Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ruồi lính đen (Hermetia illucens) là đối tượng côn trùng đang được mở rộng chăn nuôi ở quy mô công nghiệp và nông hộ nhằm phục vụ xử lý chất thải hữu cơ, đồng thời thu nhận các sản phẩm giá trị gia tăng như protein, dầu béo và phân bón hữu cơ. Quá trình thu hoạch ấu trùng và phát triển vòng đời của ruồi lính đen phát sinh khối lượng lớn phụ phẩm vỏ nhộng. Đây là nguồn nguyên liệu sinh học giàu chitin có tiềm năng lớn để chuyển hóa thành chitosan – một polymer sinh học tự nhiên tạo thành từ các đơn phân N-acetyl glucosamine và glucosamine thông qua phản ứng deacetyl hóa. Chitosan được ứng dụng rộng rãi trong y sinh, dược phẩm, nông nghiệp và xử lý môi trường nhờ các đặc tính tương thích sinh học, tự phân hủy, không độc hại và có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm tự nhiên.

Việc thu nhỏ kích thước chitosan về thang đo nanomet (tạo hạt nanochitosan/viên bao nano) là giải pháp kỹ thuật nhằm gia tăng diện tích bề mặt tiếp xúc, cải thiện độ bám dính tế bào và mở rộng hiệu quả mang/bao bọc các hoạt chất sinh học. Phương pháp tạo gel ion tĩnh điện sử dụng sodium tripolyphosphate (TPP) được đánh giá là kỹ thuật tối ưu nhờ điều kiện phản ứng êm dịu, không sử dụng hóa chất liên kết ngang độc hại. Tuy nhiên, kích thước và độ phân tán của hạt nanochitosan phụ thuộc đồng thời vào nhiều thông số công nghệ như nồng độ polyme, nồng độ tác nhân liên kết, pH và lực khuấy cơ học. Việc ứng dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology – RSM) nhằm mô hình hóa và xác lập vùng thông số tối ưu cho quy trình tổng hợp hạt nano từ nguồn chitosan ruồi lính đen là yêu cầu thực tiễn quan trọng.

Mục tiêu tổng quát của đề tài là xác định điều kiện tối ưu để chế tạo hạt nanochitosan từ nguồn chitosan chiết xuất từ vỏ nhộng ruồi lính đen, đồng thời đánh giá các đặc tính hóa lý và hoạt tính kháng khuẩn của hạt nano thu được.

Để đạt được mục tiêu trên, khóa luận thực hiện 3 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Khảo sát điều kiện tối ưu hóa tạo hạt nanochitosan bằng phương pháp tạo gel ion kết hợp mô hình bề mặt đáp ứng.
  2. Xác định hình thái hạt nano bằng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FE-SEM) và độ phân bố kích thước hạt bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS).
  3. Thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của hạt nanochitosan đối với vi khuẩn thử nghiệm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Vỏ nhộng ruồi lính đen thu nhận từ khu thực nghiệm Black Soldier Fly Project (RIBE - CJ KOREA); chủng vi khuẩn thử nghiệm Streptococcus agalactiae cung cấp bởi phòng thí nghiệm Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
  • Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 3/2023 đến tháng 11/2023 tại phòng Độc chất học Môi trường (RIBE 106) và phòng Phân tích đất và phân bón (RIBE 104), Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu khoa học cấp cơ sở mã số CS - CB22 - Vien CNSH- 02.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên cơ sở lý thuyết về cấu trúc polyme polysaccharide mạch thẳng $\beta(1 \rightarrow 4)$ của chitin và dẫn xuất chitosan thu được sau phản ứng loại bỏ nhóm acetyl (deacetyl hóa). Chitosan có pKa xấp xỉ 6,5, tan tốt trong môi trường acid hữu cơ loãng (như acid acetic) tạo dung dịch polycation nhờ sự proton hóa các nhóm amino ($-\text{NH}_3^+$). Nguyên lý tạo gel ion dựa trên tương tác tĩnh điện giữa các nhóm amino tích điện dương của chitosan với các penta-anion polyphosphate mang điện tích âm ($\text{P}3\text{O}{10}^{5-}$ / $\text{H}_3\text{P}3\text{O}{10}^{2-}$) giải phóng từ muối sodium tripolyphosphate ($\text{Na}_5\text{P}3\text{O}{10}$), tạo nên mạng lưới liên kết ngang khép kín dạng hạt nano hình cầu.

