Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phương pháp gộp mẫu lớn ứng dụng trong sàng lọc covid 19 bằng realtime pcr

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phương pháp gộp mẫu lớn ứng dụng trong sàng lọc Covid-19 bằng realtime PCR, mang lại hiệu quả cao trong xét nghiệm.

• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Phú Hùng
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Luận Văn Thạc Sĩ Nghiên Cứu Phương Pháp Gộp Mẫu Lớn Ứng Dụng Trong Sàng Lọc COVID-19 Bằng Realtime PCR
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 0.2. Nội dung nghiên cứu
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Đặc điểm của virus SARS-CoV-2
• 1.2. Đặc điểm genome của virus SARS-CoV-2
• 1.3. Phương thức xâm nhập và gây bệnh
• 1.4. Biến đổi di truyền của virus SARS-CoV-2
• 1.5. Tổng quan tình hình dịch bệnh virus SARS-CoV-2 trong nước và thế giới
• 1.5.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới
• 1.5.2. Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam
• 1.6. Tổng quan về các phương pháp xét nghiệm SARS-CoV-2
• 1.6.1. Các phương pháp chẩn đoán virus SARS-CoV-2
• 1.6.2. Kit chuẩn đoán virus SARS-CoV-2
• 1.6.3. Tổng quan về đánh giá chất lượng sinh phẩm kit chẩn đoán
• 1.7. Tình hình nghiên cứu về các phương pháp xét nghiệm trong sàng lọc COVID-19
• 1.7.1. Hướng dẫn lấy mẫu, gộp mẫu và xét nghiệm của Bộ y tế
• 1.7.2. Các nghiên cứu về phương pháp gộp mẫu trên thế giới
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
• 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu lâm sàng
• 2.3.2. Phương pháp tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm bằng bộ sinh phẩm QIAamp Viral RNA Mini Kit
• 2.3.3. Phản ứng Realtime RT-PCR
• 2.3.4. Xây dựng quy trình gộp mẫu và đánh giá quy trình gộp mẫu
• 2.3.5. Xác định độ nhạy lâm sàng, độ đặc hiệu lâm sàng, LOD
• 2.3.6. Phương pháp tiến hành thử nghiệm thực tế
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thu nhận các mẫu bệnh phẩm
• 3.1.1. Mẫu bệnh phẩm dương tính với SARS-CoV-2
• 3.1.2. Mẫu chứng âm
• 3.2. Nghiên cứu xây dựng phương pháp gộp mẫu lớn trong sàng lọc COVID-19
• 3.2.1. Phân tích độ nhạy lâm sàng của quy trình gộp mẫu
• 3.2.2. Phân tích độ đặc hiệu lâm sàng của quy trình gộp mẫu thông qua làm giàu mẫu
• 3.2.3. Phân tích độ lặp lại và tái lặp của quy trình gộp mẫu
• 3.2.4. Ngưỡng phát hiện của quy trình gộp mẫu
• 3.2.5. Đánh giá sự thay đổi trong chi phí và công xuất xét nghiệm
• 3.3. Xây dựng quy trình thực hiện phương pháp gộp mẫu lớn trong sàng lọc COVID-19
• 3.3.1. Quy trình thực hiện
• 3.3.2. Sơ đồ hướng dẫn thực hiện
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu

Bài viết này tập trung vào việc nghiên cứu phương pháp gộp mẫu lớn trong sàng lọc COVID-19 bằng Realtime PCR. Mục tiêu chính là thiết lập quy trình gộp mẫu lớn, đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao, nhằm nâng cao hiệu quả trong việc phát hiện virus SARS-CoV-2. Việc gộp mẫu lớn không chỉ giúp giảm chi phí xét nghiệm mà còn tăng cường khả năng phát hiện nhanh chóng trong bối cảnh dịch bệnh diễn biến phức tạp.

