Tổng quan luận án
Đại dương bao phủ hơn 70% bề mặt Trái Đất và là nơi sinh sống của gần 300.000 loài động vật, thực vật cùng vi sinh vật. Nguồn tài nguyên sinh vật biển phong phú này cung cấp nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp như thực phẩm, mỹ phẩm và hóa dược. Các hợp chất tự nhiên phân lập từ sinh vật biển sở hữu cấu trúc hóa học đa dạng và nhiều hoạt tính sinh học giá trị, cung cấp các mô hình cấu trúc cho việc phát triển dược phẩm mới. Vùng biển Việt Nam có diện tích trên 1 triệu km², nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa với hệ thống cửa sông dày đặc, tạo điều kiện thuận lợi cho hệ sinh thái biển phát triển phong phú về trữ lượng và chủng loại. Dù các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên biển tại Việt Nam đã bắt đầu từ thập niên 1970, các công trình khoa học trong nước vẫn còn tản mát và chưa tương xứng với tiềm năng, đặc biệt là các nghiên cứu chuyên sâu về ngành Da gai (Echinodermata).
Ngành Da gai gồm 5 lớp chính: Sao biển (Asteroidea), Sao biển rắn (Ophiuroidea), Cầu gai (Echinoidea), Hải sâm (Holothuroidea) và Huệ biển (Crinoidea). Đây là nguồn tự nhiên dồi dào cung cấp các steroid phân cực mang nhiều hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, giảm đau, hạ huyết áp, chống khối u, chống virus, làm tan máu và tác động lên sự truyền tín hiệu thần kinh. Nhóm steroid phân cực từ sao biển đã được nghiên cứu tại Nga, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản và Italia, song tại Việt Nam trước đây chưa có công trình nào nghiên cứu chuyên sâu về lớp chất này. Nhằm tạo cơ sở khoa học cho công tác phát hiện và phát triển dược phẩm mới từ nguồn tài nguyên biển trong nước, luận án tập trung nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nhóm chất steroid phân cực từ loài sao biển Archaster typicus.
Nội dung nghiên cứu của luận án được xác định gồm 3 nhiệm vụ cụ thể:
- Phân lập các hợp chất steroid phân cực từ loài sao biển Archaster typicus của Việt Nam.
- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.
- Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các chất phân lập được.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Loài sao biển Archaster typicus Muller & Troschel, 1840, thuộc giống Archaster, họ Archasteridae, bộ Valvatida, lớp Asteroidea, ngành Echinodermata.
- Phạm vi không gian: Vùng biển ven bờ tỉnh Quảng Ninh, Việt Nam (khu vực đáy cát mịn ven các đảo có độ mặn cao và ổn định).
- Phạm vi thời gian và mẫu vật: Mẫu sinh vật được thu thập vào tháng 08/2008, do PGS. TS. Đỗ Công Thung thuộc Viện Tài nguyên và Môi trường biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên loài và lưu giữ tiêu bản.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Lớp Sao biển (Asteroidea) thuộc ngành Da gai (Echinodermata) gồm các loài động vật không xương sống sống ở đáy biển, cơ thể dẹp theo hướng lưng - bụng, mang đối xứng tỏa tròn bậc 5 hoặc nhiều cánh. Chiều dài cánh biến thiên từ 1–1,5 cm đến 80 cm; sự di chuyển thực hiện nhờ hệ thống chân ống với tốc độ khoảng 5–10 cm/phút. Lớp Asteroidea được chia thành 7 bộ: Brisingida, Forcipulatida, Notomyotida, Paxillosida, Spinulosida, Valvatida và Velatida, với khoảng 1.800 loài phân bố trên toàn cầu, tập trung mật độ cao tại vùng biển nhiệt đới Ấn Độ - Thái Bình Dương. Tại Việt Nam, có khoảng 60 loài sao biển phân bố dọc bờ biển từ Bắc vào Nam.
Loài sao biển Archaster typicus được Lamarck mô tả năm 1816, thuộc họ Archasteridae trong bộ Valvatida (bộ này gồm 14 họ: Acanthasteridae, Archasteridae, Asterinidae, Asterodiscididae, Chaetasteridae, Ganeriidae, Leilasteridae, Goniasteridae, Mithrodidae, Odontasteridae, Ophidiasteridae, Oreasteridae, Poraniidae và Pseudarchasteridae). Chi Archaster chỉ có 3 loài: Archaster angulatus, Archaster laevis và Archaster typicus. Tên đồng danh của loài gồm Archaster nicobaricus Behn in Mobius, 1859 và Astropecten stellaris Gray, 1840.