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm được xây dựng theo mô hình bề mặt đáp ứng Box-Behnken Design (BBD) với 4 yếu tố độc lập ở 3 mức mã hóa ($-1, 0, +1$). Mô hình hồi quy đa thức bậc hai được áp dụng để mô tả mối quan hệ giữa hàm mục tiêu kích thước hạt ($Y$) và các biến thực nghiệm theo công thức:

$$Y = \beta_0 + \sum_{i=1}^k \beta_i X_i + \sum_{i=1}^k \beta_{ii} X_i^2 + \sum_{i<j} \beta_{ij} X_i X_j$$

Các phương pháp thực nghiệm và kỹ thuật phân tích sử dụng trong khóa luận gồm:

  • Phương pháp xử lý hóa học đa bước chiết xuất chitosan: khử protein bằng dung dịch $\text{NaOH}$ 5%, khử khoáng bằng dung dịch $\text{HCl}$ 4%, khử màu bằng $\text{KMnO}_4$ 1% và acid oxalic 4%, khử acetyl bằng dung dịch $\text{NaOH}$ 70% ở nhiệt độ cao.
  • Phương pháp phân tích chỉ tiêu hóa lý của chitosan: xác định hàm lượng tro tổng số; định lượng protein tổng bằng phương pháp hòa tan kiềm và chuẩn độ Kjeldahl; đo độ deacetyl (DD%) bằng phương pháp chuẩn độ acid - base theo quy trình Domard & Rinaudo (1983); đo độ nhớt bằng nhớt kế và tính khối lượng phân tử trung bình.
  • Phương pháp tạo gel ion: hòa tan chitosan trong dung dịch acid acetic 2,0% (v/v), nhỏ giọt dung dịch TPP vào dung dịch chitosan dưới điều kiện khuấy từ liên tục ở nhiệt độ phòng.
  • Phương pháp phân tích cấu trúc và hình thái: chụp ảnh vi cấu trúc bề mặt bằng kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE-SEM (Hitachi SU-8010); xác định đường kính thủy động học và chỉ số đa phân tán (PI) bằng hệ thống tán xạ ánh sáng động DLS (Horiba SZ-100V2); phân tích nhóm chức hóa học bằng quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR).
  • Phương pháp thử nghiệm vi sinh: đánh giá hoạt tính kháng khuẩn sơ bộ bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch trên môi trường Tryptone Soya Agar (TSA) với chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae (mật độ $5 \times 10^5 \text{ CFU/mL}$); sử dụng Penicillin làm đối chứng dương và acid acetic 2% làm đối chứng âm.
  • Phương pháp phân tích thống kê: phân tích phương sai (ANOVA), kiểm định độ phù hợp mô hình RSM và so sánh sự khác biệt trung bình bằng phép thử LSD trên phần mềm SPSS 16.0 ở mức ý nghĩa $p < 0,05$.

Nguồn dữ liệu của công trình là số liệu đo đạc thực nghiệm trực tiếp tại các phòng thí nghiệm chuyên ngành, kết hợp đối chiếu các tiêu chuẩn kỹ thuật quốc gia (TCVN 13658:2023) và các công bố khoa học quốc tế liên quan.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu

Chương này trình bày tính cấp thiết của việc tận dụng nguồn phụ phẩm vỏ nhộng ruồi lính đen phát sinh từ công nghệ nuôi côn trùng xử lý rác thải sinh học. Tác giả phân tích lợi thế sinh học của polymer chitosan và sự cần thiết của việc phát triển hạt nanochitosan nhằm tối ưu hóa tính năng mang hoạt chất và bám dính sinh học. Chương 1 khẳng định tính ưu việt của tác nhân liên kết ngang TPP so với các hợp chất aldehyde độc hại (như glutaraldehyde, glyoxal) và xác lập rõ ràng mục tiêu, 3 nhiệm vụ nghiên cứu cùng giới hạn của đề tài.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả tổng hợp hệ thống lý thuyết về nguồn gốc, cấu trúc phân tử của chitin và chitosan; phân tích chi tiết các đặc tính hóa lý như độ tan theo pH, phản ứng định tính lên màu tím với iod trong môi trường $\text{H}_2\text{SO}_4$, tính chất polycationic và khả năng tự phân hủy sinh học. Chương tổng quan phân tích sâu đặc trưng của chitosan chiết xuất từ ruồi lính đen: cấu trúc hình thái bề mặt nhẵn, không xốp với các đơn vị sợi lục giác dạng tổ ong và chỉ số tinh thể thấp, tạo ưu thế cho quá trình hấp phụ ion kim loại nặng và phẩm màu dệt nhuộm.

Bên cạnh đó, chương 2 tổng quan cấu tạo hóa học và cơ chế phản ứng của TPP ($\text{Na}_5\text{P}3\text{O}{10}$); so sánh các kỹ thuật tạo vi nang nano phổ biến (khâu mạch nhũ tương, hợp nhất giọt nhũ tương, khuếch tán dung môi nhũ tương, tạo gel ion). Tác giả trình bày chi tiết nguyên lý toán học và các tiêu chí kiểm định của phương pháp bề mặt đáp ứng Box-Behnken (giá trị $F$, giá trị $p < 0,05$, độ tương thích Lack of Fit $p > 0,05$, chỉ số Adeq Precision $> 4$, hệ số xác định $R^2 > 0,8$), đồng thời điểm luận các công bố quốc tế và trong nước về kích thước hạt nanochitosan (L. Chuah, 2011: 340 nm; Tang và cộng sự, 2006: 50–80 nm; Lê Hồ Khánh Hỷ và cộng sự, 2015: 12–62 nm).

Chương 3: Vật liệu và phương pháp

Nội dung chương mô tả chi tiết địa điểm, thời gian nghiên cứu tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường; liệt kê đầy đủ nguồn gốc mẫu vỏ nhộng ruồi lính đen, chủng vi sinh vật Streptococcus agalactiae, hệ thống hóa chất phân tích và trang thiết bị chuyên dụng. Quy trình điều chế chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính đen được chuẩn hóa qua 4 công đoạn:

  1. Khử protein: xử lý bằng $\text{NaOH}$ 5% ở 90°C trong 4 giờ.
  2. Khử khoáng: xử lý bằng $\text{HCl}$ 4% ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ.
  3. Khử màu: xử lý phối hợp $\text{KMnO}_4$ 1% (1 giờ, nhiệt độ phòng) và acid oxalic 4% (1 giờ, 60°C).
  4. Deacetyl hóa: xử lý bằng $\text{NaOH}$ 70% ở 80°C trong 8 giờ, rửa trung tính, sấy khô và nghiền rây qua lưới 120 mesh (~1 mm).

Thiết kế quy hoạch thực nghiệm RSM theo mô hình Box-Behnken gồm 29 nghiệm thức (24 nghiệm thức thừa số và 5 nghiệm thức tại tâm) được thiết lập với 4 yếu tố: nồng độ chitosan ($X_1$: 0,35–0,90 mg/mL), nồng độ TPP ($X_2$: 0,30–0,80 mg/mL), pH dung dịch ($X_3$: 4–6), tốc độ khuấy ($X_4$: 500–1500 rpm). Chương này cũng quy định chi tiết thao tác tạo gel ion (nhỏ giọt 20 mL dung dịch TPP vào 40 mL dung dịch chitosan trong 40 phút), phương pháp phân tích FE-SEM, DLS, FTIR, phương pháp đục giếng thạch đo đường kính vòng kháng khuẩn và quy trình xử lý dữ liệu thống kê bằng SPSS 16.0 và Design-Expert.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 trình bày toàn bộ kết quả phân tích định tính, định lượng thu được từ các thực nghiệm:

  • Đánh giá chất lượng Chitosan thu nhận: sản phẩm có màu vàng nhạt, không mùi lạ, đạt tiêu chuẩn cảm quan TCVN 13658:2023. Các chỉ tiêu hóa lý xác định được gồm: hàm lượng tro $0,03 \pm 0,01%$, hàm lượng protein dư $0,29 \pm 0,01%$, độ deacetyl đạt $72,30 \pm 2,00%$, độ nhớt $14,31 \pm 0,08\text{ cP}$ và khối lượng phân tử trung bình đạt $194,883\text{ Da}$ (~194,9 kDa). Ảnh FE-SEM khẳng định bề mặt chitosan có cấu trúc vi sợi lục giác xếp cạnh nhau dạng tổ ong đặc trưng, không xốp; phổ FTIR thể hiện đầy đủ các vân hấp thụ đặc trưng của chitosan tinh khiết.
  • Mô hình tương quan giữa các yếu tố công nghệ và kích thước hạt: Dữ liệu đo kích thước 29 nghiệm thức ghi nhận giá trị kích thước dao động trong khoảng từ 172,8 nm (nghiệm thức 17: CS 0,625 mg/mL, TPP 0,30 mg/mL, pH 4, 500 rpm) đến 1013,7 nm (nghiệm thức 22: CS 0,900 mg/mL, TPP 0,80 mg/mL, pH 5, 1000 rpm).
Thông số thống kê mô hình hồi quy (ANOVA) Giá trị ghi nhận
Giá trị F của mô hình (F-value) 13,70
Mức ý nghĩa của mô hình (p-value) 0,0108 ($p < 0,05$)
Hệ số xác định đa biến ($R^2$) 0,9796
Hệ số xác định hiệu chỉnh ($\text{Adjusted } R^2$) 0,9081
Độ chính xác tương thích (Adeq Precision) 14,6617 ($> 4$)

Phương trình hồi quy đa thức bậc hai mô tả kích thước hạt (KT, đơn vị nm) theo các biến mã hóa:

$$\text{KT} = 401,12 - 132,73A + 535,58B + 9,03C + 81,98D - 150,67AB + 131,78AC - 71,13AD - 152,92BC + 115,78BD - 182,88CD - 16,25A^2 + 376,65B^2 + 79,25C^2 - 33,70D^2$$

(Trong đó: A là nồng độ Chitosan, B là nồng độ TPP, C là pH dung dịch, D là tốc độ khuấy).

Phân tích ANOVA chỉ ra biến nồng độ TPP ($B$), tương tác giữa pH và tốc độ khuấy ($CD$), cùng số hạng bậc hai ($B^2$) có ảnh hưởng mang ý nghĩa thống kê sâu sắc nhất ($p < 0,05$). Thí nghiệm kiểm chứng tại điều kiện tối ưu (nồng độ CS 0,625 mg/mL, nồng độ TPP 0,55 mg/mL, pH 4, tốc độ khuấy 500 rpm) lặp lại 10 lần cho kích thước thực nghiệm trung bình đạt $179,11 \pm 5,65\text{ nm}$, nằm trong khoảng dự đoán lý thuyết ($188,90 - 196,32\text{ nm}$) với kiểm định $t$-test đạt $p = 0,179 > 0,05$ (không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê).

