Nghiên cứu sơ bộ qui trình thiết lập kỹ thuật real time pcr để phát hiện và định lượng bệnh đốm trắng wssv trên tôm

Nghiên cứu kỹ thuật Real-Time PCR phát hiện và định lượng bệnh đốm trắng WSSV trên tôm. Quy trình chẩn đoán nhanh, chính xác, hỗ trợ phòng ngừa dịch bệnh hiệu quả.

• Tác giả: Võ Thị Thanh Thảo
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Hùng Vân
• Trường học: Trường Đại Học Mở – Bán Công Tp.Hcm
• Chuyên ngành: Sinh học phân tử
• Đề tài: Nghiên cứu sơ bộ qui trình thiết lập kỹ thuật Real Time PCR để phát hiện và định lượng bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm
• Loại tài liệu: Luận văn tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2004
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH TÔM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
• 1.2. SƠ LƯỢC VỀ TÔM SUÙ
• 1.3. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ SINH THÁI CỦA TÔM SUÙ
• 1.4. VỊ TRÍ PHÂN LOẠI HỌC CỦA TÔM SUÙ TRONG TỰ NHIÊN
• 1.5. SỰ TĂNG TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA TÔM SUÙ
• 1.6. TẬP TÍNH ĂN VÀ LOẠI THỨC ĂN
• 1.7. VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WHITE SPOT SYNDROME VIRUS)
• 1.7.1. White spot syndrome virus (WSSV)
• 1.7.2. Dấu hiệu bệnh lý
• 1.7.3. Cơ chế xâm nhập và con đường truyền lây
• 1.7.3.1. Lây theo chiều ngang (Horizontal transmission)
• 1.7.3.2. Lây theo chiều dọc (Varitical transmission)
• 1.7.4. Cơ chế xâm nhập
• 1.7.5. Sức đề kháng
• 1.7.6. Phương pháp chẩn đoán
• 1.8. PHƯƠNG PHÁP PCR
• 1.8.1. Qui trình phản ứng PCR
• 1.8.2. Mồi và nhiệt độ lai
• 1.8.3. Đệm và MgCl2
• 1.9. CÁC KỸ THUẬT CẢI TIẾN CỦA PCR
• 1.9.1. Cải tiến thứ nhất: Kỹ thuật Non Stop Nested PCR
• 1.9.2. Cải tiến thứ hai: Kỹ thuật Real time PCR
• 1.9.3. Phương pháp
• 1.9.4. Dùng probes tóm bắt huỳnh quang
• 1.9.5. Dùng những tác nhân để ràng buộc DNA
• 1.9.6. Qui trình
• 1.9.7. Threshold cycle (Ct) chu kỳ ngưỡng
• 2. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỊA ĐIỂM LẤY MẪU
• 2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 2.3. Tách chiết DNA
• 2.4. Hóa chất dùng cho phản ứng Real time PCR
• 2.5. Bộ kit PCR non Stop Nested PCR
• 2.6. Mồi dùng cho phản ứng Real time PCR
• 2.7. Hóa chất dùng cho điện di
• 2.8. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.8.1. Số lượng mẫu
• 2.8.2. Yêu cầu đối với mẫu phân tích
• 2.8.3. Phương pháp tiến hành
• 2.8.3.1. Ly trích thoa
• 2.8.3.2. Ly trích bằng Intagene matrix
• 2.8.3.3. Phản ứng khuếch đại PCR. Real time PCR. Non Stop Nested PCR
• 2.8.3.4. Tiến hành điện di
• 2.8.3.5. Chuẩn bò gel Agarose 1,5%
• 2.8.3.6. Đọc kết quả
• 3. PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. QUI TRÌNH LY TRÍCH DNA CỦA WSSV - SO SÁNH HAI QUI TRÌNH LY TRÍCH THOA VÀ INTAGENE MATRIX
• 3.2. THỬ NGHIỆM REAL TIME PCR VỚI TAQMAN PROBE VÀ SYBR GREEN I
• 3.2.1. Thử nghiệm Realtime PCR với SYBR GREEN I
• 3.2.2. Thử nghiệm Realtime PCR với TaqMan Probe
• 3.3. SO SÁNH ĐỘ NHẠY GIỮA REAL TIME PCR VỚI KỸ THUẬT NON STOP NESTED PCR PHÁT HIỆN WSSV TRÊN TÔM
• 4. PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• PHỤ LỤC
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Real Time PCR Phát Hiện WSSV