Thống kê tài liệu quốc tế cho thấy khoảng 80 loài sao biển đã được nghiên cứu về thành phần hóa học, phân lập được hơn 200 hợp chất, trong đó nhóm steroid chiếm trên 50%, ceramide chiếm trên 20%, bên cạnh ancaloit và axit béo. Nhóm steroid phân cực từ sao biển được chia thành 4 nhóm cấu trúc chính:
- Polyhydroxy steroid: Các dẫn xuất sterol chứa nhiều nhóm hydroxyl trên khung và mạch nhánh, xuất hiện phổ biến ở hầu hết các loài sao biển.
- Steroid sulfate: Các phân tử steroid gắn một hoặc nhiều nhóm ester sulfate (-OSO₃⁻) tại khung hoặc mạch nhánh.
- Glycoside polyhydroxy steroid: Hợp chất gồm nhân polyhydroxy steroid liên kết với một hoặc nhiều đơn vị đường đơn (như xylose, arabinose, glucose, quinovose, fucose).
- Asterosaponine: Các saponin đặc trưng của sao biển, thường chứa mạch đường phức tạp gắn tại C-3 và nhóm sulfate tại C-6 của khung steroid.
Tổng hợp tài liệu về các nhóm chất và hoạt tính sinh học
| Nhóm hoạt tính sinh học |
Nhóm chất tiêu biểu |
Các loài sao biển chứa hợp chất hoạt tính |
Tài liệu trích dẫn |
| Gây độc tế bào |
Polyhydroxy steroid, Steroid sulfate, Glycoside polyhydroxy steroid, Asterosaponine |
Certonardoa semiregularis, Hippasteria phrygiana, Luidia quinaria, Anthenea chinensis, Culcita novaeguineae |
[16], [21], [62], [79], [102], [108-111] |
| Kháng khuẩn, kháng nấm |
Polyhydroxy steroid, Steroid sulfate, Glycoside polyhydroxy steroid, Asterosaponine |
Certonardoa semiregularis, Anasterias minuta |
[12], [13], [110], [111] |
| Tán huyết |
Polyhydroxy steroid, Glycoside polyhydroxy steroid, Asterosaponine |
Henricia leviuscula, Culcita novaeguineae |
[33], [40], [67], [101] |
| Tác động thần kinh (Neuritogenic) |
Glycoside polyhydroxy steroid |
Linckia laevigata |
[23], [24], [46], [81], [85-87] |
Nhiều công trình quốc tế đã khảo sát chi tiết hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất này:
- Về polyhydroxy steroid: Wang và cs (2003, 2004) phân lập certonardosterol A-M (1–13) và các chất 14–36 từ Certonardoa semiregularis (Hàn Quốc), trong đó có các dẫn xuất tetrol hiếm và khung chứa nhóm xeton tại C-8 hoặc nối đôi C8–C14 [107, 108, 111]. Levina EV và cs (2004) tách được dẫn xuất polyhydroxy steroid liên kết triseramide 37 từ Astropecten triseriatus [63]. Stonik và cs (2002–2005), Kicha A. và cs phân lập các hợp chất 38–41, 43–45 từ Henricia sanguinolenta, H. leviuscula, H. tumida; chất phrygiasterol 42 chứa vòng cyclopropane từ Hippasteria phrygiana [60, 62, 66, 67].
- Về steroid sulfate: Nhóm nghiên cứu tại Viễn Đông (Nga, 2001) phân lập cholesterol sulfate 47, 5α-cholestan-3β-ol sulfate 48 và 5α-cholestan-7-ene-3β-ol sulfate 49 từ Leptasterias alaskensis asiatica và L. fisheri [41]; phân lập alkaloid steroid muối isoquinolinium và tyrammonium 50–58 từ Lethasterias nanimensis chelifera [44, 50]. Các steroid sulfate khác được tìm thấy ở Asterias amurensis (47, 53, 55, 59–61), Pteraster pulvillus (disulfate 70–73), Diplopteraster multiples (74), Pteraster obscurus và Asteronyx loveni (75–78), Plazaster borealis (disulfate 79) [34, 56, 64, 69, 98].
- Về glycoside polyhydroxy steroid: Palagiano và cs (1996) phân lập 20 glycoside từ Herrica downeaye. Wang và cs phân lập certonardosides A–J (80–89) và K–N (90–93) từ C. semiregularis [110, 112]. Nhóm nghiên cứu Nhật Bản và Trung Quốc phát hiện linckosides A–K, M–Q (106–121) và granulatoside A (122) từ Linckia laevigata [24, 85–87]. Tại Việt Nam, Kicha và cs (2007) phân lập linckosides L1–L7 (123–129) từ mẫu L. laevigata [43, 46, 47]. Các glycoside khác gồm minutosides A–B (130–131) từ Anasterias minuta, lysastroside A (132) từ Lysastrosoma anthosticta, sanguinosides A–C (133–135) từ Henricia, phrygiosides A–B (136–137) từ Hippasteria phrygiana, asperosides A–B (138–139), tumidosides A–B (140–141), milleporosides A–B (146–147), trofosides A–B (148–149), fuscasides A–B (151–152), heffernanosides A–C (157–159), và kurilensosides A–D (163–166) [12, 33, 35, 40, 45, 57, 58, 61, 65, 66].
