Luận văn thạc sĩ: Phân lập và thiết kế vector mang gen mã hóa NQO1 ở người

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus phân lập và thiết kế vector mang gen mã hóa nadph quinone oxidoreductase 1 nqo1 ở người, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất giải

• Tác giả: Nguyễn Thị Thanh Nga
• Người hướng dẫn: Ts. Nguyễn Đăng Tôn
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Phân lập và Thiết kế Vector mang gen mã hóa NAD(P)H: Quinone Oxidoreductase 1 ở người
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về gen NQO1
• 1.2. Cấu trúc gen NQO1
• 1.3. Sự điều hòa NQO1 bởi con đường Keap/Nrf2/ARE
• 1.4. Đa hình gen NQO1
• 1.5. Tổng quan về protein NQO1
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Phương pháp
• 2.1.1. Tách chiết RNA tổng số
• 2.1.2. Tổng hợp cDNA
• 2.1.3. Nhân đoạn cDNA bằng phản ứng PCR
• 2.1.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
• 2.1.5. Xử lý DNA bằng enzyme giới hạn
• 2.1.6. Tinh chế các đoạn DNA trên gel agarose
• 2.1.7. Ghép nối DNA
• 2.1.8. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt
• 2.1.9. Tách chiết DNA plasmid
• 2.1.10. Xác định trình tự DNA
• 2.1.11. Biểu hiện tạm thời DNA plasmid tái tổ hợp vào tế bào động vật
• 2.2. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tách chiết RNA tổng số
• 3.2. Tạo dòng và thiết kế vector biểu hiện gen NQO1
• 3.2.1. Thiết kế cặp mồi và PCR
• 3.2.2. Thiết kế vector tách dòng và biểu hiện pcDNA3
• 3.2.3. Tạo dòng đoạn cDNA mã hóa enzyme NQO1 trong vector pcDNA3
• 3.2.4. Biểu hiện tạm thời DNA plasmid tái tổ hợp trong tế bào động vật
• 3.2.4.1. Nuôi cấy ổn định cho tế bào HEK 293
• 3.2.4.2. Chuẩn bị vector pcDNA3.1-NQO1 cho chuyển gen
• 3.2.4.3. Biểu hiện nhanh NQO1 trong tế bào động vật
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu phân lập gen NQO1 ở người

Nghiên cứu về gen NQO1 (NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1) đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trong lĩnh vực di truyền học và sinh học phân tử. Gen này đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào khỏi các tác động độc hại của các hợp chất quinon. NQO1 không chỉ tham gia vào quá trình khử quinon mà còn có vai trò trong việc điều hòa các yếu tố sinh học khác. Việc phân lập và thiết kế vector mang gen NQO1 sẽ mở ra nhiều cơ hội nghiên cứu và ứng dụng trong điều trị bệnh lý liên quan đến stress oxi hóa.

1.1. Giới thiệu về gen NQO1 và vai trò của nó

Gen NQO1 mã hóa cho enzyme NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1, một flavoprotein có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào khỏi các tác động độc hại. Enzyme này xúc tác cho sự khử quinon, giúp giảm thiểu sự hình thành các gốc tự do và các hợp chất oxi hóa có hại. NQO1 được điều hòa bởi con đường Keap/Nrf2/ARE, cho thấy tầm quan trọng của nó trong việc duy trì sự cân bằng oxi hóa trong tế bào.

1.2. Tình hình nghiên cứu gen NQO1 hiện nay

Nghiên cứu về gen NQO1 đã được thực hiện rộng rãi trên thế giới, với nhiều phát hiện quan trọng liên quan đến vai trò của nó trong các bệnh lý như ung thư và bệnh tim mạch. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng đa hình gen NQO1 có thể ảnh hưởng đến nguy cơ mắc bệnh, đặc biệt là trong các quần thể có nồng độ dioxin cao. Việc phân lập gen NQO1 sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của nó và phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.

