Luận văn thạc sĩ nghiên cứu biểu hiện tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein ha5 1 tái tổ hợp biểu hiệu trong escherichia coli

Luận văn thạc sĩ phân tích nghiên cứu biểu hiện tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein ha5 1 tái tổ, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Trần Thị Nhài
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu protein HA5-1 và khả năng miễn dịch
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM
• 1.1.1. Sơ lƣợc về cấu trúc và khả năng gây bệnh của virus cúm
• 1.1.2. Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ
• 1.1.3. Cấu trúc, chức năng của HA và NA
• 1.1.4. Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A
• 1.1.5. Vaccine phòng cúm A/H5N1
• 1.2. BIỂU HIỆN GEN
• 1.2.1. Hệ biểu hiện E.
• 1.2.2. Chủng biểu hiện E.
• 1.2.3. Vector biểu hiện pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin
• 1.3. Các chủng sinh vật và plasmid
• 1.4. Hóa chất và enzym
• 1.5. Máy móc và thiết bị
• 1.6. Môi trƣờng nuôi cấy
• 2. CHƯƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Xử lý cắt DNA plasmid bằng enzym cắt giới hạn
• 2.2. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào plasmid
• 2.3. Biến nạp sản phẩm ghép gen vào tế bào E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
• 2.4. Tách chiết plasmid DNA từ tế bào E.
• 2.5. Điện di DNA trên gel agarose
• 2.6. Thu nhận băng DNA từ gel agarose
• 2.7. Điện di protein trên gel polyacrylamide
• 2.8. Biểu hiện protein tái tổ hợp
• 2.9. Tinh chế sơ bộ protein tái tổ hợp bằng dung dịch đệm urê
• 2.10. Kiểm tra tính kháng nguyên của TrxHA5-1
• 2.11. Kiểm tra khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên gà
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET22TRXHA5-1
• 3.2. Chuyển gen ha5-1 vào vector biểu hiện pET22trx
• 3.3. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22trxha5-l bằng enzyme cắt giới hạn
• 3.4. BIỂU HIỆN GEN HA5-1 TRONG CHỦNG VI KHUẨN E.
• 3.5. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1 TRONG E.
• 3.5.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự biểu hiện của gen ha5-l
• 3.5.2. Ảnh hƣởng của nồng độ IPTG đến sự biểu hiện của gen ha5-l
• 3.5.3. Lựa chọn thời điểm thu mẫu thích hợp
• 3.6. TINH CHẾ SƠ BỘ PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1
• 3.7. KIỂM TRA TÍNH SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP HA5-1
• PHỤ LỤC
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu protein HA5 1 và khả năng miễn dịch

Nghiên cứu về protein HA5-1 và khả năng miễn dịch là một lĩnh vực quan trọng trong sinh học thực nghiệm. Protein HA5-1 là một thành phần chính trong virus cúm A, có vai trò quan trọng trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Việc hiểu rõ về cấu trúc và chức năng của protein này sẽ giúp phát triển các phương pháp phòng ngừa hiệu quả hơn đối với dịch cúm. Nghiên cứu này không chỉ giúp nâng cao hiểu biết về virus cúm mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển vaccine phòng bệnh.

1.1. Đặc điểm cấu trúc của protein HA5 1

Protein HA5-1 có cấu trúc phức tạp, bao gồm nhiều đơn vị khác nhau. Cấu trúc này quyết định khả năng gắn kết với thụ thể trên bề mặt tế bào, từ đó ảnh hưởng đến khả năng xâm nhập của virus. Việc nghiên cứu cấu trúc của protein HA5-1 giúp xác định các vị trí tiềm năng để phát triển vaccine.

1.2. Vai trò của protein HA5 1 trong đáp ứng miễn dịch

Protein HA5-1 đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể. Khi cơ thể tiếp xúc với protein này, nó sẽ sinh ra các kháng thể đặc hiệu, giúp bảo vệ chống lại virus cúm. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng protein HA5-1 trong vaccine có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ hơn.