  • Hình thái và độ phân bố kích thước hạt: Ảnh FE-SEM cho thấy các hạt nanochitosan tổng hợp có dạng hình cầu đồng nhất, một số hạt tròn nhỏ có xu hướng liên kết tạo cụm khối. Phép đo DLS ghi nhận kích thước hạt trung bình đạt 171,8 nm, phân bố tập trung chủ yếu ở hai dải kích thước 151,57 nm và 171,25 nm, với chỉ số đa phân tán $\text{PI} = 0,388$ khẳng định hệ hạt có độ phân tán đồng đều cao.
  • Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn đối với Streptococcus agalactiae:
Mẫu thử nghiệm Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Mức độ ức chế
Đối chứng dương (Penicillin) $16,67 \pm 1,53$ Kháng mạnh
Đối chứng âm (Acid acetic 2%) $7,33 \pm 1,53$ Không kháng
Chitosan từ ruồi lính đen (CS) $11,00 \pm 1,00$ Kháng vừa
Chitosan chuẩn thương mại (CSC) $11,00 \pm 1,00$ Kháng vừa
Viên bao nanochitosan (NN) $7,00 \pm 1,73$ Không kháng

Kết quả cho thấy dung dịch chitosan ban đầu thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt (vòng ức chế 11 mm), tương đương mẫu chuẩn thương mại. Ngược lại, hạt nanochitosan dạng tự do không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với S. agalactiae (vòng ức chế 7 mm, tương đương đối chứng âm). Tác giả thảo luận nguyên nhân là do tương tác liên kết ngang tĩnh điện giữa nhóm amino $-\text{NH}_3^+$ của chitosan với anion TPP đã làm trung hòa mật độ điện tích dương tự do trên bề mặt hạt, làm giảm khả năng bám dính phá vỡ màng vi khuẩn; tuy nhiên cấu trúc vỏ bọc hình cầu kín của hạt nano tạo ưu thế bảo vệ các hoạt chất mang bên trong khỏi sự tấn công của vi sinh vật.

Chương 5: Kết luận và đề nghị

Tác giả đúc kết các kết quả đạt được về quy trình công nghệ tạo hạt nanochitosan từ nguồn ruồi lính đen đạt kích thước trung bình 179,11 nm và cấu trúc hình cầu đồng đều; đồng thời đề xuất định hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm thu hẹp giới hạn khảo sát các thông số công nghệ và khảo sát độ ổn định động học của hệ hạt.

Kết quả và đóng góp

Các kết quả định lượng cụ thể của đề tài gồm:

  • Chiết xuất thành công chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính đen đạt độ sạch cao với hàm lượng tro $0,03%$, hàm lượng protein $0,29%$, độ deacetyl $72,30%$, độ nhớt $14,31\text{ cP}$ và khối lượng phân tử $194,883\text{ Da}$, đáp ứng tiêu chuẩn TCVN 13658:2023.
  • Xây dựng thành công phương trình hồi quy bề mặt đáp ứng bậc hai với độ tương quan cao ($R^2 = 0,9796$, $\text{Adjusted } R^2 = 0,9081$, $\text{Adeq Precision} = 14,6617$).
  • Xác lập bộ thông số công nghệ tối ưu để tạo hạt nanochitosan: nồng độ chitosan 0,625 mg/mL, nồng độ TPP 0,55 mg/mL (hoặc 0,30 mg/mL theo giới hạn khảo sát), pH 4, tốc độ khuấy 500 rpm. Kích thước hạt thực nghiệm trung bình đạt $179,11 \pm 5,65\text{ nm}$ (kiểm chứng lặp lại 10 lần), kích thước đo DLS đạt 171,8 nm với chỉ số đa phân tán $\text{PI} = 0,388$.
  • Khảo sát hình thái hạt qua ảnh FE-SEM chứng minh hạt có dạng hình cầu đồng nhất. Thử nghiệm vi sinh xác định chitosan ruồi lính đen có hoạt tính kháng khuẩn tốt (đường kính vòng kháng $11,00\text{ mm}$), trong khi hạt nanochitosan tạo gel ion bị giảm hoạt tính kháng khuẩn tự do ($7,00\text{ mm}$) do cơ chế liên kết ngang chiếm giữ các nhóm amino tự do.