II. Thách thức trong nghiên cứu và phân lập gen NQO1

Mặc dù nghiên cứu về gen NQO1 đã đạt được nhiều thành tựu, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần vượt qua. Việc phân lập gen NQO1 từ các mẫu sinh học phức tạp như tế bào người đòi hỏi kỹ thuật cao và quy trình chuẩn hóa. Ngoài ra, sự biến đổi gen và đa hình gen NQO1 cũng tạo ra những khó khăn trong việc xác định vai trò chính xác của nó trong các bệnh lý.

2.1. Khó khăn trong việc tách chiết và phân lập gen

Quá trình tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA từ các mẫu tế bào có thể gặp khó khăn do sự hiện diện của các chất ức chế. Việc tối ưu hóa các điều kiện tách chiết là rất cần thiết để đảm bảo chất lượng RNA cao, từ đó nâng cao hiệu quả trong việc phân lập gen NQO1.

2.2. Đa hình gen NQO1 và ảnh hưởng đến nghiên cứu

Đa hình gen NQO1 có thể dẫn đến sự khác biệt trong hoạt tính enzyme giữa các cá thể. Điều này tạo ra thách thức trong việc nghiên cứu mối liên hệ giữa gen NQO1 và các bệnh lý, vì các biến thể gen có thể ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu. Cần có các phương pháp phân tích gen chính xác để đánh giá ảnh hưởng của đa hình gen đến sức khỏe con người.

III. Phương pháp phân lập và thiết kế vector mang gen NQO1

Để phân lập và thiết kế vector mang gen NQO1, nhiều phương pháp hiện đại đã được áp dụng. Các kỹ thuật như PCR, điện di DNA trên gel agarose, và biến nạp plasmid vào tế bào E. coli là những bước quan trọng trong quy trình này. Việc sử dụng các vector biểu hiện phù hợp sẽ giúp tối ưu hóa quá trình sản xuất protein NQO1 trong tế bào động vật.

3.1. Quy trình tách chiết và tổng hợp cDNA

Quy trình tách chiết RNA tổng số từ tế bào được thực hiện bằng cách sử dụng các bộ kit chuyên dụng. Sau đó, cDNA được tổng hợp từ RNA bằng phản ứng PCR, cho phép tạo ra các đoạn gen NQO1 cần thiết cho việc thiết kế vector. Việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng là rất quan trọng để đảm bảo hiệu suất cao.

3.2. Thiết kế vector biểu hiện mang gen NQO1

Vector biểu hiện pcDNA3.1B được sử dụng để mang gen NQO1. Quy trình thiết kế bao gồm việc ghép nối đoạn cDNA mã hóa enzyme NQO1 vào vector, sau đó biến nạp vào tế bào E. coli để nhân bản. Việc xác định trình tự DNA và kiểm tra tính chính xác của vector là bước quan trọng để đảm bảo tính hiệu quả trong việc biểu hiện protein NQO1.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu gen NQO1

Nghiên cứu về gen NQO1 không chỉ có giá trị trong lĩnh vực khoa học cơ bản mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học. Việc hiểu rõ về cơ chế hoạt động của NQO1 có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị mới cho các bệnh lý liên quan đến stress oxi hóa. Ngoài ra, việc phát hiện các đa hình gen NQO1 có thể được sử dụng trong y học cá thể hóa, giúp xác định nguy cơ mắc bệnh cho từng cá nhân.

4.1. Ứng dụng trong điều trị bệnh lý

Nghiên cứu về NQO1 có thể dẫn đến việc phát triển các liệu pháp điều trị mới cho các bệnh lý như ung thư và bệnh tim mạch. Việc tăng cường hoạt động của NQO1 có thể giúp bảo vệ tế bào khỏi các tác động độc hại, từ đó giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh.

4.2. Y học cá thể hóa và gen NQO1

Việc phát hiện các đa hình gen NQO1 có thể giúp xác định nguy cơ mắc bệnh cho từng cá nhân. Điều này mở ra cơ hội cho y học cá thể hóa, nơi mà các phương pháp điều trị được điều chỉnh dựa trên đặc điểm di truyền của từng bệnh nhân.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu gen NQO1

Nghiên cứu về gen NQO1 đã mở ra nhiều hướng đi mới trong lĩnh vực sinh học phân tử và y học. Việc phân lập và thiết kế vector mang gen NQO1 không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của enzyme này mà còn có thể dẫn đến những ứng dụng thực tiễn trong điều trị bệnh. Tương lai của nghiên cứu NQO1 hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho sức khỏe con người.