II. Thách thức trong nghiên cứu protein HA5 1 và khả năng miễn dịch

Mặc dù nghiên cứu về protein HA5-1 đã đạt được nhiều thành tựu, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần vượt qua. Một trong những thách thức lớn nhất là sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A. Virus có khả năng thay đổi cấu trúc bề mặt, làm cho các kháng thể sinh ra từ vaccine không còn hiệu quả. Điều này đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải liên tục cập nhật và điều chỉnh vaccine để đảm bảo hiệu quả phòng ngừa.

2.1. Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A

Virus cúm A có khả năng biến đổi kháng nguyên thông qua các cơ chế như đột biến điểm và tái tổ hợp gen. Điều này dẫn đến sự xuất hiện của các chủng virus mới, làm giảm hiệu quả của vaccine hiện có. Nghiên cứu về cơ chế này là rất cần thiết để phát triển các chiến lược vaccine hiệu quả hơn.

2.2. Khó khăn trong việc phát triển vaccine hiệu quả

Việc phát triển vaccine hiệu quả chống lại virus cúm A là một thách thức lớn. Các vaccine hiện tại thường chỉ có hiệu quả với một số chủng nhất định. Do đó, cần có những nghiên cứu sâu hơn về protein HA5-1 để tạo ra các vaccine có khả năng bảo vệ rộng rãi hơn.

III. Phương pháp nghiên cứu protein HA5 1 và khả năng miễn dịch

Để nghiên cứu protein HA5-1, các nhà khoa học thường sử dụng các phương pháp sinh học phân tử hiện đại. Các phương pháp này bao gồm biểu hiện gen trong hệ thống E. coli, tinh chế protein và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch. Việc áp dụng các công nghệ mới giúp tăng cường hiệu quả nghiên cứu và phát triển vaccine.

3.1. Biểu hiện gen HA5 1 trong E. coli

Hệ thống E. coli được sử dụng rộng rãi để biểu hiện protein tái tổ hợp. Quá trình này bao gồm việc cắt và ghép gen HA5-1 vào plasmid, sau đó chuyển vào tế bào E. coli để sản xuất protein. Phương pháp này cho phép thu được lượng lớn protein HA5-1 phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.2. Tinh chế protein HA5 1

Sau khi biểu hiện, protein HA5-1 cần được tinh chế để loại bỏ các tạp chất. Các phương pháp tinh chế như sắc ký lỏng và điện di trên gel polyacrylamide thường được sử dụng. Việc tinh chế hiệu quả sẽ đảm bảo chất lượng protein phục vụ cho các thí nghiệm đánh giá khả năng miễn dịch.

IV. Ứng dụng thực tiễn của protein HA5 1 trong nghiên cứu miễn dịch

Nghiên cứu về protein HA5-1 không chỉ dừng lại ở lý thuyết mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn. Protein này có thể được sử dụng để phát triển các loại vaccine mới, giúp bảo vệ gia cầm và con người khỏi virus cúm A. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng vaccine chứa protein HA5-1 có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ và bền vững.

4.1. Phát triển vaccine phòng cúm A H5N1

Vaccine phòng cúm A/H5N1 được phát triển dựa trên protein HA5-1 đã cho thấy hiệu quả cao trong việc bảo vệ gia cầm. Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy vaccine này có khả năng kích thích sản sinh kháng thể mạnh mẽ, giúp ngăn ngừa sự lây lan của virus.

4.2. Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch

Việc đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5-1 là rất quan trọng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng protein này có thể kích thích hệ thống miễn dịch tạo ra các kháng thể đặc hiệu, giúp bảo vệ cơ thể khỏi sự xâm nhập của virus cúm A.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu protein HA5 1

Nghiên cứu về protein HA5-1 và khả năng miễn dịch đã mở ra nhiều hướng đi mới trong việc phát triển vaccine phòng cúm A. Mặc dù còn nhiều thách thức, nhưng với sự tiến bộ của công nghệ sinh học, hy vọng rằng các vaccine hiệu quả hơn sẽ được phát triển trong tương lai. Việc tiếp tục nghiên cứu và cải tiến các phương pháp sẽ giúp nâng cao khả năng bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.1. Hướng đi mới trong nghiên cứu vaccine

Các nghiên cứu hiện tại đang tập trung vào việc phát triển các loại vaccine mới dựa trên protein HA5-1. Những vaccine này không chỉ có khả năng bảo vệ tốt hơn mà còn có thể giảm thiểu tác dụng phụ cho người sử dụng.