- Về asterosaponine: Tang HF và cs (2005) tách novaeguinosides A, I, II (167–169) và 170–173 từ Culcita novaeguineae [102, 103]. Các dẫn xuất khác gồm anasterosides A–B (174–175) từ Anasterias minuta, luidiaquinoside (176) từ Luidia quinaria, psilasteroside (177) từ Psilaster cassiope, ruberosides E–G (178–180) từ Asterias rubens, và các hợp chất 181–182 từ Novodinia antillensis [13, 16, 92, 93, 113].
Hoạt tính gây độc tế bào của một số polyhydroxy steroid từ Certonardoa semiregularis (theo Wang và cs)
| Hợp chất |
$IC_{50}$ đối với A549 ($\mu\text{M}$) |
$IC_{50}$ đối với SK-OV-3 ($\mu\text{M}$) |
$IC_{50}$ đối với KS-MEL-2 ($\mu\text{M}$) |
$IC_{50}$ đối với XF498 ($\mu\text{M}$) |
$IC_{50}$ đối với HCT15 ($\mu\text{M}$) |
| 14 |
0,15 |
0,08 |
0,09 |
0,07 |
0,01 |
| 16 |
0,82 |
0,90 |
0,40 |
0,43 |
1,25 |
| 19 |
0,48 |
0,83 |
0,28 |
0,40 |
1,26 |
| 20 |
0,54 |
0,69 |
0,40 |
0,33 |
0,73 |
| 21 |
1,75 |
1,51 |
0,48 |
1,22 |
1,25 |
| 22 |
0,15 |
0,16 |
<0,10 |
0,08 |
0,25 |
| 30 |
0,43 |
0,22 |
0,17 |
0,12 |
0,48 |
| Doxorubicin (đối chứng) |
0,04 |
0,12 |
0,05 |
0,12 |
0,18 |
Về các nghiên cứu trên loài Archaster typicus:
- Trên thế giới: Riccio và cộng sự (1986, 1989) đã phân lập được 12 hợp chất steroid phân cực gồm các dẫn xuất polyhydroxy steroid và steroid sulfate (hợp chất 1–7 và 10–12), tiêu biểu là các cấu trúc 27-norcholestane nonaol, octaol và cholestane sulfate [90, 91].
- Tại Việt Nam: Năm 2007, nhóm tác giả Châu Văn Minh và cs đã phân lập được 7 hợp chất ký hiệu SB1–SB7 gồm: Cholest-7-en-3-on (SB1), Cholesterol (SB2), Batilol (SB3), Ergost-22-en-3β,4β,5α,6α,8β,14α,15α,22E,24R,25R,26-nonol (SB4), 27-Norcholestan-3β,4β,5α,6α,8β,14α,15α,24R-octol (SB5), 27-Norcholestan-3β,4β,5α,6α,7β,8β,14α,15α,24R-nonol (SB6), và cerebroside SB7 [10, 82]. Trong đó, SB7 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên 2 dòng ung thư gan (Hep-G2) và ung thư phổi (Lu) [9].
Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Các công trình trước đây tại Việt Nam về Archaster typicus mới dừng lại ở việc khảo sát chung thành phần hóa học cơ bản và cerebroside mà chưa đi sâu nghiên cứu có hệ thống về nhóm chất steroid phân cực. Luận án giải quyết khoảng trống này thông qua việc phân lập toàn diện, xác định cấu trúc hóa học lập thể của các dẫn xuất steroid phân cực mới và đã biết, đồng thời đánh giá hoạt tính sinh học trên các mô hình tế bào và sinh học biển.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được triển khai theo hướng tiếp cận thực nghiệm hóa học các hợp chất thiên nhiên kết hợp sinh học phân tử và thử nghiệm dược lý in vitro. Khung lý thuyết dựa trên đặc điểm cấu tạo của các steroid phân cực biển (khung cyclopentanoperhydrophenanthrene gắn nhiều nhóm hydroxyl, liên kết ester sulfate, liên kết glycoside) và mối liên quan giữa cấu trúc lập thể với hoạt tính sinh học (độc tính tế bào, tính phá huyết, ức chế thụ tinh).
Phương pháp phân lập và tinh chế hóa học
- Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 $F_{254}$ (Merck) và bản mỏng tráng sẵn của Nga (kích thước 4,5 cm × 6,0 cm, cỡ hạt 5–17 $\mu\text{m}$, Sorbpolimer). Phát hiện vết chất dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc phun thuốc thử dung dịch $H_2SO_4$/EtOH 5%, sấy khô và hơ nóng trên bếp điện.