5.1. Tương lai của nghiên cứu NQO1

Nghiên cứu về NQO1 sẽ tiếp tục được mở rộng với nhiều phương pháp và công nghệ mới. Việc hiểu rõ hơn về vai trò của NQO1 trong các bệnh lý sẽ giúp phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn.

5.2. Định hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc xác định các yếu tố điều hòa hoạt động của NQO1 và mối liên hệ giữa đa hình gen NQO1 với các bệnh lý. Điều này sẽ giúp cung cấp thêm thông tin quý giá cho việc phát triển các phương pháp điều trị mới.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hợp chất quinon là nhóm chất trung gian độc hại phổ biến trong môi trường và thực phẩm, có khả năng phản ứng oxy hóa khử mạnh để tạo ra các gốc oxy hóa tự do gây tổn thương DNA và dẫn đến ung thư. Trong cơ thể người, enzyme NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1, viết tắt là NQO1, đóng vai trò then chốt trong hàng rào bảo vệ tế bào thông qua cơ chế khử hai điện tử trực tiếp để giải độc các dẫn xuất quinon. Khi hoạt tính của enzyme NQO1 bị suy giảm do các biến thể di truyền, nguy cơ nhiễm độc tủy xương do benzen có thể tăng cao gấp 7 lần so với người bình thường, đồng thời tỷ lệ xuất hiện các dạng đa hình gen này trong quần thể dao động từ 2% đến 5%.

Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết về việc làm rõ cơ chế bảo vệ tế bào và đánh giá biến đổi sinh học ở những đối tượng có nồng độ độc chất cao, đề tài tập trung giải quyết vấn đề phân lập đoạn gen mã hóa NQO1 và thiết lập hệ thống biểu hiện nhân chuẩn in vitro. Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu bao gồm: phân lập thành công đoạn cDNA dài 825 cặp base mã hóa toàn bộ chuỗi 274 axit amin của enzyme NQO1 từ tế bào gan người; thiết kế vector tái tổ hợp dựa trên khung đọc pcDNA3.1B his-myc; và biểu hiện tạm thời protein tái tổ hợp có hoạt tính trong dòng tế bào thận phôi người HEK293.

Nghiên cứu được triển khai trong giai đoạn 2013-2014 tại Viện Nghiên cứu hệ gen thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phối hợp cùng Khoa Sinh học thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. Ý nghĩa thực tiễn của công trình thể hiện qua việc xây dựng thành công nền tảng chuyển gen với hiệu suất biến nạp đạt xấp xỉ 100% trên tế bào động vật có vú, cung cấp mô hình thực nghiệm tiêu chuẩn phục vụ cho chương trình nghiên cứu quốc gia mã số KHCN-33.06/11-15 về đánh giá biến đổi gen ở người phơi nhiễm dioxin.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Cơ sở lý thuyết của nghiên cứu được xây dựng trên hai trục khoa học trọng tâm: con đường truyền tín hiệu cảm ứng Keap1/Nrf2/ARE và cơ chế gác cổng bảo vệ protein của proteasome 20S. Con đường Keap1/Nrf2/ARE chịu trách nhiệm kiểm soát mạng lưới hơn 100 gen bảo vệ tế bào chống lại stress oxy hóa. Vùng điều hòa trước của gen NQO1 chứa trình tự nhận biết ARE nằm tại vị trí -477 cặp base tính từ điểm khởi đầu phiên mã, cho phép tế bào gia tăng phiên mã mạnh mẽ khi tiếp xúc với các tác nhân ái điện tử.