1.1 Tầm quan trọng của nghiên cứu

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong bối cảnh đại dịch COVID-19, khi mà việc xét nghiệm và phát hiện sớm là rất cần thiết để kiểm soát dịch bệnh. Việc áp dụng kỹ thuật gộp mẫu sẽ giúp tiết kiệm thời gian và nguồn lực, đồng thời tăng cường khả năng phát hiện sớm các ca nhiễm. Theo WHO, việc giám sát và xét nghiệm rộng rãi là rất cần thiết để ngăn chặn sự lây lan của virus.

II. Tổng quan về virus SARS CoV 2

Virus SARS-CoV-2 là nguyên nhân gây ra đại dịch COVID-19, có khả năng lây lan nhanh chóng và gây ra các triệu chứng nghiêm trọng. Đặc điểm genome của virus này cho thấy nó thuộc họ coronavirus, có cấu trúc RNA sợi đơn. Việc hiểu rõ về đặc điểm virus là cần thiết để phát triển các phương pháp xét nghiệm hiệu quả.

2.1 Đặc điểm di truyền của virus

SARS-CoV-2 có genome dài khoảng 30 kb và chứa nhiều gene mã hóa cho các protein cấu trúc quan trọng như protein spike (S), protein màng (M), protein nucleocapsid (N) và protein vỏ (E). Những đột biến trong genome, đặc biệt là đột biến D614G, đã làm tăng khả năng lây lan của virus. Việc theo dõi các biến đổi di truyền này rất quan trọng để cải thiện các phương pháp chẩn đoán và phát triển vaccine.

III. Phương pháp gộp mẫu lớn trong xét nghiệm

Phương pháp gộp mẫu lớn cho phép kết hợp nhiều mẫu bệnh phẩm trong một xét nghiệm PCR, từ đó giảm thiểu chi phí và thời gian thực hiện. Tuy nhiên, cần đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này để tránh kết quả âm tính giả. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc gộp mẫu từ 10 đến 30 mẫu có thể dẫn đến giảm độ nhạy, do đó cần phải có các phương pháp tối ưu hóa phù hợp.

3.1 Quy trình thực hiện

Quy trình gộp mẫu lớn bao gồm việc thu thập và bảo quản mẫu, tách chiết RNA từ bệnh phẩm, và thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR. Các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng việc tối ưu hóa quy trình này có thể nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm, từ đó cải thiện khả năng phát hiện SARS-CoV-2 trong cộng đồng.

IV. Kết quả nghiên cứu

Nghiên cứu đã thu thập và phân tích các mẫu bệnh phẩm để đánh giá hiệu quả của phương pháp gộp mẫu lớn. Kết quả cho thấy quy trình gộp mẫu lớn có thể đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao, đồng thời giảm chi phí và thời gian xét nghiệm. Việc áp dụng quy trình này vào thực tế sẽ giúp nâng cao khả năng sàng lọc COVID-19 tại các cơ sở y tế.

4.1 Đánh giá hiệu quả gộp mẫu

Phân tích kết quả cho thấy rằng quy trình gộp mẫu lớn có thể phát hiện virus SARS-CoV-2 với độ nhạy lên tới 95%. Điều này cho thấy rằng phương pháp này không chỉ khả thi mà còn rất hiệu quả trong việc sàng lọc COVID-19, góp phần quan trọng trong công tác phòng chống dịch bệnh.

V. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã thành công trong việc thiết lập quy trình gộp mẫu lớn ứng dụng trong sàng lọc COVID-19 bằng Realtime PCR. Việc áp dụng phương pháp này sẽ giúp nâng cao hiệu quả xét nghiệm và giảm thiểu gánh nặng cho hệ thống y tế. Cần tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện quy trình để đảm bảo chất lượng và độ tin cậy của các xét nghiệm trong bối cảnh dịch bệnh vẫn đang diễn biến phức tạp.

5.1 Kiến nghị

Đề xuất các cơ sở y tế áp dụng quy trình gộp mẫu lớn trong sàng lọc COVID-19, đồng thời tiếp tục nghiên cứu để cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp. Cần có sự hợp tác giữa các nhà nghiên cứu và cơ quan y tế để đảm bảo hiệu quả trong công tác phòng chống dịch.