- Sắc ký trao đổi ion/loại muối: Sử dụng cột Polychrome (đường kính 70 mm, chiều dài 260 mm) để loại bỏ muối vô cơ trong dịch chiết nước bằng cách rửa giải với 11 lít nước cất (kiểm tra ion $Cl^-$ bằng dung dịch $AgNO_3$ 1N cho đến khi không còn kết tủa trắng $AgCl$), sau đó rửa giải hoạt chất hữu cơ bằng 7 lít ethanol.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC): Thực hiện trên máy Agilent 1100, sử dụng cột Diasfer-110-$C_{18}$ (kích thước 10 $\mu\text{m}$, 250 × 15 mm cho bán điều chế và 0,4 × 250 mm cho phân tích/tinh chế tinh), tốc độ dòng 2,5 ml/phút, pha động đẳng dòng gồm các hệ dung môi EtOH/$H_2O$ hoặc EtOH/$H_2O$/$NH_4OAc$ 1N theo các tỷ lệ thể tích xác định.
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
- Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS và ESI-MS/MS): Đo trên thiết bị Agilent 6510 Q-TOF LC/MS tại Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC), Phân viện Viễn Đông - Viện Hàn lâm Khoa học LB Nga.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên máy Bruker DRX 500 MHz (tần số 125,8 MHz đối với $^{13}\text{C}$), sử dụng Tetramethylsilane (TMS) làm chất chuẩn nội. Dung môi sử dụng gồm $CD_3OD$, $CDCl_3$, Pyridin-$d_5$. Các kỹ thuật phổ gồm: 1D-NMR ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT 90°, DEPT 135°) và 2D-NMR (HSQC, HMBC, $^1\text{H}$-$^1\text{H}$ COSY, TOCOSY, NOESY).
- Sắc ký khí (GC): Thực hiện trên máy Agilent 6580, khí mang He (tốc độ 1,7 ml/phút), chương trình nhiệt độ 100°C (giữ 5 phút) – tăng 5°C/phút – 250°C (giữ 30 phút), cột mao quản HP-5 MS (30 m × 0,25 mm), nhiệt độ buồng tiêm 280°C.
- Độ quay cực $[\alpha]_D$: Đo trên phân cực kế Perkin-Elmer Polarimeter Model 343.
- Phương pháp Mosher (xác định cấu hình tuyệt đối): Điều chế $(S)$-MTPA este và $(R)$-MTPA este bằng cách cho chất thử phản ứng với $(R)$-MTPA clorua hoặc $(S)$-MTPA clorua cùng 4-dimethylaminopyridine (DMAP) trong dung môi $CH_2Cl_2$ ở nhiệt độ phòng qua đêm; sản phẩm được làm sạch bằng TLC điều chế hệ $n$-hexan/EtOAc (4:1) và đo phổ $^1\text{H}$-NMR để tính toán độ dịch chuyển hóa học $\Delta\delta = \delta_S - \delta_R$.
- Thủy phân và xác định cấu hình tuyệt đối của gốc đường: Glycoside (1,0 mg) được thủy phân bằng axit trifluoroacetic 2M (TFA) ở 100°C trong 2 giờ; dịch thủy phân sau khi cô khô cho phản ứng với $(-)$-2-octanol và TFA đậm đặc ở 130°C trong 6 giờ; hỗn hợp tiếp tục được acetyl hóa bằng pyridine/acetic anhydride (1:1) trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng và phân tích sắc ký khí (GC) so sánh thời gian lưu ($t_R$) với các mẫu đường chuẩn D-glucose và L-glucose đã acetyl hóa tương ứng.
Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào (MTS assay): Thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung người (HeLa) và dòng tế bào biểu mô chuột (JB6 Cl 41). Tế bào được nuôi trong môi trường MEM hoặc RPMI chứa 5% huyết thanh phôi bò (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin và 100 $\mu\text{g}$/ml streptomycin ở 37°C, 5% $CO_2$. Sau 22 giờ ủ với chất thử ở các nồng độ khác nhau, bổ sung 20 $\mu\text{l}$ tác nhân MTS, ủ tiếp 2 giờ và đo mật độ quang trên máy $\mu$Quant microplate reader ở bước sóng 492 nm và 690 nm. Tỷ lệ ức chế (%) được tính dựa trên cường độ huỳnh quang (FI) so với mẫu trắng.
- Đánh giá hoạt tính phiên mã NF-$\kappa$B và p53 trên dòng tế bào JB6 Cl 41: Tế bào JB6 Cl 41 ($8\times 10^3$ tế bào/giếng) được đồng biến nạp với plasmid phóng xạ JB6-Luc NF-$\kappa$B hoặc JB6-Luc p53 (PG-13). Sau 24 giờ biến nạp, xử lý với chất thử ở các nồng độ 6,25; 12,5; 25,0; 50,0 $\mu\text{M}$. Sau 24 giờ ủ, tế bào được giải ly bằng dung dịch đệm (chứa Triton X-100 1%, 1 mM DTT, 2 mM EDTA) và xác định hoạt tính luciferase trên máy Luminoscan Ascent Type 392.