Về cấu trúc di truyền, gen NQO1 ở người nằm trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể số 16 tại băng 16q22, có tổng kích thước xấp xỉ 20 kilobase bao gồm 6 đoạn exon xen kẽ bởi 5 đoạn intron. Trong đó, toàn bộ vùng mã hóa chức năng chỉ chiếm khoảng 4% tổng số nucleotide của gen, tương ứng đoạn phân tử 825 cặp base để dịch mã thành chuỗi 274 axit amin. Về mặt hóa sinh, NQO1 là một flavoprotein phụ thuộc cofactor FAD hoạt động ở dạng homodimer với hai tiểu phần đối xứng. Enzyme xúc tác phản ứng chuyển đồng thời 2 điện tử từ chất cho NADH hoặc NADPH sang quinon theo cơ chế ping-pong, ngăn ngừa triệt để sự tạo thành gốc trung gian semiquinone độc hại. Ngoài chức năng enzyme học, NQO1 còn liên kết trực tiếp để ổn định các phân tử ức chế khối u quan trọng như p53, p73alpha và p33 trước sự thoái biến độc lập với ubiquitin của phức hệ proteasome 20S.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn vật liệu sinh học chuẩn gồm dòng tế bào ung thư gan người JHH5 để tách chiết RNA tổng số và dòng tế bào biểu mô thận phôi người HEK293 để thử nghiệm biểu hiện gen. Cỡ mẫu thực nghiệm ban đầu được cố định ở mức 10 mũ 6 tế bào JHH5 nhằm bảo đảm thu đủ lượng RNA chất lượng cao phục vụ tổng hợp sợi đơn cDNA. Dòng tế bào ung thư gan JHH5 được lựa chọn theo phương pháp chọn mẫu có chủ đích vì gan là cơ quan giải độc chính của cơ thể và các dòng tế bào gan có mức độ biểu hiện tự nhiên của enzyme NQO1 rất phong phú.

Quy trình phân tích và thao tác gen được thực hiện qua các bước chuẩn hóa nghiêm ngặt. Đoạn cDNA NQO1 được nhân bản bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu có gắn vị trí cắt của hai enzyme giới hạn HindIII và XhoI. Đoạn gen sau khi tinh sạch từ gel agarose nồng độ 0,8% được ghép nối vào vector pcDNA3.1B his-myc có kích thước 5497 cặp base dưới tác dụng của enzyme T4 DNA ligase ở 16 độ C trong 3 giờ. Vector tái tổ hợp được biến nạp vào chủng vi khuẩn khả biến E. coli DH10beta bằng kỹ thuật sốc nhiệt ở 42 độ C trong đúng 70 giây. Trình tự chèn được giải mã chính xác bằng hệ thống máy đọc tự động ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer theo nguyên lý Sanger.

Để biểu hiện protein, mật độ 0,5 nhân 10 mũ 6 tế bào HEK293 trên mỗi đĩa đường kính 35 milimet được chuyển nạp phức hợp 4 microgram plasmid và 10 microlit Lipofectamine 2000 trong môi trường Opti-MEM. Sau 48 đến 72 giờ nuôi cấy tại 37 độ C với 5% CO2, dịch chiết protein tổng số được thu nhận và phân tích trên bản gel polyacrylamide biến tính SDS-PAGE nồng độ 12,5% nhằm kiểm tra sự xuất hiện của chuỗi polypeptide tái tổ hợp.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình tách chiết từ 10 mũ 6 tế bào gan JHH5 bằng phương pháp trizol đã thu được RNA tổng số có độ tinh sạch cao, thể hiện rõ hai băng 28S và 18S đặc trưng trên điện di gel agarose nồng độ 1% mà không xuất hiện dấu hiệu thoái hóa. Phản ứng RT-PCR nhân bản cDNA với cặp mồi chuyên biệt đã khuếch đại thành công một băng DNA duy nhất có độ dài chính xác 825 cặp base, hoàn toàn phù hợp với kích thước lý thuyết của vùng mã hóa gen NQO1.