Nội dung chính

## Tổng quan nghiên cứu

Đại dịch COVID-19 do virus SARS-CoV-2 gây ra đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng và kinh tế toàn cầu với hơn 640 triệu người nhiễm và gần 7 triệu người tử vong trên thế giới. Tại Việt Nam, dịch bệnh cũng gây ra hậu quả nặng nề với hơn 40 nghìn người chết và hàng triệu ca nhiễm. Việc tầm soát, phát hiện sớm các ca nhiễm SARS-CoV-2 đóng vai trò then chốt trong kiểm soát dịch bệnh, đặc biệt trong bối cảnh xuất hiện nhiều biến chủng mới có khả năng lây lan nhanh và kháng vaccine. 

Phương pháp xét nghiệm Realtime PCR được xem là tiêu chuẩn vàng trong phát hiện virus SARS-CoV-2 nhờ độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, chi phí và thời gian xét nghiệm trên diện rộng vẫn là thách thức lớn đối với hệ thống y tế, đặc biệt khi cần xét nghiệm hàng loạt mẫu bệnh phẩm. Phương pháp gộp mẫu lớn (từ vài chục đến hàng trăm mẫu) trong xét nghiệm Realtime PCR được nghiên cứu nhằm nâng cao công suất xét nghiệm, giảm chi phí và thời gian, đồng thời vẫn đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

Mục tiêu nghiên cứu là thiết lập quy trình gộp mẫu lớn ứng dụng trong sàng lọc COVID-19 bằng Realtime PCR, đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu cao, nâng cao hiệu suất xét nghiệm, giảm chi phí và thời gian xét nghiệm trên quy mô lớn. Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 2/2021 đến tháng 6/2022 tại Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên và các bệnh viện Trung ương Thái Nguyên.

## Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

### Khung lý thuyết áp dụng

- **Virus SARS-CoV-2 và đặc điểm genome**: Virus có genome RNA sợi đơn dài khoảng 30 kb, gồm các gene mã hóa protein cấu trúc như gene S (spike), M (màng), N (nucleocapsid), E (vỏ). Đột biến trên gene S như D614G làm tăng khả năng lây nhiễm và ảnh hưởng đến hiệu quả chẩn đoán.
- **Phương pháp Realtime RT-PCR**: Kỹ thuật phát hiện RNA virus dựa trên phản ứng khuếch đại gen mục tiêu với độ nhạy cao, sử dụng mồi và probe đặc hiệu cho gene E và RdRp.
- **Phương pháp gộp mẫu trong xét nghiệm**: Gộp mẫu giúp tăng công suất xét nghiệm, tiết kiệm chi phí, nhưng cần đảm bảo không làm giảm độ nhạy và độ đặc hiệu. Các hình thức gộp mẫu gồm gộp dung dịch mẫu và gộp que mẫu ngay khi lấy mẫu.

### Phương pháp nghiên cứu

- **Nguồn dữ liệu**: Thu thập 100 mẫu bệnh phẩm dương tính và 12.000 mẫu âm tính với SARS-CoV-2 từ các bệnh viện tại Thái Nguyên, cùng các mẫu chứng dương tổng hợp và chứng âm chuẩn.
- **Phương pháp phân tích**: Tách chiết RNA bằng bộ kit QIAamp Viral RNA Mini Kit, thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR với mồi và probe theo khuyến cáo của WHO, tập trung vào gene E. Xây dựng quy trình gộp mẫu lớn (gộp 100 mẫu) với kỹ thuật làm giàu mẫu trước khi xét nghiệm.
- **Timeline nghiên cứu**: Từ tháng 2/2021 đến tháng 6/2022, gồm các bước thu thập mẫu, xây dựng quy trình gộp mẫu, đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện (LOD), độ lặp lại và tái lặp, cũng như đánh giá chi phí và công suất xét nghiệm.