- Đánh giá hoạt tính ức chế sự thụ tinh và phát triển phôi cầu gai Strongylocentrotus intermedius: Thu nhận giao tử bằng cách tiêm dung dịch KCl 5% vào khoang bụng cầu gai đực và cái. Chất thử hòa tan trong DMSO 1% ở các nồng độ 5, 10, 25, 50 $\mu\text{M}$.
- Thử nghiệm ức chế thụ tinh: Huyền phù tinh trùng trong nước biển được ủ với chất thử trong 15 phút trước khi bổ sung trứng (1.000 tế bào/ml); sau 15 phút cố định bằng formaldehyde 2%, đếm tỷ lệ thụ tinh (dựa trên màng thụ tinh) dưới kính hiển vi đảo ngược.
- Thử nghiệm ức chế phát triển phôi 8: Trứng đã thụ tinh được ủ cùng chất thử ở 18–20°C cho đến khi mẫu đối chứng đạt giai đoạn phôi 8 tế bào; đếm số lượng phôi đạt chuẩn dưới kính hiển vi đảo ngược. Giá trị $EC_{50}$ và $EC_{100}$ được tính toán đồ họa bằng phần mềm SigmaPlot 3.02 (Jandel).
Nội dung chính theo từng chương
Chương I – Tổng quan tài liệu
Chương này hệ thống hóa toàn diện các dữ liệu khoa học về ngành Da gai, lớp Sao biển và loài Archaster typicus. Tác giả phân tích chi tiết cấu trúc hóa học của 4 nhóm steroid phân cực (polyhydroxy steroid, steroid sulfate, glycoside polyhydroxy steroid, asterosaponine) phân lập từ các loài sao biển trên thế giới cùng các hoạt tính sinh học đi kèm (độc tế bào ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, tăng sinh sợi thần kinh neuritogenic, ức chế thụ tinh và tán huyết). Chương I cũng điểm lại toàn bộ lịch sử nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Archaster typicus trên thế giới (công trình của Riccio và cs các năm 1986, 1989 phân lập 12 hợp chất steroid phân cực) và tại Việt Nam (công trình của Châu Văn Minh và cs năm 2007 phân lập 7 hợp chất SB1–SB7), làm nổi bật cơ sở khoa học và lý do chọn đề tài.
Chương II – Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương II trình bày cụ thể thông tin mẫu vật nghiên cứu (7 kg mẫu sao biển Archaster typicus tươi thu thập tại Quảng Ninh vào tháng 08/2008). Chương này mô tả chi tiết các thông số kỹ thuật, xuất xứ của hệ thống máy móc phân tích hiện đại tại Viện Hóa sinh hữu cơ Thái Bình Dương (PIBOC) thuộc Viện Hàn lâm Khoa học LB Nga (HPLC Agilent 1100, HR-ESI-MS Agilent 6510 Q-TOF, NMR Bruker DRX 500 MHz, GC Agilent 6580, Phân cực kế Perkin-Elmer Model 343). Toàn bộ các quy trình thao tác chuẩn về phân lập sắc ký, phương pháp Mosher xác định cấu hình lập thể, phương pháp thủy phân hóa học xác định đồng phân quang học của đường bằng GC, cùng các giao thức thử nghiệm sinh học in vitro (độc tế bào MTS, luciferase reporter gene, ức chế thụ tinh và phân chia phôi cầu gai) được mô tả chuẩn xác và chi tiết.
Chương III – Thực nghiệm
Chương III trình bày quá trình thực nghiệm chiết tách, phân lập và các hằng số vật lý, dữ liệu phổ của các hợp chất tinh khiết thu được từ 7 kg mẫu sao biển Archaster typicus. Quy trình chiết xuất và phân lập được thực hiện như sau:
- Mẫu tươi (7 kg) thái nhỏ, ngâm chiết 3 lần với ethanol (15 lít/lần, mỗi lần 1 tuần) ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết gộp lại và cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 120 g dịch cô A.
- Dịch cô A hòa trong 1 lít nước cất, nạp lên cột sắc ký Polychrome (kích thước 70 × 260 mm), rửa loại muối bằng 11 lít nước cất đến khi dịch rửa không phản ứng với $AgNO_3$ 1N, sau đó rửa giải hợp chất hữu cơ bằng 7 lít ethanol, thu được 3 phân đoạn chính: 1 (29,7 g), 2 (1,2 g), 3 (1,7 g).