Sau khi cắt và ghép nối định hướng vào vector pcDNA3.1B his-myc, plasmid tái tổ hợp pcDNA3.1B-NQO1 có tổng kích thước 6322 cặp base được chuyển nạp vào tế bào E. coli DH10beta. Kết quả kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn HindIII và XhoI giải phóng đúng hai phân mảnh kích thước 5497 cặp base của vector và 825 cặp base của đoạn gen chèn. Dữ liệu giải trình tự tự động trên máy ABI PRISM 3100 khẳng định trình tự nucleotide của dòng tạo dòng đạt độ tương đồng 100% so với trình tự chuẩn NM_000903.2 công bố trên cơ sở dữ liệu quốc tế GenBank, không phát sinh bất kỳ đột biến dịch mã hay sai lệch amino acid nào trong suốt 274 codon.

Tại hệ thống biểu hiện tế bào động vật HEK293, sau 48 đến 72 giờ biến nạp với Lipofectamine 2000, kỹ thuật điện di SDS-PAGE trên gel 12,5% đã phát hiện một băng protein biểu hiện vượt trội ở vùng khối lượng phân tử khoảng 35 kilodalton ở mẫu chuyển gen, trong khi mẫu đối chứng không mang plasmid tái tổ hợp không xuất hiện băng này. Khối lượng phân tử này hoàn toàn tương thích với chuỗi protein NQO1 tự nhiên (khoảng 31 kilodalton) khi được gắn thêm đoạn peptide kép myc epitope và đuôi 6xHis tag (khoảng 4 kilodalton) từ vector.

Thảo luận kết quả

Việc lựa chọn hệ thống biểu hiện trong tế bào động vật HEK293 thay vì vi khuẩn đơn bào E. coli là yếu tố quyết định sự thành công của đề tài. Enzyme NQO1 hoạt động sinh học bắt buộc phải trải qua quá trình gấp cuộn chuẩn xác để tạo cấu trúc bậc bốn homodimer gồm hai tiểu phần kết hợp với hai phân tử cofactor FAD. Hệ thống biểu hiện vi khuẩn thông thường thiếu các cơ chế biến đổi sau dịch mã và trợ giúp gấp cuộn đặc thù của sinh vật bậc cao, dễ dẫn đến hiện tượng protein tái tổ hợp bị bất hoạt hoặc kết cụm thành thể vùi khó thu hồi.

Dữ liệu định lượng và phân tích điện di có thể được trực quan hóa hiệu quả thông qua biểu đồ cột thể hiện mức độ gia tăng sinh khối protein qua các mốc thời gian 24, 48 và 72 giờ sau biến nạp, kết hợp cùng bảng ma trận đối chiếu độ tương đồng 100% của 825 nucleotide giữa sản phẩm tách dòng và chuỗi tham chiếu quốc tế. So sánh với các công bố quốc tế của Lars Ernster và các nhóm nghiên cứu cấu trúc tinh thể, protein NQO1 biểu hiện từ nghiên cứu này bảo tồn nguyên vẹn các gốc amino acid trọng yếu tại túi liên kết FAD như Leu-103, Gln-104 và Trp-105, cũng như vị trí tương tác cơ chất Tyr-128 và Phe-232. Thành công này tạo ra công cụ sinh học tiêu chuẩn để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tương tác trực tiếp giữa NQO1 và protein p53 trong điều kiện stress oxy hóa mô phỏng.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và chọn lọc dòng tế bào biểu hiện ổn định: Thiết lập phác đồ xử lý tế bào HEK293 sau biến nạp bằng kháng sinh Geneticin (G418) ở nồng độ duy trì 1 mM trong liên tục 15 ngày, nhằm tạo ra dòng tế bào ổn định đạt hiệu suất sản sinh protein NQO1 cao hơn ít nhất 40% so với biểu hiện tạm thời. Kế hoạch thực hiện trong vòng 6 tháng do nhóm nghiên cứu tế bào đảm nhiệm.

2. Chuẩn hóa công nghệ tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực kim loại: Ứng dụng cột sắc ký Ni-NTA liên kết với đuôi polyhistidine 6xHis ở đầu C để tách chiết và tinh chế enzyme NQO1 từ dịch tan tế bào, đặt mục tiêu đạt độ tinh khiết sản phẩm trên 95% và hiệu suất thu hồi đạt tối thiểu 10 miligram protein trên mỗi lít môi trường nuôi cấy. Kế hoạch triển khai trong thời gian 9 tháng do phòng thí nghiệm công nghệ protein phụ trách.