5.2. Tương lai của nghiên cứu miễn dịch

Tương lai của nghiên cứu miễn dịch sẽ phụ thuộc vào việc hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của protein HA5-1. Các nghiên cứu sâu hơn sẽ giúp phát triển các chiến lược phòng ngừa hiệu quả hơn, bảo vệ sức khỏe cộng đồng trước các dịch bệnh do virus cúm gây ra.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Virus cúm gia cầm A/H5N1 là tác nhân gây bệnh truyền nhiễm cấp tính với khả năng lây lan nhanh và độc lực cao, đã xuất hiện tại hơn 50 quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Tính đến năm 2012, theo báo cáo của WHO, đã có khoảng 583 trường hợp mắc cúm A/H5N1 ở người với 344 trường hợp tử vong, đồng thời ước tính khoảng 120 triệu gia cầm chết hoặc bị tiêu hủy do dịch bệnh này. Virus cúm A/H5N1 có khả năng biến đổi kháng nguyên liên tục qua đột biến và tái tổ hợp, làm cho việc kiểm soát dịch bệnh trở nên khó khăn. Protein hemagglutinin (HA), đặc biệt là tiểu phần HA1, đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm và kích thích đáp ứng miễn dịch bảo vệ vật chủ, do đó được xem là kháng nguyên chính trong phát triển vaccine phòng cúm.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là biểu hiện, tinh chế và đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein HA5-1 tái tổ hợp được biểu hiện trong vi khuẩn Escherichia coli, nhằm hướng tới phát triển vaccine tái tổ hợp dưới đơn vị phòng cúm A/H5N1 cho gia cầm. Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trong khoảng thời gian năm 2011-2012. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc cung cấp nguồn protein kháng nguyên tinh sạch, có tính sinh miễn dịch cao, góp phần phát triển vaccine an toàn, hiệu quả và tiết kiệm chi phí so với các phương pháp truyền thống.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc và chức năng của virus cúm A/H5N1: Virus thuộc họ Orthomyxoviridae, có hệ gen RNA sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn mã hóa cho 11 protein, trong đó HA và NA là hai glycoprotein bề mặt quan trọng quyết định tính kháng nguyên và độc lực của virus. HA chịu trách nhiệm gắn kết với thụ thể trên tế bào vật chủ, khởi đầu quá trình xâm nhiễm, còn NA giúp giải phóng các hạt virus mới khỏi tế bào nhiễm.

• Biến đổi kháng nguyên của virus cúm A: Bao gồm hiện tượng lệch kháng nguyên (antigenic drift) do đột biến điểm trong gen HA và NA, và hiện tượng trộn kháng nguyên (antigenic shift) do tái tổ hợp gen giữa các chủng virus khác nhau, dẫn đến sự xuất hiện các biến chủng mới có khả năng lây nhiễm và gây bệnh khác biệt.

• Hệ biểu hiện protein tái tổ hợp trong Escherichia coli: E. coli BL21 được sử dụng làm vật chủ biểu hiện protein nhờ ưu điểm sinh trưởng nhanh, môi trường nuôi cấy đơn giản, khả năng biểu hiện protein cao và có các đột biến giảm hoạt tính protease nội bào. Vector pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin được sử dụng để dung hợp với gen ha5-1, giúp tăng tính ổn định và khả năng tinh chế protein.

• Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch: Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) được sử dụng để đo hiệu giá kháng thể kháng HA trong huyết thanh gà sau khi gây miễn dịch với protein tái tổ hợp.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Gen ha5-1 mã hóa tiểu phần HA1 của virus cúm A/H5N1 được tách dòng từ plasmid pCRha5-1. Vector biểu hiện pET22trx chứa gen trx được sử dụng để tạo plasmid tái tổ hợp pET22trxha5-1.

• Phương pháp phân tích:

  • Cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn NcoI và BamHI, ghép nối gen ha5-1 vào vector pET22trx bằng enzyme T4 DNA ligase.
  • Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli DH5α để nhân bản, sau đó chuyển sang E. coli BL21 để biểu hiện protein.
  • Tối ưu điều kiện biểu hiện protein gồm nhiệt độ (22°C, 28°C, 30°C, 37°C), nồng độ IPTG (0,1-2 mM) và thời gian thu mẫu (1-5 giờ).
  • Tinh chế protein tái tổ hợp bằng phương pháp siêu âm phá tế bào, ly tâm loại bỏ protein tan, hòa tủa trong đệm urê 2 M.
  • Kiểm tra tính kháng nguyên bằng Western blot sử dụng kháng thể kháng HA5 thu được từ thỏ.
  • Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên gà bằng phản ứng HI sau khi gây miễn dịch qua đường tiêm và nhỏ mắt, mũi.

• Timeline nghiên cứu:

  • Thiết kế và tạo plasmid tái tổ hợp: 2 tháng
  • Biểu hiện và tối ưu điều kiện: 3 tháng
  • Tinh chế và kiểm tra tính kháng nguyên: 2 tháng
  • Gây miễn dịch và đánh giá đáp ứng miễn dịch trên gà: 3 tháng
  • Phân tích dữ liệu và hoàn thiện luận văn: 2 tháng

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Thiết kế và xác nhận plasmid tái tổ hợp pET22trxha5-1:

   • Đoạn gen ha5-1 (~1 kb) được cắt ra từ plasmid pCRha5-1 và ghép thành công vào vector pET22trx (5,9 kb).
   • Kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn NcoI và BamHI cho thấy hai băng DNA tương ứng 1 kb và 5,9 kb, khẳng định gen ha5-1 đã được chèn đúng.
   • Giải trình tự gen ha5-1 trong plasmid tái tổ hợp cho kết quả đồng nhất 100% với trình tự tham chiếu.

2. Biểu hiện protein TrxHA5-1 trong E. coli BL21:

   • Protein tái tổ hợp có kích thước khoảng 57,5 kDa được biểu hiện mạnh mẽ, vượt trội so với protein nền của vi khuẩn.
   • Phần lớn protein được tổng hợp dưới dạng không tan, thuận lợi cho quá trình tinh chế.
   • Nhiệt độ tối ưu biểu hiện là 30°C, nồng độ IPTG tối ưu là 0,5 mM, thời gian thu mẫu tốt nhất là 4 giờ sau khi cảm ứng.

3. Tinh chế protein tái tổ hợp:

   • Protein TrxHA5-1 được tinh chế thành công bằng phương pháp siêu âm phá tế bào và hòa tủa trong đệm urê 2 M, thu được sản phẩm tinh sạch với băng protein rõ nét trên gel SDS-PAGE.
   • Một số protein phụ kích thước 40-45 kDa có thể là sản phẩm phân cắt của TrxHA5-1 vẫn giữ khả năng liên kết với kháng thể.

4. Kiểm tra tính kháng nguyên và khả năng sinh đáp ứng miễn dịch:

   • Western blot cho thấy protein tái tổ hợp TrxHA5-1 có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể kháng HA5 của virus cúm A/H5N1.
   • Gà được gây miễn dịch với protein TrxHA5-1 có hiệu giá kháng thể HI tăng dần, đạt đỉnh khoảng 2,7 log2 khi tiêm và 2,2 log2 khi nhỏ mắt, mũi sau 3-4 tuần.
   • Đáp ứng miễn dịch qua đường nhỏ mắt, mũi duy trì hiệu giá kháng thể cao hơn so với đường tiêm sau tuần thứ 5.