## Kết quả nghiên cứu và thảo luận

### Những phát hiện chính

- **Độ nhạy lâm sàng của quy trình gộp mẫu lớn**: Tất cả 58 mẫu dương tính được xác định bằng phương pháp chuẩn đều được phát hiện chính xác bằng quy trình gộp mẫu 100, đạt độ nhạy 100%. Giá trị Ct trung bình của mẫu gộp là 6,7 ± 2,4, thấp hơn đáng kể so với Ct trung bình 23 ± 4,7 của phương pháp chuẩn (P < 0,0001).
- **Độ đặc hiệu lâm sàng**: Đánh giá trên 2400 mẫu âm tính gộp 5 mẫu, quy trình gộp mẫu duy trì độ đặc hiệu cao, không phát hiện dương tính giả.
- **Giới hạn phát hiện (LOD)**: Quy trình gộp mẫu lớn có LOD95 tương đương hoặc tốt hơn so với phương pháp đơn mẫu, đảm bảo phát hiện virus ở nồng độ thấp.
- **Độ lặp lại và tái lặp**: Kết quả xét nghiệm lặp lại trên các mẫu dương tính cho thấy độ ổn định và tái lặp cao, đảm bảo tính tin cậy của quy trình.
- **Giảm chi phí và tăng công suất**: So với xét nghiệm mẫu đơn, quy trình gộp mẫu lớn giảm chi phí xét nghiệm khoảng 70-80% và tăng công suất xét nghiệm lên gấp nhiều lần, phù hợp với tầm soát diện rộng.

### Thảo luận kết quả

Việc áp dụng kỹ thuật làm giàu mẫu trong quy trình gộp mẫu lớn giúp tăng tín hiệu PCR, giảm giá trị Ct, từ đó nâng cao độ nhạy xét nghiệm so với các phương pháp gộp mẫu truyền thống (gộp 5-10 mẫu). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu quốc tế cho thấy gộp mẫu lớn có thể thực hiện được mà không làm giảm độ nhạy nếu có kỹ thuật tối ưu. 

Độ đặc hiệu cao và độ lặp lại ổn định chứng tỏ quy trình phù hợp để áp dụng trong thực tế, đặc biệt trong bối cảnh cần xét nghiệm diện rộng với nguồn lực hạn chế. Việc giảm chi phí xét nghiệm góp phần giảm gánh nặng ngân sách y tế và tăng khả năng giám sát dịch bệnh hiệu quả hơn.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh giá trị Ct giữa phương pháp chuẩn và gộp mẫu, bảng thống kê độ nhạy, độ đặc hiệu và chi phí xét nghiệm để minh họa rõ ràng hiệu quả của quy trình.

## Đề xuất và khuyến nghị

- **Triển khai quy trình gộp mẫu lớn tại các trung tâm xét nghiệm** nhằm nâng cao công suất xét nghiệm, đặc biệt trong các đợt bùng phát dịch, với mục tiêu giảm thời gian xét nghiệm xuống dưới 24 giờ.
- **Đào tạo nhân viên kỹ thuật về kỹ thuật làm giàu mẫu và quy trình gộp mẫu** để đảm bảo độ chính xác và hiệu quả xét nghiệm, thực hiện trong vòng 3 tháng đầu triển khai.
- **Xây dựng hệ thống quản lý mẫu và dữ liệu điện tử** để theo dõi và quản lý mẫu gộp, đảm bảo truy xuất nguồn gốc và kết quả nhanh chóng, áp dụng trong 6 tháng tới.
- **Tăng cường hợp tác giữa các bệnh viện và phòng xét nghiệm** để chia sẻ nguồn lực, vật tư và kinh nghiệm, nâng cao năng lực xét nghiệm toàn quốc.
- **Khuyến nghị Bộ Y tế và các cơ quan liên quan cập nhật hướng dẫn kỹ thuật gộp mẫu lớn** trong xét nghiệm SARS-CoV-2, làm cơ sở pháp lý cho việc áp dụng rộng rãi.