3. Thực hiện các thử nghiệm sàng lọc dược lý học và hóa sinh: Sử dụng chế phẩm enzyme NQO1 tái tổ hợp để đánh giá khả năng khử các hợp chất quinon ngoại sinh và sàng lọc các chất chống oxy hóa tự nhiên từ nguồn dược liệu Việt Nam, hướng tới cải thiện hoạt tính giải độc tế bào lên từ 2 đến 3 lần. Thời gian triển khai dự kiến trong 12 tháng tại các đơn vị nghiên cứu dược học.

4. Mở rộng nghiên cứu đột biến đa hình gen NQO1 trên quần thể phơi nhiễm: Khởi động dự án giải trình tự phát hiện đa hình c.609C>T (P187S) trên cỡ mẫu từ 200 đến 300 đối tượng sống tại các khu vực có nồng độ chất độc da cam/dioxin cao trong thời hạn 24 tháng, do Viện Nghiên cứu hệ gen chủ trì phối hợp với Bộ Tài nguyên và Môi trường.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Sinh học thực nghiệm và Công nghệ sinh học: Tài liệu cung cấp bản hướng dẫn chi tiết về kỹ thuật thiết kế primer, tối ưu hóa chu trình RT-PCR nhân bản gen người có kích thước 825 cặp base, và quy trình thao tác trên vector biểu hiện pcDNA3.1B his-myc phục vụ trực tiếp cho các đề tài tạo dòng phân tử.

• Các nhà khoa học trong lĩnh vực Độc chất học môi trường và Đột biến gen: Luận văn là cơ sở tham khảo giá trị về mối liên hệ giữa enzyme giải độc pha II với các chất chuyển hóa trung gian của benzen và dioxin, giúp xây dựng các mô hình đánh giá độc tính tế bào dựa trên con đường tín hiệu Keap1/Nrf2/ARE.

• Các nhóm nghiên cứu Sinh học ung thư và Y học phân tử: Tài liệu phân tích sâu vai trò của NQO1 trong việc ức chế sự phân hủy của protein ức chế khối u p53 tại proteasome 20S, mở ra hướng ứng dụng trong việc đánh giá nguy cơ ung thư vú, ung thư phổi và bệnh bạch cầu liên quan đến đa hình di truyền.

• Kỹ thuật viên phòng thí nghiệm và chuyên viên phát triển sinh phẩm: Tham khảo quy trình nuôi cấy dòng tế bào phôi thận người HEK293, phương pháp chuyển nạp gen bằng Lipofectamine 2000 đạt hiệu suất cao, và kỹ thuật điện di SDS-PAGE gel 12,5% để kiểm soát chất lượng protein tái tổ hợp.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nghiên cứu lại chọn hệ thống tế bào động vật HEK293 thay vì vi khuẩn E. coli để biểu hiện enzyme NQO1?
Enzyme NQO1 cần cấu hình không gian dạng homodimer với sự kết hợp chính xác của hai phân tử cofactor FAD để có hoạt tính sinh học. Tế bào động vật HEK293 cung cấp đầy đủ bộ máy hỗ trợ gấp cuộn protein và các biến đổi sau dịch mã đặc thù của động vật có vú, giúp protein biểu hiện hòa tan tốt và không bị tạo thể vùi như trong vi khuẩn E. coli.

Đa hình gen NQO1*2 tại vị trí c.609C>T gây ra những tác động sinh học tiêu cực nào?
Đột biến thay thế nucleotide đơn c.609C>T dẫn đến đổi axit amin proline thành serine tại vị trí 187 của chuỗi polypeptide. Protein tạo ra bị mất tính ổn định và nhanh chóng bị thoái biến bởi proteasome, khiến người mang kiểu gen đồng hợp tử đột biến có nguy cơ nhiễm độc tủy xương do benzen cao gấp 7 lần người mang kiểu gen bình thường.