Về giải pháp và đóng góp khoa học:

  • Khóa luận đã chứng minh tính khả thi của việc sử dụng phụ phẩm vỏ nhộng ruồi lính đen làm nguồn nguyên liệu thay thế giáp xác biển để sản xuất chitosan thương mại và vật liệu nano.
  • Đóng góp quy trình toán học hóa việc tối ưu hóa đa thông số trong kỹ thuật tạo gel ion bằng phương pháp bề mặt đáp ứng Box-Behnken, cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác cho các nghiên cứu ứng dụng hạt nanochitosan làm hệ chất mang giải phóng có kiểm soát trong nông nghiệp và dược phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận ghi nhận các giới hạn kỹ thuật và định hướng mở rộng:

  • Giới hạn nghiên cứu: Hệ hạt nanochitosan dạng rỗng (chưa nạp hoạt chất) tổng hợp từ phương pháp tạo gel ion với TPP không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn trực tiếp đối với chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae. Nghiên cứu chưa thực hiện đánh giá độ ổn định thế zeta ($\zeta$-potential) và khả năng lưu trữ dài hạn của hệ keo nano theo thời gian.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo: Thu hẹp khoảng giá trị khảo sát của 4 biến công nghệ trong mô hình RSM để tối ưu hóa sâu hơn kích thước hạt; khảo sát độ ổn định của hệ hạt nano; nghiên cứu phối hợp hạt nanochitosan với các hạt nano kim loại (như nano bạc Ag) hoặc sử dụng hạt làm vỏ bọc nạp các hoạt chất sinh học, tinh dầu, thuốc bảo vệ thực vật nhằm gia tăng hoạt tính sinh học và mở rộng ứng dụng thực tế.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các ngành Công nghệ Sinh học, Kỹ thuật Hóa học, Công nghệ Vật liệu, Nông nghiệp và Dược học.

Các nội dung có giá trị tham khảo ứng dụng cao bao gồm:

  • Quy trình chiết xuất hóa học đa bước phân lập chitin và chuyển hóa thành chitosan từ nguồn côn trùng (ruồi lính đen).
  • Thiết kế ma trận thực nghiệm Box-Behnken 29 nghiệm thức và quy trình xử lý thống kê tối ưu hóa bề mặt đáp ứng bằng phần mềm chuyên dụng.
  • Phương pháp phối hợp các kỹ thuật phân tích hiện đại (FE-SEM, DLS, FTIR, chuẩn độ hóa học) để xác định cấu trúc vi mô và đặc tính lý hóa của vật liệu polymer nano sinh học.

Câu hỏi thường gặp

1. Quy trình điều chế Chitosan từ vỏ nhộng ruồi lính đen gồm những bước nào và chất lượng sản phẩm đạt được ra sao? Quy trình gồm 4 công đoạn hóa học nối tiếp: khử protein bằng dung dịch $\text{NaOH}$ 5% (4 giờ, 90°C); khử khoáng bằng dung dịch $\text{HCl}$ 4% (12 giờ, nhiệt độ phòng); khử màu kết hợp $\text{KMnO}_4$ 1% (1 giờ) và acid oxalic 4% (1 giờ, 60°C); và deacetyl hóa bằng dung dịch $\text{NaOH}$ 70% (8 giờ, 80°C). Chitosan thành phẩm dạng bột vàng nhạt, không mùi lạ, đạt các chỉ tiêu: độ tro $0,03 \pm 0,01%$, protein dư $0,29 \pm 0,01%$, độ deacetyl $72,30 \pm 2,00%$, độ nhớt $14,31 \pm 0,08\text{ cP}$ và khối lượng phân tử $194,883\text{ Da}$, phù hợp TCVN 13658:2023.