Nghề nuôi tôm đang phát triển mạnh mẽ, đặc biệt ở Châu Á. Tuy nhiên, dịch bệnh là một thách thức lớn, gây thiệt hại nặng nề cho người nuôi. Trong đó, bệnh đốm trắng do WSSV (White Spot Syndrome Virus) gây ra là nguy hiểm nhất. Việc chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh này là vô cùng quan trọng để phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống có nhiều hạn chế, do đó, kỹ thuật PCR và đặc biệt là Real-Time PCR đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi. Theo VASEP năm 2003, ngành tôm đóng góp tỷ trọng lớn trong kim ngạch xuất khẩu, vì vậy việc bảo vệ ngành này là rất quan trọng để duy trì tăng trưởng kinh tế. "Dịch bệnh do nhiều nguyên nhân khác nhau, có thể do virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng,…", việc xác định chính xác tác nhân gây bệnh là bước đầu tiên để có biện pháp can thiệp hiệu quả.

1.1. Tình Hình Dịch Bệnh Đốm Trắng WSSV Trên Tôm

Dịch bệnh WSSV đã gây ra thiệt hại lớn cho ngành nuôi tôm trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các nước Châu Á. Mật độ nuôi quá dày, vệ sinh kém và môi trường nước ô nhiễm là những yếu tố làm tăng nguy cơ bùng phát dịch bệnh. Virus gây bệnh đốm trắng có khả năng lây lan nhanh chóng giữa các ao nuôi, gây chết hàng loạt tôm. “Beänh do virus WSSV gaây hoäi chöùng ñoám traéng coù möùc thieät haïi cao gaáp nhieàu laàn caùc beänh khaùc vaø ñang lan traøn khaép nôi…”. Do đó việc phát hiện và phòng ngừa sớm là vô cùng cần thiết.

1.2. Tổng Quan Về Phương Pháp Real Time PCR

Real-Time PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến, cho phép phát hiện và định lượng virus một cách nhanh chóng và chính xác. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc khuếch đại DNA và theo dõi quá trình khuếch đại theo thời gian thực. Kỹ thuật Real-Time PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm, trước khi có các triệu chứng lâm sàng rõ ràng. Realtime PCR cho phép phát hiện và có thể định lượng được mức độ nhiễm WSSV trên các mẫu thử.

II. Thách Thức Trong Phát Hiện WSSV Bằng PCR Truyền Thống

Mặc dù PCR truyền thống là một công cụ hữu ích, nhưng nó có những hạn chế nhất định trong việc phát hiện WSSV. Thứ nhất, phương pháp này thường yêu cầu các bước xử lý sau PCR, như điện di, để xác nhận kết quả, làm tăng thời gian và nguy cơ nhiễm chéo. Thứ hai, PCR truyền thống không cho phép định lượng virus, điều này rất quan trọng để đánh giá mức độ nhiễm bệnh và theo dõi hiệu quả điều trị. Hơn nữa, độ nhạy của PCR truyền thống có thể không đủ để phát hiện mầm bệnh WSSV ở nồng độ thấp. "PCR xaùc ñònh WSSV khoâng chæ coù theå thöïc hieän treân caùc maãu thöû laø toâm maø coøn coù theå thöïc hieän treân caùc maãu thöû laø moâi tröôøng nuoâi toâm cuõng nhö caùc ñoäng vaät giaùp xaùc hoang daõ coù trong moâi tröôøng".

2.1. Hạn Chế Về Độ Nhạy Của Phương Pháp PCR

Độ nhạy của PCR truyền thống có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm chất lượng mẫu, sự hiện diện của chất ức chế và thiết kế mồi. Để khắc phục những hạn chế này, các kỹ thuật PCR cải tiến, như Nested PCR và Real-Time PCR, đã được phát triển. Các phương pháp này có độ nhạy cao hơn và cho phép phát hiện WSSV ở nồng độ thấp.

