ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tim mạch là một trong những bệnh lý có khả năng gây tử vong cao trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng. Dữ liệu khoa học cho thấy, những tổn thƣơng trong bệnh lý tim mạch có liên quan nhiều đến sự thay đổi cấu trúc và chức năng ty thể của tế bào cơ tim [2, 75]. Vì vậy, nghiên cứu phƣơng pháp phòng và chống bệnh tim mạch hƣớng đích ty thể thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học. Thực tế, nhiều nghiên cứu đã tập trung phân tích sự thay đổi cấu trúc và chức năng của bào quan này nhƣ khả năng tổng hợp năng lƣợng ATP, thành phần lipid màng, giá trị điện thế lớp màng ty thể hay hoạt động của chuỗi hô hấp ty thể [40, 53].
Việc phân tích các chỉ số chức năng ty thể là cơ sở để đánh giá ảnh hƣởng của thuốc hoặc các chất lên ty thể cũng nhƣ tế bào cơ tim. Tế bào H9C2 là một dòng tế bào có nguồn gốc từ mô cơ tim phôi thai chuột BDX1 [41] và thƣờng đƣợc sử dụng trong các mô hình nghiên cứu bệnh về tim nhƣ thiếu máu cục bộ cơ tim, phì đại cơ tim, nghiên cứu ảnh hƣởng của các độc tố, nghiên cứu sàng lọc và tạo thuốc mới. Tuy nhiên, hiện nay tại Việt Nam các nghiên cứu sử dụng tế bào này để thiết kế mô hình bệnh tim mạch còn khá mới. Do vậy, việc xây dựng và hoàn thiện quy trình nuôi cấy tế bào ổn định, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam nhằm phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu là cần thiết.
Với định hƣớng phát triển nghiên cứu thực nghiệm bệnh tim, đặc biệt là bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim trên cơ sở sử dụng dòng tế bào H9C2 tại Việt Nam, đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy và phân tích một số chỉ số chức năng ty thể của tế bào cơ tim chuột H9C2” đƣợc thực hiện với hai mục tiêu chính sau: - Xây dựng quy trình nuôi cấy dòng tế bào cơ tim chuột H9C2. - Phân tích một số chỉ số chức năng ty thể của tế bào cơ tim chuột H9C2. Đề tài này nằm trong khuôn khổ nội dung nghiên cứu của đề tài Nafosted “Nghiên cứu, sàng lọc chất c tác dụng bảo vệ cơ tim hƣớng đích ty thể sử dụng mô hình thiếu máu cục bộ cơ tim trên tim chuột cô lập và tế bào tim chuột nuôi cấy”, mã số 106-YS. Nghiên cứu đƣợc thực hiện tại các phòng Thí nghiệm thuộc Trung tâm Khoa học Sự sống, Bộ môn Sinh lý học và Sinh học ngƣời, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
1 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Chƣơng 1. Bệnh tim mạch Bệnh tim mạch (cardiovascular diseases - CVD) gồm một nhóm các bệnh liên quan đến hệ thống tim mạch nhƣ: bệnh động mạch vành, đau thắt ngực, đột qụy, bệnh tim bẩm sinh, bệnh van tim, phình động mạch chủ…. Bệnh lý này có nguy cơ gây tử vong cao và có tính chất đột ngột. Trên thế giới, năm 2016 đã c khoảng 17,6 triệu ngƣời chết vì các bệnh tim mạch [10].
Tỷ lệ tử vong sớm do bệnh tim mạch dao động từ 4% (ở các nƣớc thu nhập cao) đến 42% (ở các nƣớc thu nhập thấp) [63]. Mặc dù CVD thƣờng ảnh hƣởng đến ngƣời trƣởng thành trong giai đoạn sau của cuộc đời, các triệu chứng nhƣ xơ vữa động mạch thƣờng bắt đầu sớm hơn, do vậy việc phòng ngừa sớm là rất quan trọng [48]. Những tiến bộ khoa học gần đây đã giúp làm sáng tỏ hơn về các nguyên nhân cơ bản của bệnh tim. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu thƣờng sử dụng các mô hình khác nhau và hƣớng tập trung vào sinh lý bệnh hoặc các ứng dụng điều trị bệnh.