## Đối tượng nên tham khảo luận văn

- **Các nhà quản lý y tế và chính sách**: Để xây dựng chiến lược xét nghiệm diện rộng, tối ưu nguồn lực và giảm chi phí trong phòng chống dịch COVID-19.
- **Phòng xét nghiệm và kỹ thuật viên sinh học phân tử**: Áp dụng quy trình gộp mẫu lớn, nâng cao hiệu quả xét nghiệm, giảm tải công việc và tăng độ chính xác.
- **Các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học và y học phân tử**: Tham khảo phương pháp làm giàu mẫu và kỹ thuật gộp mẫu lớn để phát triển các nghiên cứu tiếp theo.
- **Các tổ chức quốc tế và cơ quan y tế công cộng**: Áp dụng mô hình gộp mẫu lớn trong các chương trình giám sát dịch bệnh tại các khu vực có nguồn lực hạn chế.

## Câu hỏi thường gặp

1. **Phương pháp gộp mẫu lớn có làm giảm độ nhạy xét nghiệm không?**  
   Quy trình gộp mẫu lớn kết hợp kỹ thuật làm giàu mẫu đã chứng minh độ nhạy đạt 100%, thậm chí giá trị Ct thấp hơn so với phương pháp đơn mẫu, đảm bảo phát hiện chính xác các mẫu dương tính.

2. **Gộp mẫu lớn có phù hợp với tất cả các đối tượng xét nghiệm không?**  
   Phương pháp này phù hợp với nhóm nguy cơ thấp, không có triệu chứng hoặc không tiếp xúc gần với F0. Không khuyến cáo áp dụng cho bệnh nhân có triệu chứng hoặc đang điều trị COVID-19.

3. **Chi phí xét nghiệm giảm bao nhiêu khi áp dụng gộp mẫu lớn?**  
   Nghiên cứu cho thấy chi phí xét nghiệm giảm khoảng 70-80% so với xét nghiệm mẫu đơn, giúp tiết kiệm ngân sách đáng kể cho hệ thống y tế.

4. **Thời gian thực hiện xét nghiệm gộp mẫu lớn có lâu hơn không?**  
   Nhờ tăng công suất và kỹ thuật làm giàu mẫu, thời gian xét nghiệm không những không tăng mà còn có thể giảm, giúp rút ngắn thời gian truy vết và kiểm soát dịch bệnh.

5. **Quy trình gộp mẫu lớn có thể áp dụng cho các loại virus khác không?**  
   Về nguyên tắc, kỹ thuật gộp mẫu và làm giàu mẫu có thể được điều chỉnh để áp dụng cho các virus RNA khác, tuy nhiên cần nghiên cứu và đánh giá riêng biệt cho từng loại virus.

## Kết luận

- Đã thiết lập thành công quy trình gộp mẫu lớn (100 mẫu) ứng dụng trong sàng lọc COVID-19 bằng Realtime PCR với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.  
- Kỹ thuật làm giàu mẫu giúp giảm giá trị Ct, nâng cao độ nhạy so với phương pháp xét nghiệm đơn mẫu.  
- Quy trình giúp giảm chi phí xét nghiệm khoảng 70-80% và tăng công suất xét nghiệm, phù hợp với tầm soát diện rộng.  
- Đề xuất triển khai rộng rãi quy trình tại các phòng xét nghiệm và cập nhật hướng dẫn kỹ thuật từ cơ quan y tế.  
- Các bước tiếp theo bao gồm đào tạo nhân viên, xây dựng hệ thống quản lý mẫu và mở rộng nghiên cứu ứng dụng cho các loại virus khác.

**Hành động ngay hôm nay để nâng cao hiệu quả xét nghiệm COVID-19 và góp phần kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn!**

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đặc điểm của virus SARS-CoV-2 1. Đặc điểm genome của virus SARS-CoV-2 SAR-CoV-2 là một trong 7 chủng coronavirus được phát hiện là có khả năng gây bệnh ở động vật có vú.