2.2. Khó Khăn Trong Định Lượng Virus WSSV Bằng PCR

Một trong những hạn chế lớn nhất của PCR truyền thống là không thể định lượng WSSV. Việc định lượng virus rất quan trọng để đánh giá mức độ nhiễm bệnh và theo dõi hiệu quả điều trị. Real-Time PCR giải quyết vấn đề này bằng cách theo dõi quá trình khuếch đại DNA theo thời gian thực, cho phép xác định lượng virus ban đầu trong mẫu. Từ đó hạn chế được các thiệt hại cho người nuôi tôm và môi trường.

III. Phương Pháp Real Time PCR Giải Pháp Phát Hiện WSSV

Real-Time PCR là một phương pháp chẩn đoán mạnh mẽ, khắc phục những hạn chế của PCR truyền thống trong việc phát hiện và định lượng WSSV. Kỹ thuật này sử dụng các chất phát huỳnh quang để theo dõi quá trình khuếch đại DNA theo thời gian thực. Lượng huỳnh quang phát ra tỷ lệ thuận với lượng DNA được khuếch đại, cho phép xác định lượng virus ban đầu trong mẫu. "Sau khi coù ñöôïc kyõ thuaät PCR phaùt hieän beänh ñoám traéng WSSV treân toâm, ngöôøi ta ñaõ ñi theâm moät böôùc nöõa laø nghieân cöùu kyõ thuaät Realtime PCR cho pheùp phaùt hieän vaø coù theå ñònh löôïng ñöôïc möùc ñoä nhieãm WSSV treân caùc maãu thöû."

3.1. Ưu Điểm Vượt Trội Của Kỹ Thuật Real Time PCR

Real-Time PCR có nhiều ưu điểm so với các phương pháp chẩn đoán khác. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả nhanh chóng, giảm thiểu nguy cơ nhiễm chéo và cho phép định lượng virus. Ứng dụng Real-Time PCR trong nuôi tôm giúp phát hiện bệnh sớm, từ đó có biện pháp can thiệp kịp thời, giảm thiểu thiệt hại kinh tế.

3.2. Các Loại Thuốc Thử Huỳnh Quang Trong Real Time PCR

Có hai loại thuốc thử huỳnh quang chính được sử dụng trong Real-Time PCR: thuốc nhuộm liên kết DNA (ví dụ: SYBR Green I) và đầu dò huỳnh quang (ví dụ: TaqMan probes). Thuốc nhuộm liên kết DNA liên kết với bất kỳ DNA sợi đôi nào, trong khi đầu dò huỳnh quang chỉ liên kết với trình tự DNA đích. Việc lựa chọn loại thuốc thử phù hợp phụ thuộc vào ứng dụng cụ thể và độ đặc hiệu mong muốn. Dùng probes túm bắt huỳnh quang. Dùng những tác nhân để ràng buộc DNA.

3.3. Quy Trình Thực Hiện Real Time PCR Phát Hiện WSSV

Quy trình Real-Time PCR bao gồm các bước: tách chiết DNA từ mẫu tôm, thiết kế và chuẩn bị mồi đặc hiệu cho WSSV, thiết lập phản ứng Real-Time PCR với các thành phần cần thiết, chạy chương trình PCR trên máy Real-Time PCR, phân tích kết quả để xác định sự hiện diện và định lượng của virus WSSV. Quy trình này cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo kết quả chính xác và tin cậy.

IV. Tối Ưu Quy Trình Ly Trích DNA Cho Real Time PCR WSSV

Hiệu quả của Real-Time PCR phụ thuộc lớn vào chất lượng DNA được sử dụng. Do đó, việc tối ưu quy trình ly trích DNA là rất quan trọng. Có nhiều phương pháp ly trích DNA khác nhau, mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng. Nghiên cứu cần so sánh hiệu quả của các phương pháp ly trích khác nhau, như ly trích thô và ly trích tinh bằng bộ InstageneTM Matrix, để lựa chọn phương pháp phù hợp nhất. Thieát keá qui trình ly trích DNA cuûa virus WSSV cho kyõ thuaät REALTIME PCR. So saùnh hieäu quaû giöõa hai qui trình ly trích: ly trích thoâ DNA vaø ly trích tinh baèng boä InstageneTM Matrix trong Realtime PCR.

4.1. So Sánh Ly Trích Thô Và Ly Trích Tinh DNA

Ly trích thô là một phương pháp đơn giản và nhanh chóng, nhưng DNA thu được có thể chứa nhiều tạp chất. Ly trích tinh sử dụng các bộ kit chuyên dụng để loại bỏ tạp chất, cho DNA có độ tinh khiết cao hơn. Việc lựa chọn phương pháp ly trích phụ thuộc vào yêu cầu về độ tinh khiết và thời gian thực hiện. Điều này giúp cho quá trình phân tích được chính xác hơn.