Thảo luận kết quả

Kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp TrxHA5-1 trong E. coli BL21 phù hợp với các nghiên cứu trước đây về biểu hiện protein virus trong hệ vi khuẩn, cho thấy hệ vector pET22b(+) mang gen trx là lựa chọn hiệu quả để tăng cường ổn định và lượng protein thu được. Việc protein chủ yếu biểu hiện dưới dạng không tan là đặc điểm thường gặp, đồng thời có thể giúp tăng tính sinh miễn dịch khi sử dụng làm vaccine.

Điều kiện tối ưu biểu hiện (30°C, 0,5 mM IPTG, 4 giờ) cân bằng giữa hiệu suất sản xuất và chi phí, phù hợp với các nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp khác. Tinh chế protein bằng đệm urê 2 M giúp loại bỏ phần lớn protein không mong muốn, thu được sản phẩm tinh sạch có tính kháng nguyên cao, được xác nhận qua Western blot.

Phản ứng HI trên gà cho thấy protein tái tổ hợp có khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, tuy nhiên hiệu giá kháng thể còn thấp so với vaccine thương phẩm, có thể do liều lượng protein hoặc tá chất sử dụng chưa tối ưu. Đáng chú ý, đường nhỏ mắt, mũi cho hiệu quả miễn dịch kéo dài hơn đường tiêm, mở ra hướng nghiên cứu tiêm chủng không xâm lấn cho gia cầm.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ biểu thị mức độ biểu hiện protein theo nhiệt độ, nồng độ IPTG và thời gian, cũng như biểu đồ hiệu giá HI theo tuần sau gây miễn dịch, giúp minh họa rõ ràng xu hướng và hiệu quả của các điều kiện thử nghiệm.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Nâng cao hiệu quả biểu hiện protein:

   • Tăng cường tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy như pH, môi trường dinh dưỡng và thời gian cảm ứng để tăng năng suất protein tái tổ hợp.
   • Thực hiện biểu hiện protein ở dạng dung hợp với các peptide giúp tăng tính hòa tan hoặc ổn định cấu trúc.

2. Cải tiến quy trình tinh chế:

   • Áp dụng các phương pháp tinh chế bổ sung như sắc ký affinity dựa trên His-tag để nâng cao độ tinh khiết và loại bỏ protein phân cắt.
   • Nghiên cứu các phương pháp tái cấu trúc protein không tan thành dạng tan để tăng tính sinh miễn dịch.

3. Phát triển vaccine tái tổ hợp dưới đơn vị:

   • Thử nghiệm các liều lượng protein khác nhau để xác định liều tối ưu cho đáp ứng miễn dịch cao hơn, tương đương vaccine thương phẩm.
   • Khai thác các tá chất mới hoặc phối hợp tá chất để tăng cường đáp ứng miễn dịch, đặc biệt với đường tiêm chủng không xâm lấn như nhỏ mắt, mũi.

4. Mở rộng đánh giá hiệu quả vaccine:

   • Thực hiện các thử nghiệm bảo hộ trên gia cầm với virus cúm A/H5N1 để đánh giá khả năng bảo vệ thực tế.
   • Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch tế bào và thời gian duy trì miễn dịch để hoàn thiện hồ sơ vaccine.

Các giải pháp trên nên được triển khai trong vòng 1-2 năm tiếp theo, phối hợp giữa các viện nghiên cứu và cơ sở sản xuất vaccine để nhanh chóng ứng dụng vào thực tiễn phòng chống dịch cúm gia cầm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và phát triển vaccine:

   • Có thể ứng dụng quy trình biểu hiện và tinh chế protein tái tổ hợp để phát triển vaccine tái tổ hợp dưới đơn vị, giảm chi phí và tăng tính an toàn.

2. Chuyên gia vi sinh và công nghệ sinh học:

   • Tham khảo kỹ thuật biểu hiện gen, tối ưu điều kiện nuôi cấy và tinh chế protein trong hệ vi khuẩn E. coli, phục vụ các nghiên cứu protein tái tổ hợp khác.