Bên cạnh vấn đề đạo đức nghiên cứu, việc thực nghiệm phân tích bệnh lý cơ tim ở cấp độ tế bào, mô cơ tim của ngƣời bệnh gần nhƣ là không thể thực hiện. Để giải quyết vấn đề này, nhiều loài động vật nhƣ lợn, thỏ, chuột đã trở thành các đối tƣợng nghiên cứu do mức độ khá tƣơng đồng của chúng so với ngƣời và thƣờng đƣợc lựa chọn để thay thế. Từ các nguồn động vật này, nhiều dòng tế bào cơ tim đƣợc cô lập, nuôi cấy và duy trì với các yêu cầu kỹ thuật không quá phức tạp, giúp chúng trở thành đối tƣợng lý tƣởng cho nghiên cứu cơ chế sinh bệnh lý tim và phân tích dƣợc lý liên quan [51]. Các dòng tế bào cơ tim sử dụng trong nghiên cứu bệnh tim Nghiên cứu các bệnh về tim có thể dùng các loại tế bào đƣợc phân lập trực tiếp từ cơ tim và nuôi cấy (primary cultural cells), các dòng tế bào cơ tim bất tử (cardiomyocyte cell lines) và các dòng tế bào mang một số đặc điểm của tế bào cơ tim (cardiomyogenic cell lines).
Tuy nhiên, việc phân lập tế bào từ mô cơ tim và nuôi cấy tƣơng đối phức tạp, phải chịu áp lực về mặt thời gian vì các tế bào có thời gian sống ngắn, nên chúng thƣờng đƣợc sử dụng sau giai đoạn thử nghiệm trên các dòng tế bào nuôi cấy ổn định. Do vậy, trong giai đoạn thử nghiệm đầu tiên của các nghiên cứu bệnh tim mạch ở cấp độ tế bào, các dòng tế bào cơ tim nuôi ổn định hay 2 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com dòng tế bào bất tử (dòng tế bào thƣơng mại) thƣờng đƣợc sử dụng. Sự phát triển của các dòng tế bào cơ tim bất tử, sinh sôi nảy nở dễ dàng trong nuôi cấy nhƣng vẫn duy trì một kiểu hình nhất định đã cung cấp cho các nhà nghiên cứu một công cụ hiệu quả để thăm dò, phân tích các cơ chế sinh-bệnh lý của tế bào tim, và tim. Có nhiều dòng tế bào cơ tim bất tử (cardiomyocytecell lines) đƣợc thiết lập và dùng trong các thí nghiệm nghiên cứu các bệnh lý tim nhƣ dòng tế bào AC16 [20], HL-1 [19], H9C2 [33]… Dòng tế bào AC16 đƣợc tạo ra từ mô thất trái của ngƣời trƣởng thành có thể là lựa chọn trong các công việc nghiên cứu phân tích các quá trình sau phân bào [20].
Tế bào cơ tim A) Tế bào HL-1; B) Tế bào AC 16 (https://www.com/catalog/product/mm/ ) Dòng tế bào cơ tim HL-1 là dòng tế bào cơ tim của chuột có nguồn gốc từ các tế bào của khối u tâm nhĩ. Tế bào HL-1 có thể liên tục phân chia qua nhiều thế hệ mà vẫn giữ đƣợc các đặc tính hình thái, sinh h a và điện sinh lý. Các tế bào HL- 1 đã đƣợc sử dụng để nghiên cứu chức năng tế bào cơ tim bình thƣờng liên quan đến tín hiệu, điện, chuyển h a và điều hòa phiên mã cũng nhƣ để giải quyết các tình trạng bệnh lý nhƣ thiếu oxy, tăng glucose máu - tăng insulin máu, sự chết theo chƣơng trình và thiếu máu cục bộ,…[19]. Dòng tế bào cơ tim phôi chuột H9C2 thƣờng đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu in vitro, bao gồm phân tích vai trò, chức năng độc tính của chất/thuốc mới đối với tim [17, 47].