4.2. Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Hiệu Quả Ly Trích DNA

Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hiệu quả ly trích DNA, bao gồm loại mẫu, phương pháp bảo quản mẫu, và quy trình ly trích. Việc kiểm soát các yếu tố này là rất quan trọng để đảm bảo DNA thu được có chất lượng tốt và phù hợp cho Real-Time PCR. Cần có các yếu tố để bảo quản mẫu trước khi đem đi phân tích.

V. Ứng Dụng Real Time PCR Trong Quản Lý Bệnh Đốm Trắng Tôm

Real-Time PCR là một công cụ mạnh mẽ để quản lý bệnh đốm trắng trên tôm. Phương pháp này có thể được sử dụng để sàng lọc tôm giống trước khi thả, giám sát sự lây lan của bệnh trong ao nuôi, và đánh giá hiệu quả của các biện pháp phòng ngừa và điều trị. Kiểm soát WSSV bằng PCR giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người nuôi tôm. Ứng dụng Real-Time PCR trong quản lý dịch bệnh WSSV tại các trang trại nuôi tôm công nghiệp.

5.1. Sàng Lọc Tôm Giống Bằng Real Time PCR Để Phòng Bệnh

Việc sàng lọc tôm giống bằng Real-Time PCR giúp loại bỏ những con tôm mang mầm bệnh WSSV, ngăn ngừa sự lây lan của bệnh trong ao nuôi. Điều này đặc biệt quan trọng đối với các trang trại nuôi tôm công nghiệp, nơi mật độ nuôi cao và nguy cơ lây lan bệnh lớn.

5.2. Giám Sát Dịch Bệnh Trong Ao Nuôi Bằng Real Time PCR

Real-Time PCR có thể được sử dụng để giám sát sự lây lan của bệnh đốm trắng trong ao nuôi. Bằng cách xét nghiệm mẫu nước và mẫu tôm định kỳ, người nuôi có thể phát hiện bệnh sớm và có biện pháp can thiệp kịp thời. Điều này giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra.

VI. Kết Luận Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Real Time PCR WSSV

Real-Time PCR là một kỹ thuật chẩn đoán hiệu quả để phát hiện và định lượng WSSV trên tôm. Phương pháp này có nhiều ưu điểm so với các phương pháp chẩn đoán khác và có thể được ứng dụng rộng rãi trong quản lý bệnh đốm trắng. Nghiên cứu cần tiếp tục tập trung vào việc tối ưu quy trình Real-Time PCR, phát triển các bộ kit xét nghiệm nhanh và rẻ tiền, và đào tạo nguồn nhân lực để ứng dụng kỹ thuật này trong thực tế. Sau khi giaûi quyeát ñöôïc caùc muïc tieâu treân, xaây döïng ñöôïc moät boä thöû nghieäm hoaøn chænh phaùt hieän vaø ñònh löôïng WSSV.

6.1. Tiềm Năng Phát Triển Của Kỹ Thuật Real Time PCR

Real-Time PCR có tiềm năng phát triển rất lớn trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh trên tôm. Các nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc phát triển các kỹ thuật Real-Time PCR đa mồi, cho phép phát hiện nhiều loại virus gây bệnh cùng lúc. Phát triển các kỹ thuật Real-Time PCR mới để phát hiện WSSV.