3. Cơ quan quản lý thú y và dịch tễ:

   • Hiểu rõ cơ sở khoa học và tiềm năng ứng dụng vaccine tái tổ hợp trong phòng chống dịch cúm gia cầm, từ đó xây dựng chính sách và hướng dẫn sử dụng vaccine phù hợp.

4. Doanh nghiệp sản xuất vaccine và sinh phẩm y tế:

   • Áp dụng công nghệ biểu hiện protein tái tổ hợp để sản xuất vaccine mới, nâng cao hiệu quả và mở rộng thị trường vaccine phòng cúm gia cầm.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn E. coli BL21 làm vật chủ biểu hiện protein HA5-1?
   E. coli BL21 có đột biến giảm hoạt tính protease nội bào, giúp protein ngoại lai ít bị phân giải, đồng thời có gen mã hóa T7 RNA polymerase giúp tăng hiệu quả biểu hiện protein dưới promoter T7. Đây là chủng phổ biến và hiệu quả trong biểu hiện protein tái tổ hợp.

2. Protein TrxHA5-1 được biểu hiện dưới dạng tan hay không tan?
   Phần lớn protein TrxHA5-1 được biểu hiện dưới dạng không tan trong tế bào E. coli, điều này thuận lợi cho việc tinh chế và có thể tăng tính sinh miễn dịch khi sử dụng làm vaccine.

3. Làm thế nào để kiểm tra tính kháng nguyên của protein tái tổ hợp?
   Sử dụng kỹ thuật Western blot với kháng thể kháng HA5 thu được từ thỏ, protein tái tổ hợp được cố định trên màng PVDF và phát hiện sự kết hợp đặc hiệu với kháng thể qua phản ứng hiện màu.

4. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) đánh giá gì?
   Phản ứng HI đo hiệu giá kháng thể kháng HA trong huyết thanh, phản ánh khả năng kháng thể ngăn cản virus liên kết với hồng cầu, từ đó đánh giá hiệu quả đáp ứng miễn dịch của vaccine hoặc kháng nguyên.

5. Đường tiêm và đường nhỏ mắt, mũi có khác biệt gì về đáp ứng miễn dịch?
   Đường nhỏ mắt, mũi cho hiệu giá kháng thể duy trì cao hơn sau 5 tuần so với đường tiêm, cho thấy tiêm chủng không xâm lấn có thể kéo dài thời gian bảo vệ và giảm stress cho vật chủ.

Kết luận

• Protein tái tổ hợp TrxHA5-1 được biểu hiện thành công trong E. coli BL21 với kích thước khoảng 57,5 kDa, chủ yếu dưới dạng không tan.
• Điều kiện tối ưu biểu hiện là 30°C, nồng độ IPTG 0,5 mM và thời gian thu mẫu 4 giờ sau cảm ứng.
• Protein được tinh chế hiệu quả bằng phương pháp siêu âm và hòa tủa trong đệm urê 2 M, đảm bảo tính kháng nguyên qua Western blot.
• Protein tái tổ hợp kích thích sinh đáp ứng miễn dịch trên gà với hiệu giá kháng thể HI đạt tối đa 2,7 log2 khi tiêm và 2,2 log2 khi nhỏ mắt, mũi.
• Nghiên cứu mở hướng phát triển vaccine tái tổ hợp dưới đơn vị phòng cúm A/H5N1 cho gia cầm, cần tiếp tục tối ưu liều lượng và tá chất để nâng cao hiệu quả miễn dịch.

Hành động tiếp theo: Tiến hành thử nghiệm liều vaccine tối ưu và đánh giá bảo hộ trên gia cầm trong vòng 1-2 năm tới, đồng thời phát triển quy trình sản xuất quy mô lớn để ứng dụng thực tiễn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào biểu mô và cuối cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm (Hình 1.2: Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong nguyên sinh chất) và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme NA. Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới trung bình là khoảng 6 giờ. Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử và rơi vào quá trình chết theo chương trình làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ [35, 38]. Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các RNA vận chuyển phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA transcription).