Ý nghĩa của việc gắn đồng thời myc epitope và đuôi 6xHis tag vào đầu C của protein là gì?
Đoạn peptide gắn thêm có tổng khối lượng khoảng 4 kilodalton giúp dễ dàng phát hiện sự hiện diện của protein NQO1 thông qua kỹ thuật Western Blotting sử dụng kháng thể kháng myc. Đồng thời, đuôi 6xHis cho phép tinh sạch nhanh chóng protein tái tổ hợp đạt độ tinh khiết cao bằng phương pháp sắc ký ái lực cột niken.

Enzyme NQO1 đóng góp vào cơ chế chống oxy hóa của tế bào theo phương thức nào?
NQO1 xúc tác phản ứng khử 2 điện tử trực tiếp để biến đổi các phân tử quinon thành hydroquinone mà không tạo ra chất trung gian semiquinone. Điều này triệt tiêu nguy cơ hình thành các gốc oxy hóa hoạt tính ROS như superoxide hay gốc hydroxyl, bảo vệ cấu trúc màng lipid, protein và DNA của tế bào khỏi bị hủy hoại.

Kích thước của gen NQO1 hoàn chỉnh trong hệ gen người và đoạn cDNA được phân lập có sự khác biệt như thế nào?
Gen NQO1 tự nhiên trên nhiễm sắc thể số 16 có kích thước lớn khoảng 20 kilobase chứa 6 exon và 5 intron. Sau quá trình hoàn thiện bản phiên mã, đoạn cDNA phân lập được chỉ dài 825 cặp base, tương ứng với vùng mã hóa dịch mã thành 274 axit amin của chuỗi protein chức năng.

Kết luận

• Phân lập thành công đoạn cDNA toàn phần có kích thước chính xác 825 cặp base mã hóa cho enzyme NQO1 người từ dòng tế bào ung thư gan JHH5.
• Thiết kế và tạo dòng thành công vector biểu hiện tái tổ hợp pcDNA3.1B myc-his-NQO1 với tổng kích thước phân tử 6322 cặp base.
• Xác định trình tự đoạn gen chèn đạt độ tương đồng tuyệt đối 100% so với trình tự chuẩn NM_000903.2 trên ngân hàng gen quốc tế.
• Biểu hiện tạm thời thành công protein tái tổ hợp NQO1 có kích thước khoảng 35 kilodalton trong dòng tế bào phôi thận người HEK293.
• Cung cấp mô hình phân tử thực nghiệm đáng tin cậy phục vụ nghiên cứu biến đổi gen và độc chất học thuộc chương trình nghiên cứu khoa học quốc gia KHCN-33.

Công trình đã khẳng định tính khả thi và hiệu quả vượt trội của việc ứng dụng vector pcDNA3.1B his-myc kết hợp với dòng tế bào động vật HEK293 trong sản xuất protein tái tổ hợp ở người. Trong giai đoạn 6 đến 12 tháng tiếp theo, nhóm nghiên cứu dự kiến sẽ hoàn thiện quy trình chọn lọc dòng tế bào biểu hiện ổn định và tinh chế enzyme bằng sắc ký ái lực. Quý độc giả và các nhà khoa học quan tâm có thể tiếp tục kết nối, ứng dụng quy trình phân lập này nhằm mở rộng các nghiên cứu chuyên sâu về bệnh học phân tử và phát triển sinh phẩm bảo vệ tế bào.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Quinon đại diện cho một lớp các chất trung gian độc hại mà có thể tạo ra một loạt các tác động nguy hại trong cơ thể, bao gồm cả khả năng gây độc cấp tính, immunotoxicity, và ung thư. Các cơ chế tác động ảnh hưởng do quinon gây ra là rất phức tạp, và nó gây tổn hại cho tế bào có thể xảy ra thông qua quá trình alkyl hóa các protein quan trọng hay cả DNA của tế bào. Ngoài ra quinon là các phân tử hoạt động oxi hóa khử cao có thể tạo các semiquinone dẫn đến hình thành dạng phản ứng oxi hóa (ROS) đặc biệt bao gồm cả superoxide, hydrogen peroxide, và cuối cùng là gốc hydroxyl. Sự sản xuất ROS có thể gây bất lợi oxi hóa nghiêm trọng trong tế bào thông qua sự hình thành các phân tử lớn của tế bào bị oxi hóa bao gồm cả chất béo, protein và DNA, tạo cơ sở cho lão hóa và ung thư.