6.2. Đề Xuất Ứng Dụng Thực Tiễn Cho Ngành Nuôi Tôm

Để ứng dụng hiệu quả Real-Time PCR trong ngành nuôi tôm, cần có sự phối hợp giữa các nhà khoa học, các cơ quan quản lý và người nuôi tôm. Cần xây dựng các phòng thí nghiệm PCR hiện đại, đào tạo kỹ thuật viên có trình độ cao và cung cấp dịch vụ xét nghiệm với giá cả hợp lý. Việc tuyên truyền và nâng cao nhận thức của người nuôi tôm về tầm quan trọng của việc chẩn đoán bệnh sớm cũng rất cần thiết.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BOÄ GIAÙO DUÏC & ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC MÔÛ – BAÙN COÂNG TP.HCM KHOA COÂNG NGHEÄ SINH HOÏC *** Ñeà taøi: NGHIEÂN CÖÙU SÔ BOÄ QUI TRÌNH THIEÁT LAÄP KYÕ THUAÄT REAL TIME PCR ÑEÅ PHAÙT HIEÄN VAØ ÑÒNH LÖÔÏNG BEÄNH ÑOÁM TRAÉNG (WSSV)TREÂN TOÂM LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP CÖÛ NHAÂN KHOA HOÏC CHUYEÂN NGHAØNH: SINH HOÏC PHAÂN TÖÛ GIAÛNG VIEÂN HÖÔÙNG DAÃN:TS. PHAÏM HUØNG VAÂN BS. NGUYEÃN PHAÏM THANH NHAÂN SINH VIEÂN THÖÏC HIEÄN :VOÕ THÒ THANH THAÛO KHOÙA HOÏC :2000 – 2004 Tp.Hoà Chí Minh 11/2004 LÔØI CAÛM ÔN °°° Em xin chaân thaønh caûm ôn tröôøng Ñaïi Hoïc Môû Baùn Coâng Tp.HCM vaø caùc thaày coâ trong khoa CNSH ñaõ taïo moâi tröôøng hoïc taäp toát vaø ñaøo taïo chuùng em tröôûng thaønh veà moïi maët. Em xin chaân thaønh caûm ôn TS.BS Phaïm Huøng Vaân ñaõ taän tình giaûng daïy, ñònh höôùng em thöïc hieän ñeà taøi naøy.

Ñoàng thôøi em cuõng caûm ôn söï giuùp ñôõ cuûa BS. Nguyeãn Phaïm Thanh Nhaân, CN. Phaïm Thanh Thuøy Trang vaø caùc anh chò trong phoøng SHPT noùi rieâng, caùc anh chò trong coâng ty Nam Khoa noùi chung ñaõ giuùp ñôõ em veà maët taøi lieäu, cô sôû vaät chaát cuõng nhö tinh thaàn ñeå thöïc hieän ñeà taøi thuaän lôïi. Caùm ôn taát caû baïn beø ñaõ cho toâi nhieàu lôøi khuyeân boå ích cuõng nhö ñoäng vieân, hoã trôï toâi trong suoát thôøi gian qua.

Voõ Thò Thanh Thaûo CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT DUØNG TRONG LUAÄN VAÊN bp : base pair Ct : Threshold Cycle DNA : Deoxyribonucleic acid dATP : 2’ – deoxyadenosine – 5’ – triphosphate dCTP : 2’ – deoxycitydine – 5’ – triphosphate dTTP : 2’ – deoxyithymine – 5’ – triphosphate dGTP : 2’ – deoxyguanosine – 5’ – triphosphate dNTP : 2’ – deoxynucleoside – 5’ – triphosphate dsDNA : Double stranded DNA EDTA : Ethylen diamine tetraacetic acid FAO : Food and Agriculture Organization GAV : Gill Associated Virus HHNBV : Hypodermal and henatopoietic necrosis baculovirus HPV : Hepatopancreatic parvovirus MBV : Monodon Baculovirus PCR : Polymerase chain reaction PL : Postlarvae – Haäu aáu truøng toâm Realtime – PCR : Real time Polymerase chain reaction SDS : Sodium dodecyl sulfate Taq : Thermus aquaticus Tm : Nhieät ñoä noùng chaûy cuûa DNA sôïi ñoâi TBE : Tris Boric – EDTA TE : Tris - EDTA SEMBV : Systemic hec toderma and mesodemal baculovirus VASEP : VietNam Association of Seafood Exporters and Producers WSSV : White Spot Syndrome Virus WSBV : White spot virus YHV : Yellow head virus M ỤC L ỤC *** LỜI CAÛM ÔN CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT DUØNG TRONG LUAÄN VAÊN LÔØI MÔÛ ÑAÀU. 1 Phần I : TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU TÌNH HÌNH DÒCH BEÄNH TOÂM TREÂN THEÁ GIÔÙI VAØ VIEÄT NAM. SÔ LÖÔÏC VEÀ TOÂM SUÙ. Ñaëc ñieåm sinh hoïc vaø sinh thaùi cuûa toâm suù.