Phức hợp protein – RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào [4]. Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase. Các sợi này không được Adenine hóa 8 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào. Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’-, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus (Hình 1.

Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus. Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi” tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác [25, 26].3 Cấu trúc, chức năng của HA và NA Hai protein HA và NA là các protein chính trên bề mặt capsid, đặc trưng cho bản chất của từng chủng virus cúm A [21, 25].

Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA, được coi là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay [6, 17, 21, 24]. Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai dưới đơn vị HA1 (36 9 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] kDa) và HA2 (27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các đơn phân sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa và gắn vào mặt ngoài capsid là dưới đơn vị HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA1 chứa đựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích [6, 36]. Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm.

Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa sialic acid của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau [36, 38]. Vị trí amino acid 226 (aa226) của dưới đơn vị HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó. Ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này là Glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật chủ tự nhiên của virus cúm A). Protein NA (neuraminidase) Protein neuraminidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.18), là một enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân type NA [3, 36].

Protein NA có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ, và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào. Mặt khác, NA tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình cởi áo giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn [36]. Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát 10 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] khỏi các chất ức chế không đặc hiệu. Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ.

Do đó, NA là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế virus không đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzyme này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ thể [8]. Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA [12]. Như vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích chủ yếu của cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A và là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [31, 42].4 Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A Do kháng nguyên HA và NA của virus thường xuyên biến đổi mà bệnh cúm rất khó kiểm soát. Có hai phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A [42].

Hiện tượng lệch kháng nguyên Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra các phân đoạn gen/hệ gen của virus do virus cúm A không có cơ chế “đọc và sửa bản sao - proof reading” trong quá trình phiên mã và sao chép ở nhân tế bào đích. Sự thiếu hụt enzyme sửa chữa RNA dẫn đến các enzyme sao chép phụ thuộc RNA sẽ có thể “gài” thêm [1], làm mất đi hoặc thay thế một hay nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong phân tử RNA chuỗi đơn mới của virus [25]. Tuỳ thuộc vị trí xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa mà có thể trực tiếp làm thay đổi các amino acid trong trình tự của protein được mã hóa biểu hiện, dẫn đến thay đổi thuộc tính của protein. Các đột biến này được tích lũy qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một phân type virus mới có những đặc tính kháng nguyên mới có thể bị sai lệch.

11 TIEU LUAN MOI download : [e-mail] Hiện tượng trộn kháng nguyên Hiện tượng trộn kháng nguyên (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) giữa các gen kháng nguyên của virus cúm với gen khác ở một số rất ít virus RNA gây bệnh gia cầm khác, cho phép virus có khả năng biến chủng rất cao. Hệ gen gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt của virus cúm A được 2 chủng virus cúm A khác nhau khi đồng nhiễm trong một tế bào trao đổi cho nhau. Trong quá trình kết hợp lại RNA hệ gen có thể xảy ra sự hoà trộn hoặc trao đổi các phân đoạn gen của hai chủng virus đó tạo ra các trạng thái khác nhau của RNA hệ gen của các hạt virus mới từ hai RNA hệ gen của những virus ban đầu. Kết quả là đã tạo ra thế hệ virus mới có các phân đoạn gen kết hợp và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh [9, 16, 23].5 Vaccine phòng cúm A/H5N1 Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch [32].

Đối với dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người [17, 29]. Kháng thể đặc hiệu được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine và chủ yếu là các kháng thể kháng HA, NA, MA góp phần vô hiệu hóa virus cúm khi chúng xâm nhập vào cơ thể. Kháng thể kháng HA có vai trò tiên quyết trong việc tạo miễn dịch bảo hộ cho vật chủ bị nhiễm. Hiện nay có 3 loại vaccine được bán và sử dụng rộng rãi tại Việt Nam là: - Vaccine vô hoạt nhũ dầu H5N2 (Trung Quốc): được tạo ra bằng cách vô hoạt virus A/Turkey/England/N-28/73 (H5N2).

Đây là loại vaccine dị chủng (là vaccine sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng có kháng nguyên NA dị chủng) .