- Thực hiện sắc ký lỏng cao áp pha đảo RP-HPLC trên các phân đoạn thu được các hợp chất đơn lẻ:
7 kg Mẫu Sao biển tươi (Quảng Ninh)
Dịch cô A (120 g)
Rửa giải bằng EtOH (7 L)
Phân đoạn 1 (29,7 g) Phân đoạn 2 (1,2 g) Phân đoạn 3 (1,7 g)
Các phân đoạn nhỏ & hợp chất tinh khiết:
- Phân đoạn 131 --> AT4 (1,5 mg)
- Phân đoạn 134 --> 134-5 --> A12 (1,5 mg); 134-7 --> A1 (2,5 mg)
- Phân đoạn 135 --> A13 (7,0 mg); A6 (1 mg), A7 (1,5 mg), A8 (6,0 mg), A9 (72,3 mg)
- Phân đoạn 142 --> 142-4 --> A4 (3,0 mg); 142-5 --> A3 (1,4 mg)
- Phân đoạn 143 --> 143-1 --> A10 (4,6 mg); 143-6 --> A5 (2,0 mg)
- Phân đoạn 15 --> 15-7 --> A2 (2,5 mg)
- Phân đoạn 17 --> 17-10 --> A16 (Archasteroside C); 17-12 --> A15 (Archasteroside B);
17-13 --> A14 (Archasteroside A)
Đặc tính lý hóa và dữ liệu phổ của các hợp chất tiêu biểu được phân lập
| Ký hiệu chất |
Tên hóa học / Cấu trúc xác định |
Tình trạng phát hiện |
Trọng lượng phân tử ($M$) & Công thức phân tử |
Dữ liệu phổ khối ($m/z$) và hằng số vật lý tiêu biểu |
| AT4 |
(24R)-27-nor-5$\alpha$-cholestane-3$\beta$,6$\alpha$,8,14,15$\alpha$,24-hexaol |
Hợp chất mới |
$M = 454$
$C_{26}H_{45}O_6$ |
Tính toán lý thuyết cho $C_{26}H_{45}O_6$: $M = 453,3222$. Dạng rắn, vô định hình. |
| A1 |
(24R)-27-nor-5$\alpha$-cholestane-3$\beta$,4$\beta$,6$\alpha$,8,14,15$\alpha$,24-heptaol |
Hợp chất mới |
$M = 470$
$C_{26}H_{46}O_7$ |
HR-ESI-MS: $m/z$ 493,3138 $[M + Na]^+$. (-)-ESI-MS: $m/z$ 469 $[M - H]^-$. Dẫn xuất 3,6,24-tri-$(S)$-MTPA và $(R)$-MTPA este. |
| A2 |
Steroid glycoside chứa khung polyhydroxy steroid và gốc đường D-glucose |
Hợp chất đã phân lập |
$M = 664$
$C_{32}H_{56}O_{14}$ |
HR-ESI-MS: $m/z$ 687,3575 $[M + Na]^+$. GC dẫn xuất acetyl hóa: $t_R = 28,27; 28,86; 29,0; 29,38$ phút (khớp chuẩn D-glucose). |
| A3 |
(24R)-5$\alpha$-cholestane-3$\beta$,4$\beta$,5,6$\alpha$,8,14,15$\alpha$,24,26-nonaol |
Hợp chất mới |
$M = 516$
$C_{27}H_{48}O_9$ |
HR-ESI-MS: $m/z$ 539,3191 $[M + Na]^+$. Dạng rắn, vô định hình. |
| A4 |
Muối natri (24S)- & (24R)-5$\alpha$-cholest-25(27)-ene-3$\beta$,6$\alpha$,8,14,15$\alpha$,24,26-heptaol 15-O-sulfate |
Hợp chất mới |
$M = 584$
$C_{27}H_{45}O_{10}SNa$ |
HR-ESI-MS: $m/z$ 607,2535 $[M + Na]^+$. (-)-ESI-MS/MS pic 561 cho mảnh 97 $[HSO_4]^-$ và 80 $[SO_3]^-$. $[\alpha]_D^{25} = +85^\circ$ ($c$ 0,1, EtOH). |
| A5 |
Muối natri (23E)-27-Nor-25-oxo-5$\alpha$-cholest-23-ene-3$\beta$,6$\alpha$,8,14,15$\alpha$-pentaol 15-O-sulfate |
Hợp chất mới |
Xác định cấu trúc |
Dạng rắn, vô định hình. |
| A14 |
Archasteroside A |
Hợp chất phân lập |
Xác định cấu trúc |
Phân lập từ phân đoạn 17-13 bằng HPLC (hệ EtOH/$H_2O$/$NH_4OAc$ 72:27:1). |
| A15 |
Archasteroside B |
Hợp chất phân lập |
Xác định cấu trúc |
Phân lập từ phân đoạn 17-12 bằng HPLC (hệ EtOH/$H_2O$/$NH_4OAc$ 75:24:1). |
| A16 |
Archasteroside C |
Hợp chất phân lập |
Xác định cấu trúc |
Phân lập từ phân đoạn 17-10 bằng HPLC (hệ EtOH/$H_2O$/$NH_4OAc$ 72:27:1). |
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp về mặt lý luận và khoa học
- Luận án là công trình nghiên cứu hệ thống đầu tiên tại Việt Nam về lớp chất steroid phân cực từ loài sao biển Archaster typicus.
- Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của nhiều hợp chất steroid phân cực mới gồm các polyhydroxy steroid mang khung carbon 27-norcholestane và cholestane (AT4, A1, A3), các steroid sulfate mang nhóm sulfate tại vị trí C-15 (A4, A5), cùng các glycoside polyhydroxy steroid (nhóm Archasteroside A–C: A14, A15, A16).
- Kết hợp thành công các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều hiện đại ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT, HSQC, HMBC, COSY, TOCOSY, NOESY), phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS/MS với các phương pháp hóa học biến tính lập thể (phương pháp Mosher este hóa và phản ứng thủy phân - octyl hóa - acetyl hóa phân tích trên GC) để giải mã chính xác cấu hình tuyệt đối tại các tâm bất đối (như C-24) và cấu hình D/L của gốc đường.
Đóng góp về mặt thực tiễn
- Thiết lập quy trình chiết tách và loại muối hiệu quả trên cột nhựa Polychrome từ mẫu sinh vật biển có hàm lượng muối khoáng cao, cung cấp quy trình tinh chế các steroid phân cực bằng HPLC pha đảo sử dụng hệ dung môi thân thiện môi trường chứa ammonium acetate.
- Xây dựng cơ sở dữ liệu thực nghiệm về phổ và hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên từ loài sao biển Archaster typicus, góp phần định hướng khai thác nguồn tài nguyên sinh vật biển Việt Nam phục vụ nghiên cứu phát triển dược phẩm.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế: Mẫu nghiên cứu chỉ được thu thập tại một vùng địa lý duy nhất (vùng biển tỉnh Quảng Ninh) vào một thời điểm (tháng 08/2008), chưa đánh giá được sự biến động về thành phần hóa sinh theo mùa và theo các vùng phân bố khác nhau dọc bờ biển Việt Nam. Khối lượng phân lập của một số hợp chất tinh khiết còn ở mức thấp (từ 1,4 mg đến vài miligram), gây hạn chế cho việc thử nghiệm mở rộng nhiều mô hình hoạt tính sinh học in vivo quy mô lớn.
- Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng phạm vi thu thập mẫu Archaster typicus ở các vùng biển miền Trung và miền Nam; tối ưu hóa quy trình phân lập lượng lớn các hợp chất chủ đạo; thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử của hoạt tính gây độc tế bào và khả năng biệt hóa tế bào thần kinh, tiến tới thử nghiệm tiền lâm sàng trên mô hình động vật.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu tham khảo hữu ích cho các đối tượng sau:
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên: Thuộc các chuyên ngành Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược, Hóa hữu cơ, Dược học và Sinh học biển. Phần đáng tham khảo nhất là Chương II và Chương III về phương pháp giải mã cấu trúc lập thể steroid bằng phổ NMR 2D, phương pháp Mosher và quy trình phân tích cấu hình đường bằng GC.
- Giảng viên và các nhà nghiên cứu: Làm tài liệu giảng dạy chuyên đề hóa học sinh vật biển, kỹ thuật sắc ký phân tách hợp chất phân cực cao và phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro (đo hoạt tính luciferase qua reporter gene và thử nghiệm trên giao tử cầu gai).
- Các cơ quan nghiên cứu dược liệu biển và quản lý tài nguyên: Tham khảo dữ liệu về tiềm năng hóa sinh và dược học của động vật Da gai tại vùng biển Việt Nam để xây dựng định hướng bảo tồn và khai thác bền vững tài nguyên sinh vật biển.
Câu hỏi thường gặp
1. Mẫu sao biển Archaster typicus phục vụ nghiên cứu được thu thập ở đâu và ai là người giám định khoa học?
Mẫu sao biển Archaster typicus (khối lượng 7 kg mẫu tươi) được thu thập tại vùng biển tỉnh Quảng Ninh, Việt Nam vào tháng 08/2008. Mẫu được PGS. TS. Đỗ Công Thung thuộc Viện Tài nguyên và Môi trường biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên loài khoa học và lưu giữ tiêu bản.