Vò trí phaân loaïi hoïc cuûa toâm suù trong töï nhieân. Söï taêng tröôûng vaø phaùt trieån cuûa toâm suù. Caùc giai ñoaïn phaùt trieån cuûa toâm suù töø taêng tröôûng ñeán tröôûng thaønh. Taäp tính aên vaø loaïi thöùc aên.

VIRUS GAÂY HOÄI CHÖÙNG ÑOÁM TRAÉNG (WHITE SPOT SYNDROME VIRUS). White spot syndrome virus (wssv). Daáu hieäu beänh lyù. Cô cheá xaâm nhaäp vaø con ñöôøng truyeàn laây.

Quùa trình truyeàn laây .1 Laây theo chieàu ngang (Horizontal transmission) .1 Laây theo chieàu doïc (Varitical transmission). Cô cheá xaâm nhaäp. Söùc ñeà khaùng. Phöông phaùp chaån ñoaùn.

PHÖÔNG PHAÙP PCR. Qui trình phaûn öùng PCR. Moài vaø nhieät ñoä lai. Ñeäm vaø MgCl2.

CAÙC KYÕ THUAÄT CAÛI TIEÁN CUÛA PCR. Caûi tieán thöù nhaát: Kyõ thuaät Non Stop Nested PCR. Caûi tieán thöù hai: Kyõ thuaät Real time PCR. Phöông phaùp.

Duøng probes toùm baét huyønh quang. Duøng nhöõng taùc nhaân ñeå raøng buoäc DNA. Qui trình. Threshold cycle (ct) chu kyø ngöôõng.

25 Phaàn 2: VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 1. ÑÒA ÑIEÅM LAÁY MAÃU. ÑÒA ÑIEÅM NGHIEÂN CÖÙU. Taùch chieát DNA.

Hoùa chaát duøng cho phaûn öùng Real time PCR. Boä kit PCR non Stop Nested PCR. Moài duøng cho phaûn öùng Real time PCR. Hoùa chaát duøng cho ñieän di.

PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU. Soá löôïng maãu. Yeâu caàu ñoái vôùi maãu phaân tích. Phöông phaùp tieán haønh.

Ly trích thoâ. Ly trích baèng Intagene matrix. Phaûn öùng khueách ñaïi PCR. Real time PCR.

Non Stop Nested PCR. Tieán haønh ñieän di. Chuaån bò gel Agarose 1,5%. Ñoïc keát quaû.

36 Phaàn 3: KEÁT QUÛA VAØ BAØN LUAÄN 1. QUI TRÌNH LY TRÍCH DNA CUÛA WSSV- SO SAÙNH HAI QUI TRÌNH LY TRÍCH THOÂ VAØ INTAGENE MATRIX. THÖÛ NGHIEÄM REAL TIME PCR VÔÙI TAQMAN PROBE VAØ SYBR GREEN I .1 Thöû nghieäm Realtime PCR vôùi SYBR GREEN I.2 Thöû nghieäm Realtime PCR vôùi TaqMan Probe. SO SAÙNH ÑOÂ NHAÏY GIÖÕA REAL TIME PCR VÔÙI KYÕ THUAÄT NON STOP NESTED PCR PHAÙT HIEÄN WSSV TREÂN TOÂM.

54 Phaàn 4: KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ 1. 61 “Thieát laäp kyõ thuaät Realtime PCR phaùt hieän vaø ñònh löôïng virus gaây beänh ñoám traéng (WSSV ) ôû toâm” GVHD:TS. Phaïm Huøng Vaân, BS.Nguyeãn Phaïm Thanh Nhaân LÔØI MÔÛ ÑAÀU Theo hieäp hoäi cheá bieán vaø xuaát khaåu thuûy saûn Vieät Nam (VASEP) naêm 2003, nöôùc ta saûn xuaát khoaûng 300.000 taán toâm, trong ñoù toâm nuoâi ñaït 244. Ñaây cuõng laø naêm maø kim nghaïch xuaát khaåu toâm vöôït möùc 1 tyû USD, chieám 49% toång kim nghaïch xuaát khaåu thuûy saûn.