Ở người, coronavirus gây nhiễm trùng nhẹ đường hô hấp nhưng cũng gây tử vong nếu người mắc đã có sẵn các bệnh lý nền. Giống như các chủng coronavirus khác, SARS-CoV-2 có hình cầu với các protein hình gai nhọn trên bề mặt. Những gai protein này giúp SARS-CoV-2 liên kết với thụ thể trên màng tế bào chủ của người, sau đó biến đổi cấu trúc cho phép quá trình dung hợp màng tế bào virus với màng tế bào người. Virus SARS-CoV-2 cũng như các virus khác trong họ corona có vật chất di truyền là RNA sợi đơn (single-strand ribonucleic acid), kích thước bộ gene khoảng 30 kb [32].

Khi so sánh với các chủng corona đã từng gây nên các bệnh trên người như chủng SARS-CoV 2003 (gây ra Hội chứng suy hô hấp cấp tính nặng năm 2003) hay chủng virus MERS-CoV (gây ra hội chứng hô hấp vùng Trung Đông năm 2012), chủng virus mới này có trình tự tương đồng lên đến 79,5%; tuy nhiên SARS-CoV-2 vẫn có những đặc điểm riêng biệt về mặt di truyền [7]. SARS-CoV-2 và SARS-CoV cùng thuộc họ Coronavirus thế hệ B (Betacoronavirus Lineage B, Sarbecovirus) [14]. Vì vậy, trình tự hệ gene của chúng có nhiều điểm tương đồng và gồm 4 gene chính mã hóa cho 4 protein cấu trúc được liệt kê dưới đây: - Gene S: Mã hóa cho protein spike (S) tạo thành các gai đặc trưng trong cấu trúc vỏ của coronavirus có hình "vương miện". Các protein này có thể bị glycosyl hóa mạnh tạo thành dạng homotrimer, một thụ thể giúp virus gắn vào màng tế bào vật chủ.

Các thành phần của protein S là kháng nguyên chính kích thích kháng thể trung hòa, đồng thời đây cũng là một mục tiêu quan trọng của tế bào lympho gây độc tế bào. 5 - Gene M: Mã hóa cho protein M là protein màng (M - Membrane) chiếm số lượng nhiều nhất trong số 4 protein cấu trúc. Protein M thường tồn tại ở dạng dimer, chúng tạo thành cấu trúc hình cầu đặc trưng của họ coronavirus [22]. - Gene N: Mã hóa cho protein nucleocapsid liên kết với bộ gene RNA để tạo thành nucleocapsid.

Nó có thể tham gia vào quá trình điều hòa tổng hợp RNA của virus và có thể tương tác với protein M trong quá trình nảy chồi của virus. - Gene E: Gene E có trình tự nucleotide ngắn mã hóa cho protein vỏ (E - Envelope). Chức năng của protein này hiện vẫn chưa được phát hiện, mặc dù ở virus SARS-CoV, protein E cùng với M và N là cần thiết để lắp ráp và giải phóng virus [38]. Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng, coronavirus tái tổ hợp bị thiếu gene E thường không tồn tại được dù chúng có mặt trong vật chủ [23].

Bản đồ phân bố các gene trong genome của virus SARS-CoV-2 (Trình tự tham chiếu NCBI: NC_045512. Phương thức xâm nhập và gây bệnh SARS-CoV-2 có thể truyền từ người sang người thông qua các giọt bắn trong quá trình tiếp xúc [31]. Vòng đời của SARS-CoV-2 giống như hầu hết các chủng virus corona đã được phát hiện bao gồm 5 bước: Gắn vào vật chủ, Xâm nhập, Sinh tổng hợp, Lắp ráp, Giải phóng (Hình 1. Quá trình xâm nhập và giải phóng SARS-CoV-2 khỏi tế bào chủ (https://neurosciencenews.com/coronavirus-genetic-mapping-16130/) Sau khi truyền sang vật chủ mới, các protein gai của SARS-CoV-2 gồm hai tiểu phần S1 và S2 thực hiện nhiệm vụ: tiểu phần S1 bám vào thụ thể ACE2 trên màng tế bào chủ và tiểu phần S2 dung hợp màng virus với màng tế bào người.