2. Các nhóm cấu trúc steroid phân cực chính được tìm thấy từ loài sao biển này là gì?
Luận án đã phân lập và xác định các hợp chất thuộc 3 phân nhóm steroid phân cực:
- Nhóm polyhydroxy steroid: Các hợp chất AT4 ((24R)-27-nor-5$\alpha$-cholestane-3$\beta$,6$\alpha$,8,14,15$\alpha$,24-hexaol), A1 ((24R)-27-nor-5$\alpha$-cholestane-3$\beta$,4$\beta$,6$\alpha$,8,14,15$\alpha$,24-heptaol), A3 ((24R)-5$\alpha$-cholestane-3$\beta$,4$\beta$,5,6$\alpha$,8,14,15$\alpha$,24,26-nonaol).
- Nhóm steroid sulfate: Các hợp chất muối natri A4 ((24S)- & (24R)-5$\alpha$-cholest-25(27)-ene-3$\beta$,6$\alpha$,8,14,15$\alpha$,24,26-heptaol 15-O-sulfate) và A5 ((23E)-27-Nor-25-oxo-5$\alpha$-cholest-23-ene-3$\beta$,6$\alpha$,8,14,15$\alpha$-pentaol 15-O-sulfate).
- Nhóm glycoside polyhydroxy steroid: Hợp chất A2 (chứa gốc D-glucose) và các hợp chất Archasteroside A (A14), Archasteroside B (A15), Archasteroside C (A16).
3. Quy trình loại bỏ muối vô cơ biển khỏi dịch chiết ethanol được thực hiện như thế nào?
Dịch cô ethanol (120 g từ 7 kg mẫu tươi) được hòa tan trong 1 lít nước cất rồi nạp lên cột sắc ký Polychrome (đường kính 70 mm, chiều dài 260 mm). Rửa giải muối bằng 11 lít nước cất, kiểm tra dịch rửa bằng dung dịch $AgNO_3$ 1N cho đến khi không còn xuất hiện kết tủa trắng $AgCl$. Sau đó, sử dụng 7 lít ethanol để rửa giải toàn bộ các phân đoạn hợp chất hữu cơ phục vụ cho các bước sắc ký HPLC tiếp theo.
4. Luận án đã sử dụng phương pháp hóa học nào để xác định cấu hình tuyệt đối của gốc đường và các tâm bất đối?
Để xác định cấu hình tuyệt đối tại C-24 của khung aglycon (như hợp chất A1), luận án sử dụng phương pháp Mosher bằng cách điều chế các dẫn xuất $(S)$-MTPA este và $(R)$-MTPA este với $(R)$-/$(S)$-MTPA clorua và so sánh độ dịch chuyển hóa học trên phổ $^1\text{H}$-NMR. Để xác định cấu hình tuyệt đối của gốc đường trong hợp chất glycoside A2, mẫu được thủy phân bằng TFA 2M ở 100°C trong 2 giờ, cho phản ứng với $(-)$-2-octanol và TFA đậm đặc ở 130°C trong 6 giờ, sau đó acetyl hóa bằng pyridine/acetic anhydride (1:1) và phân tích trên GC; thời gian lưu thu được ($t_R = 28,27; 28,86; 29,0; 29,38$ phút) trùng khớp hoàn toàn với mẫu đường chuẩn D-glucose.
5. Những mô hình hoạt tính sinh học nào đã được thiết lập để đánh giá các chất phân lập?
Luận án áp dụng 3 hệ thống thử nghiệm sinh học in vitro:
- Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp so màu MTS trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung người (HeLa) và ung thư biểu mô chuột (JB6 Cl 41).
- Đánh giá hoạt tính phiên mã của các yếu tố nhân NF-$\kappa$B và p53 trên dòng tế bào JB6 Cl 41 bằng kỹ thuật biến nạp gen phóng xạ luciferase reporter gene.
- Đánh giá hoạt tính ức chế sự thụ tinh và ức chế sự phân chia phát triển phôi 8 tế bào trên mô hình giao tử cầu gai Strongylocentrotus intermedius.
Kết luận
Luận án tiến sĩ đã thực hiện nghiên cứu chuyên sâu và có hệ thống về thành phần hóa học cùng hoạt tính sinh học của nhóm steroid phân cực từ loài sao biển Archaster typicus thu thập tại vùng biển Quảng Ninh, Việt Nam. Thông qua việc kết hợp các kỹ thuật sắc ký hiện đại (Polychrome, RP-HPLC) và các phương pháp phổ tiên tiến (HR-ESI-MS, 1D/2D-NMR, phương pháp Mosher, dẫn xuất hóa GC), tác giả đã phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc hóa học của nhiều hợp chất steroid phân cực mới và các dẫn xuất glycoside, sulfate đặc trưng. Kết quả thử nghiệm sinh học trên các mô hình tế bào ung thư, hoạt tính phiên mã NF-$\kappa$B/p53 và phôi sinh học cầu gai cung cấp những dẫn liệu khoa học giá trị, đóng góp thiết thực vào kho tàng nghiên cứu hóa sinh biển và định hướng phát triển dược phẩm từ tài nguyên thiên nhiên Việt Nam.