Ñieàu ñoù cho thaáy vò trí quan troïng cuûa toâm trong cô caáu xuaát khaåu. Beân caïnh lôïi nhuaän lôùn, ruûi ro coøn lôùn hôn, ngoaøi vuï kieän toâm vöøa qua, ngöôøi nuoâi toâm coøn bò ruûi ro khi toâm bò dòch beänh laøm toâm cheát haøng loaït vaãn thöôøng xuyeân xaûy ra.[ 21] Dòch beänh do nhieàu nguyeân nhaân khaùc nhau, coù theå do virus, vi khuaån, naám, kyù sinh truøng,…. Coùù nhieàu loaïi virus gaây beänh treân toâm suù Penaeus monodon: WSSV, MBV, HPV, YHV, GAV… ñaây laø caùc taùc nhaân gaây beänh nguy hieåm, haøng naêm, nhöõng virus naøy gaây thieät haïi nghieâm troïng cho caùc khu vöïc nuoâi toâm [ 15 ]. Ñaëc bieät, beänh do virus WSSV gaây hoäi chöùng ñoám traéng coù möùc thieät haïi cao gaáp nhieàu laàn caùc beänh khaùc vaø ñang lan traøn khaép nôi, thôøi gian töø luùc nhieãm beänh ñeán khi toâm cheát raát ngaén vaø tæ leä laây nhieãm giöõa caùc ao nuoâi trong cuøng khu vöïc raát cao, nhaát laø khi noâng daân chöa coù kinh nghieäm nhieàu veà phoøng choáng laây nhieãm caùc loaïi beänh naøy.

Ngoaøi ra, taùc nhaân gaây beänh laø virus, khoâng coù thuoác ñaëc trò neân phoøng beänh vaãn laø chuû yeáu. Vì vaäy caàn phaûi coù bieän phaùp chaån ñoaùn nhanh, phaùt hieän kòp thôøi caùc trieäu chöùng laâm saøng cuûa beänh cuõng nhö chaån ñoaùn sôùm trong phoøng thí nghieäm trong taát caû caùc giai ñoaïn töø giai ñoaïn thaû toâm ñeán khi thu hoaïch ñeå nhanh choùng phaùt hieän maàm beänh, töø ñoù haïn cheá ñöôïc thieät haïi cho ngöôøi nuoâi toâm vaø cho moâi tröôøng. Chính vì nhöõng lyù do treân, caùc nhaø nghieân cöùu ñaõ ñöa ra nhieàu phöông phaùp phaùt hieän söï coù maët cuûa WSSV trong caùc maãu toâm beänh cuõng nhö maãu moâi tröôøng ñeå nhaèm chaån ñoaùn sôùm söï coù maët cuûa WSSV treân nhöõng maãu thöû naøy. SVTH: Voõ Thò Thanh Thaûo - 30000676 Trang1 “Thieát laäp kyõ thuaät Realtime PCR phaùt hieän vaø ñònh löôïng virus gaây beänh ñoám traéng (WSSV ) ôû toâm” GVHD:TS.

Phaïm Huøng Vaân, BS.Nguyeãn Phaïm Thanh Nhaân Töø phöông phaùp kinh ñieån nhö tìm caùc trieäu chöùng laâm saøng cuûa beänh ñoám traéng treân toâm, ñeán phöông phaùp moâ hoïc phaùt hieän moät soá trieäu chöùng treân maãu moâ caét, phöông phaùp mieãn dòch cuõng ñaõ ñöôïc nghieân cöùu trieån khai vaø gaàn ñaây, vieäc öùng duïng phöông phaùp hieän ñaïi hôn ñoù laø duøng kyõ thuaät PCR (Polymerase Chain Reaction ) ñeå chaån ñoaùn beänh. Ñeå chaån ñoaùn ñöôïc taùc nhaân virus WSSV, phöông phaùp PCR coù theå ñöôïc coi nhö laø moät phöông tieän thích hôïp vaø höõu hieäu vì tröôùc heát ñaây laø taùc nhaân virus neân khoâng theå hay khoù nuoâi caáy trong caùc ñieàu kieän cuûa noâng daân Vieät Nam hay cuûa caùc cô quan kieåm tra dòch beänh treân toâm. PCR xaùc ñònh WSSV khoâng chæ coù theå thöïc hieän treân caùc maãu thöû laø toâm maø coøn coù theå thöïc hieän treân caùc maãu thöû laø moâi tröôøng nuoâi toâm cuõng nhö caùc ñoäng vaät giaùp xaùc hoang daõ coù trong moâi tröôøng, vì vaäy neân coøn ñöôïc duøng nhö laø moät xeùt nghieäm höõu hieäu trong phoøng dòch. Nhö vaäy, phöông phaùp PCR cho keát quaû chaån ñoaùn nhieãm WSSV nhanh, nhaïy, chính xaùc.