Cấu trúc vỏ của SARS-CoV-2 thay đổi cho phép giải phóng RNA virus vào tế bào chất của tế bào người. Hệ gene của SARS-CoV-2 là RNA sợi đơn nên được sử dụng trực tiếp làm khuôn tổng hợp các protein cấu trúc tạo nên phức hệ phiên mã. Từ đó, quá trình tổng hợp mRNA virus được diễn ra theo phương thức không liên tục nhằm tạo ra tất cả các protein cấu trúc của SARS-CoV- 2 (protein gai S, protein vỏ E, protein màng M, protein nucleocapsid N). Các protein này di chuyển tới mạng lưới nội chất để lắp ráp và được đóng gói thành virion hoàn chỉnh ở bộ máy Golgi đồng thời giải phóng khỏi tế bào chủ nhờ các túi tiết [3].

7 Ở người, các tế bào biểu bì phổi có mức độ biểu hiện thụ thể ACE2 cao, đây là lí do vì sao SARS-CoV-2 có thể dễ dàng xâm nhập và phá hủy các tế bào này, gây nên chứng viêm phổi cấp [16]. Bên cạnh đó, trong quá trình lắp ráp, nhiều trường hợp các hạt virion thiếu protein S dẫn đến tình trạng các virion này không gắn vào thụ thể ACE2. Vì vậy, hệ thống miễn dịch không nhận diện được kháng nguyên dẫn tới sự hình thành các tế bào đa nhân khổng lồ. Các tế bào này chứa một lượng lớn virus và tồn tại trong cơ thể người mà không bị hệ thống miễn dịch phát hiện và tiêu diệt [29].

Các triệu chứng của bệnh viêm phổi cấp COVID-19 được báo cáo bao gồm: 90% trường hợp mắc bệnh có biểu hiện sốt, 80% trường hợp có biểu hiện mệt mỏi và ho khan, 20% bị khó thở và suy hô hấp chiếm 15%, những trường hợp nặng có thể dẫn đến tử vong chiếm 5% tổng số ca nhiễm. Các triệu chứng của bệnh sẽ bắt đầu trung bình sau khoảng từ 2 đến 14 ngày tính từ thời điểm nhiễm virus. Một thực tế đó là hầu hết bệnh nhân COVID-19 là những người lớn tuổi và có bệnh lí nền, có 2 lí do được đưa ra để giải thích cho hiện tượng này. Thứ nhất, mức độ biểu hiện thụ thể ACE2 là khác nhau giữa người trưởng thành và trẻ em.

Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng, ACE2 được biểu hiện theo cụm ở các tế bào biểu bì biệt hóa cao. Sau khi phân chia, các tế bào biểu mô ở phổi tiếp tục phát triển. Thứ hai, các đáp ứng của cơ thể trẻ nhỏ đối với SARS-CoV-2 khác biệt so với người trưởng thành. Ở người lớn tuổi, sự kích thích đối với kháng nguyên và tuyến ức dẫn tới sự phân bố của quần thể các tế bào T [30].

Điều này dẫn tới sự biểu hiện giảm của CD27 và CD28, hai phân tử có vai trò trong việc tăng cường tính nhạy cảm đối với tác nhân gây bệnh [24]. Biến đổi di truyền của virus SARS-CoV-2 Sử dụng tất cả dữ liệu giải trình tự sâu của toàn bộ genome của virus SARS-CoV-2 trên toàn thế giới (kho dữ liệu NCBI), Naveen Vankadari đã xác định được hàng trăm đột biến điểm hoặc các đa hình đơn nucleotide trong 8 genome của virus SARS-CoV-2 [27]. Đây có thể là nguyên nhân dẫn tới sự thay đổi liên tục về khả năng lây nhiễm cũng như độc lực và làm gia tăng tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong bởi SARS-CoV-2. Từ dữ liệu về genome virus SARS- CoV-2 phân lập từ 12 quốc gia khác nhau, nhóm nghiên cứu đã chỉ ra rằng, trong số hàng trăm biến đổi di truyền có thể có tới 47 đột biến có ảnh hưởng tới độc lực cũng như khả năng đáp ứng các thuốc điều trị kháng virus sử dụng trong điều trị Covid-19.

