên phải của ô bụng. Gan được chia thành nhiều thùy (lobe), ở người là 2 thùy, ở động vat gam nhắm là 5 thùy. Đi kèm với gan là túi mật (gall bladder), nơi chứa dịch mật do tế bào gan (hepatocyte) sản xuất để tiết vào ruột non qua ống mật chủ (common bile duct - CBD). Ngoài động mạch gan (hepatic artery — HA) dẫn máu vào nuôi gan, tĩnh mạch chủ dưới (inferior vein cava — IVC) dẫn máu từ các nội quan và gan về tim, thì gan còn có hệ tĩnh mạch cửa (portal vein -PV) dẫn máu từ màng ruột vào [1] (hình 2.
Chi tiết hơn cấu trúc của gan là hình ảnh giải phẫu vi thé mô gan, ở cấp độ tế bào trong cấu trúc mô gan giữa các loài động vật có vú là tương tự nhau. Cụ thể, hình 2.1 cho thấy mô gan được cau tạo bởi các đơn vi cấu trúc và chức năng, gọi là tiêu thùy gan (lobule). Tiểu thùy gan có hình lục giác (hexagonal), chứa các tế bào nhu mô (parenchymal - PC) gan được bao quanh bởi các vách (septa) là mô liên kết. Các đỉnh của hình lục giác là bộ ba cửa (portal triad), tâm của nó là tinh mạch trung tâm (central vein - CV).
Bộ ba cửa gồm có các mạch nhánh của HA, PV và BD. Trong gan, tế bào được chia thành 2 nhóm gồm tế bào nhu mô và tế bào không nhu mô (NPC - nonparenchymal) (hình 2. PC hay còn gọi là tế bao gan chiếm khoảng 50% về số lượng và 80% về khối lượng/thể tích của gan. Tế bào gan thực hiện tat cả các chức năng của gan như sinh tổng hop protein, bién dưỡng, san xuất acid mật, dữ trữ các chất.
NPC gồm các loại tế bào khác của gan ngoại trừ PC gồm có: HSC dự trữ Vitamin A (VitA), tế bào nội mạch xoang gan (liver sinusoidal endothelial cell - LSEC) cau trac thành mạch xoang gan, tế bao kuffer (KC) thực bao ở gan, tế bào biểu mô ống mật (bile endothelial cell - BEC) cau trúc BD, nguyên bào sợi cơ (myofibroblast MFB) cấu trúc các mach mau trong gan. Lobule Tiểu thùy gan Portal vein (Tĩnh mạch cửa] Hepatocyte (tế bào gan) Sinusoid (Xoang gan} Central vein (Tĩnh mach trung tam) Hepatic artery (Động mach trung tam) Bile canaliculus (Kênh dan mat) Bile duct tỐng mật) Hepatocyte LSEC HSC Té bao hinh sao Created in BioRender.1: Hình mô phỏng cấu trúc tiểu thùy gan ở người và sự sắp xếp các loại tế bào trong tiểu thầy gan. Gan được tạo nên bởi các đơn vị cau trúc và chức năng là tiểu thùy (lobule).