Sau khi coù ñöôïc kyõ thuaät PCR phaùt hieän beänh ñoám traéng WSSV treân toâm, ngöôøi ta ñaõ ñi theâm moät böôùc nöõa laø nghieân cöùu kyõ thuaät Realtime PCR cho pheùp phaùt hieän vaø coù theå ñònh löôïng ñöôïc möùc ñoä nhieãm WSSV treân caùc maãu thöû. Ñöôïc söï chaáp thuaän cuûa khoa Coâng ngheä Sinh hoïc tröôøng Ñaïi Hoïc Môû Baùn Coâng Tp.HCM vaø ñöôïc söï ñoàng yù cuûa coâng ty Nam Khoa vôùi söï höôùng daãn cuûa TS.BS Phaïm Huøng Vaân vaø BS. Nguyeãn Phaïm Thanh Nhaân, toâi tieán haønh ñeà taøi: “Thieát laäp kyõ thuaät REALTIME PCR phaùt hieän vaø ñònh löôïng virus gaây beänh ñoám traéng (WSSV) ôû toâm” vôùi nhöõng muïc tieâu: SVTH: Voõ Thò Thanh Thaûo - 30000676 Trang2 “Thieát laäp kyõ thuaät Realtime PCR phaùt hieän vaø ñònh löôïng virus gaây beänh ñoám traéng (WSSV ) ôû toâm” GVHD:TS. Phaïm Huøng Vaân, BS.Nguyeãn Phaïm Thanh Nhaân 1.

Thieát keá qui trình ly trích DNA cuûa virus WSSV cho kyõ thuaät REALTIME PCR. So saùnh hieäu quaû giöõa hai qui trình ly trích: ly trích thoâ DNA vaø ly trích tinh baèng boä InstageneTM Matrix trong Realtime PCR. Thieát keá kyõ thuaät Realtime PCR hoaøn chænh ñeå phaùt hieän vaø ñònh löôïng möùc ñoä nhieãm beänh treân toâm. So saùnh ñoä nhaïy giöõa Realtime PCR vôùi kyõ thuaät Nonstop Nested PCR phaùt hieän WSSV treân toâm.

Sau khi giaûi quyeát ñöôïc caùc muïc tieâu treân, xaây döïng ñöôïc moät boä thöû nghieäm hoaøn chænh phaùt hieän vaø ñònh löôïng WSSV. Coù nghóa laø boä thöû nghieäm phaûi giuùp ñöôïc caùc phoøng thí nghieäm PCR thöïc hieän ñöôïc ñaày ñuû caùc khaâu trong thöû nghieäm, töø taùch chieát nucleic acid ñích, ñeán khueách ñaïi saûn phaåm ñaëc hieäu treân heä thoáng Realtime PCR ñeå cuoái cuøng laø phaùt hieän vaø ñònh löôïng noàng ñoä virus WSSV coù trong caùc maãu thöû. SVTH: Voõ Thò Thanh Thaûo - 30000676 Trang3 “Thieát laäp kyõ thuaät Realtime PCR phaùt hieän vaø ñònh löôïng virus gaây beänh ñoám traéng (WSSV ) ôû toâm” GVHD:TS. Phaïm Huøng Vaân, BS.Nguyeãn Phaïm Thanh Nhaân Phaàn 1: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU SVTH: Voõ Thò Thanh Thaûo - 30000676 Trang4 “Thieát laäp kyõ thuaät Realtime PCR phaùt hieän vaø ñònh löôïng virus gaây beänh ñoám traéng (WSSV ) ôû toâm” GVHD:TS.

Phaïm Huøng Vaân, BS.Nguyeãn Phaïm Thanh Nhaân 1. TÌNH HÌNH DÒCH BEÄNH TOÂM TREÂN THEÁ GIÔÙI VAØVIEÄT NAM Hieän nay ngheà nuoâi toâm ñang phaùt trieån maïnh, phoå bieán laø toâm suù, taäp trung chuû yeáu ôû hai khu vöïc Nam Myõ vaø Chaâu AÙ.