Đặc biệt chú ý, gene mã hóa cho protein gai của virus (spike glycoprotein) hay còn gọi là protein S tăng đột biến. Cùng với đó các gene Nsp1, RdRp và vùng ORF8 đã bị biến đổi nặng nề trong vòng 3 tháng, trong quá trình lây truyền từ người sang người. Mức độ đột biến được mô tả trong Hình 1. Biểu đồ phân bố số lượng đột biến trên genome của virus SARS- CoV-2 [27] Đặc biệt chú ý, đột biến D614G trên gene mã hóa cho protein S, đây là protein có chức năng giúp virus bám dính vào tế bào chủ (Hình 1.

Các nghiên cứu khác nhau đều chỉ ra rằng, đột biến này đang chiếm phổ biến ở các quốc gia hiện nay [2], [35]. Đột biến D614G và sự phân bổ về sự lưu hành của chủng G614 ở châu Âu theo thời gian [4] Đột biến tại vị trí 614 trên gen S đã làm thay đổi amino acid aspartic thành glycine. Biến đổi này đã giúp cho virus tương tác hiệu quả với thụ thể ACE2 của tế bào chủ và làm tăng khả năng lây nhiễm gấp nhiều lần so với chủng đầu tiên phân lập tại Vũ Hán. Thêm vào đó, bằng các chẩn đoán Realtime RT-PCR, các bệnh nhân mắc COVID-19 mang đột biến này đều cho thấy virus được phát hiện ở chu kỳ PCR sớm hơn [4].

Đột biến này giúp cho chủng G614 dần thay thế chủng D614 ở nhiều quốc gia khác nhau trên thế giới trong đó điển hình là tại Mỹ. Những thay đổi liên tục trên genome của virus SARS-CoV-2 đã và đang tạo ra thách thức nhất định đối với việc chẩn đoán bằng kỹ thuật Realtime PCR. Nếu những mẫu dò được thiết kế vào vùng gene có nhiều đột biến như gene ORF hoặc gene S, gene N đều có nguy cơ bỏ sót các đột biến 10 không bắt cặp với các mẫu dò hoặc trình tự mồi [12], [15]. Thêm vào đó, thay đổi trên các gene mã hóa kháng nguyên đặc trưng của virus cũng sẽ tạo ra những khó khăn nhất định cho việc nghiên cứu và sản xuất vacxin phòng bệnh Covid-19 [17], [10].

Nhưng thay đổi đồng loạt nhiều vị trí khác nhau trên gen S đã đưa đến một biến chủng mới siêu lây nhiễm và có nguy cơ kháng vaccine. Chủng này lần đầu tiên được phát hiện tại Nam Phi và tới nay đã lan sang nhiều quốc gia khác nhau trên toàn thế giới. Omicron đã là lỗi lo lắng của toàn thế giới. Biến đổi trên gen S mã hóa cho protein kháng nguyên Spike của chủng Omicron so với chủng Delta 1.

Tổng quan tình hình dịch bệnh virus SARS-CoV-2 trong nước và thế giới 1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới COVID-19 là bệnh viêm đường hô hấp gây ra bởi virus SARS-CoV-2, lần đầu tiên được xác định tại Vũ Hán, tỉnh Hồ Bắc, Trung Quốc vào cuối năm 2019. Ngay sau đó, ngày 30 tháng 1 năm 2020 WHO đã tuyên bố COVID-19 là một trường hợp khẩn cấp về sức khỏe cộng đồng và chính thức tuyên bố là một đại dịch vào giữa tháng 3 năm 2020. Giai đoạn đầu của dịch bệnh, Trung Quốc là tâm điểm của đại dịch sau đó dịch đã lan rộng sang châu Âu, châu Mỹ và các châu lục khác.

Đặc biệt, số trường hợp COVID-19 đã 11 tăng nhanh chóng tại Hoa Kỳ và đưa nước này trở thành vùng dịch lớn nhất thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, châu lục có tỉ lệ nhiễm và tử vong lớn nhất là châu Mỹ, chiếm 50% về tổng số ca mắc và số ca tử vong.