Nghiên cứu gần đây đã phân tích ảnh hƣởng của số thế hệ tế bào cấy chuyển (tối đa là 25 thế hệ) đến kết quả phân tích độc tính của tế bào gây ra bởi 3 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com doxorubicin cho thấy, khi số thế hệ cấy chuyển càng tăng thì kết quả thu đƣợc ở các lần phân tích khác nhau sẽ c sự biến thiên cao [55]. H9C2 cũng đƣợc sử dụng nhiều trong nghiên cứu về bệnh phì đại cơ tim [16, 77], nghiên cứu các enzym chuyển hóa thuốc trong cơ tim [82]. Đặc biệt, dòng tế bào này đƣợc sử dụng nhiều trong các nghiên cứu bệnh lý thiếu máu cục bộ-tái tƣới máu cơ tim (TMTTMCT)/ hypoxia- reoxygenation (HR). Trong các điều kiện thiếu oxy-tái cung cấp oxy, tế bào H9C2 thể hiện những đặc điểm khác biệt về trao đổi chất năng lƣợng, chức năng ty thể và tính nhạy cảm với môi trƣờng so với dòng tế bào HL-1 [43].
Bên cạnh các dòng tế bào cơ tim ổn định nhƣ trên, một số dòng tế bào khác có nguồn gốc không phải từ tim (cardiomyogenic cell lines) cũng đƣợc sử dụng trong một số nghiên cứu về tim nhƣ P19 [74], ESCs [60], iPSCs [69]. Dòng tế bào P19 đƣợc phân lập từ tế bào ung thƣ biểu mô phôi chuột thực nghiệm. Các tế bào này là đa bội và có thể phân hóa thành các loại tế bào của cả ba lớp phôi, bao gồm cả tế bào cơ tim. Do khả năng biệt hóa thành tế bào cơ tim, chúng đƣợc sử dụng để phân tích vai trò của các yếu tố phiên mã đặc hiệu của tim cũng nhƣ đƣờng dẫn tín hiệu ngƣợc trong sự biệt hóa tế bào tim và gần đây nhất là để thử nghiệm đánh giá khả năng tƣơng thích sinh học [74].
Ngoài ra, các tế bào gốc nhƣ ESCs - tế bào gốc phôi chuột - đƣợc phân lập từ các nguồn phôi nang khác nhau và iPSCs - tế bào gốc đa năng cảm ứng - đƣợc trực tiếp tạo ra từ các tế bào sinh dƣỡng đã cung cấp một mô hình hữu ích cho nghiên cứu sự phát triển cũng nhƣ sự biệt hóa tế bào cơ tim [60, 69]. Các dòng tế bào cơ tim bất tử cũng nhƣ các dòng tế bào khác mang đặc tính của tế bào cơ tim đã đƣợc ứng dụng nhiều trong các mô hình nghiên cứu in vitro về cơ chế bệnh sinh cũng nhƣ các phƣơng pháp trị liệu bệnh tim. Trong đ , tế bào cơ tim chuột H9C2 thể hiện một số đặc điểm ƣu việt hơn nhƣ dễ nuôi cấy, có tính ổn định cao qua các lần cấy chuyển và có khả năng mô phỏng tốt nhiều điều kiện bệnh lý tim. Do vậy, trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy tế bào H9C2 cũng nhƣ thiết lập mô hình tổn thƣơng TMTTMCT/HR sử dụng dòng tế bào này, để đánh giá hiệu quả của quá trình nuôi cấy và ứng dụng của H9C2 trong mô hình thiết lập đƣợc.
Đây là bƣớc tiền đề, là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm phòng và chống lại bệnh lý tim nguy hiểm này. 4 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Tế bào cơ tim chuột H9C2 1. Nguồn gốc, đặc điểm của tế bào H9C2 Dòng tế bào cơ tim H9C2 là một nhánh của dòng tế bào có nguồn gốc từ mô phôi chuột BD1X, Rattus norvegicus, đƣợc nghiên cứu lần đầu bởi Kimes và Brandt năm 1976.
Về hình thái, đây là tế bào mô cơ tim với đầy đủ các đặc tính của nguyên bào cơ và đƣợc phân vào nhóm tế bào bám dính (Hình 1. Trên bề mặt, tế bào H9C2 có các thụ thể Acetylcholine, do đ c thể đáp ứng lại các kích thích với Acetylcholine.