2. Mô hình toán học tối ưu hóa kích thước hạt nanochitosan được thiết lập như thế nào và có độ tin cậy ra sao? Mô hình quy hoạch thực nghiệm Box-Behnken (BBD) gồm 29 nghiệm thức với 4 biến: nồng độ CS (0,35–0,90 mg/mL), nồng độ TPP (0,30–0,80 mg/mL), pH (4–6) và tốc độ khuấy (500–1500 rpm). Phương trình hồi quy bậc hai đạt giá trị $F = 13,70$, mức ý nghĩa $p = 0,0108 < 0,05$, hệ số xác định $R^2 = 0,9796$, hệ số xác định hiệu chỉnh $\text{Adjusted } R^2 = 0,9081$ và chỉ số tín hiệu trên nhiễu $\text{Adeq Precision} = 14,6617 > 4$, khẳng định mô hình có độ chính xác và tương thích thống kê cao.

3. Điều kiện tối ưu của quy trình tạo hạt nanochitosan là gì và kích thước thực nghiệm đạt được bao nhiêu? Bộ điều kiện tối ưu được xác lập gồm: nồng độ chitosan 0,625 mg/mL, nồng độ TPP 0,55 mg/mL (hoặc 0,30 mg/mL tùy phạm vi nghiệm thức), dung dịch đạt pH 4 và tốc độ khuấy 500 rpm. Tại điều kiện này, thí nghiệm kiểm chứng lặp lại 10 lần thu được hạt nano có kích thước trung bình $179,11 \pm 5,65\text{ nm}$, phù hợp hoàn toàn với khoảng dự đoán lý thuyết ($188,90 - 196,32\text{ nm}$) với kiểm định $t$-test đạt $p = 0,179 > 0,05$.

4. Cấu trúc hình thái và mức độ phân tán kích thước hạt nanochitosan thể hiện đặc điểm gì qua FE-SEM và DLS? Ảnh kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE-SEM xác định các hạt nanochitosan có dạng hình cầu khép kín, tương đối đồng đều và có hiện tượng tập hợp thành các cụm hạt nhỏ. Phân tích DLS ghi nhận đường kính hạt trung bình là 171,8 nm, phân bố tập trung ở 151,57 nm và 171,25 nm, với chỉ số đa phân tán $\text{PI} = 0,388$, chứng minh hệ hạt có tính đồng nhất cao về mặt kích thước.

5. Vì sao hạt nanochitosan tổng hợp không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Streptococcus agalactiae? Mặc dù chitosan nguyên liệu ban đầu có hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt (đường kính vòng kháng $11,00\text{ mm}$), hạt nanochitosan tạo gel ion chỉ cho vòng ức chế $7,00\text{ mm}$ (tương đương đối chứng âm không kháng). Nguyên nhân là do các nhóm amino tích điện dương ($-\text{NH}_3^+$) của chitosan – yếu tố chịu trách nhiệm liên kết tĩnh điện phá hủy màng tế bào vi khuẩn – đã tham gia liên kết ngang với các gốc polyanion của TPP trong cấu trúc hạt gel, dẫn đến làm mất hoạt tính kháng khuẩn tự do của hệ hạt rỗng.

Kết luận

Khóa luận đã nghiên cứu thành công quy trình công nghệ chiết xuất chitosan từ phụ phẩm vỏ nhộng ruồi lính đen (Hermetia illucens) đạt tiêu chuẩn chất lượng và ứng dụng phương pháp bề mặt đáp ứng Box-Behnken để tối ưu hóa quy trình chế tạo hạt nanochitosan bằng kỹ thuật tạo gel ion với TPP. Hệ hạt nano thu được tại điều kiện tối ưu có kích thước trung bình 179,11 nm, dạng hình cầu đồng nhất và chỉ số đa phân tán thấp ($\text{PI} = 0,388$). Công trình đã làm sáng tỏ mối tương quan giữa các thông số công nghệ đến kích thước hạt và giải thích cơ chế ảnh hưởng của liên kết ngang TPP đến hoạt tính kháng khuẩn, cung cấp cơ sở khoa học tin cậy cho việc phát triển các hệ vật liệu nano mang hoạt chất sinh học từ nguồn phụ phẩm côn trùng.