Quinon phổ biến trong tự nhiên và là một phần quan trọng cuả các hợp chất tự nhiên có trong thực vật, nấm và vi khuẩn. Chúng ta tiếp xúc với quinon không chỉ thông qua chế độ ăn uống mà còn thông qua các chất gây ô nhiễm như benzen, các hydrocarbon mạch vòng hay do chính chúng ta tạo ra như estrogen, catecholamin. Nhiều bằng chứng mạnh mẽ cho thấy cơ chế độc tính của quinon liên quan tới các bệnh lý đã được biết đến của các hợp chất trên. Tế bào chúng ta cũng có rất nhiều cơ chế để chống lại những ảnh hưởng tiêu cực của quinon và một trong số đó chính là NAD(P)H:quinone oxidoreductae 1 (NQO1), một enzyme đi đầu trong hàng rào bảo vệ tế bào chống lại các tác động gây độc của các hợp chất quinon.

Enzyme oxi hóa khử quinon chất nhận NADH- NQO1 là một flavoprotein được phân bố rộng rãi, phụ thuộc FAD, thúc đẩy sự khử 2 điện tử quinon, quioneimines, nitroaromatics, và azo dyes. Sự khử này làm giảm mức quinon và giảm thiểu cơ hội tạo phản ứng oxy trung gian và giảm các nhóm thiol nội bào. NQO1 là một enzyme cảm ứng mạnh được điều khiển bởi con đường Keap/Nrf2/ARE. Bằng chứng cho thấy tầm quan trọng chức năng chống oxi hóa của NQO1 trong stress oxi hóa được cung cấp bởi các mức độ biểu hiện cảm ứng NQO1 (knockout hoặc knockdown) liên quan đến tăng và giảm khả năng nhạy cảm tương ứng với stress oxi hóa.

Hơn nữa độc tính benzen được tăng cường rõ rệt khi NQO1 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm suy giảm hoạt tính. Ở người các đa hình ức chế hoạt động của NQO1 liên quan đến sự tăng cường khuynh hướng bệnh tật. Nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra vai trò bảo vệ mới của NQO1, dường như không liên quan đến hoạt động của enzyme. NQO1 bám vào giúp ổn định nhân tố ức chế khối u p53 chống lại sự phân hủy của proteasomal.

Hơn nữa NQO1 xuất hiện để điều khiển tính phân hủy của protein khác. Những phát hiện này có thể cho thấy một vai trò chọn lọc “gatekeeping” trong việc điều khiển sự phân hủy proteasomal của các protein đặc hiệu, do đó mở rộng vai trò bảo vệ tế bào của NQO1 vượt xa khả năng chống oxi hóa hiệu quả cao của nó. Để cung cấp một mô hình nghiên cứu xác định vai trò của NQO1 trong hoạt hóa các yếu tố bioreductive, chúng tôi thực hiện đề tài phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa enzyme NQO1 với mục tiêu: 1. Tạo ra vector tái tổ hợp chứa đoạn gen mã hóa enzyme NQO1.

Thiết kế vector biểu hiện tạm thời thành công đoạn gen đó trong tế bào động vật HEK. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm ƣơn TỔNG QUAN TÀI LI U 1. Tổng quan về gen NQO1 1.1 Giới thiệu chung về gen NQO1 Gen NQO1 mã hóa cho enzyme NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 là enzyme có nhiều vai trò bảo vệ tế bào, ngoài chức năng xúc tác còn có chức năng mở rộng [56]. NQO1 là một flavoprotein phụ thuộc FAD được phân bố rộng rãi xúc tác cho sự phân giải quinon, quinoneimines, nitroaromatics, và azo dyes.

NQO1 đã được phát hiện và đặt tên DT-diaphorase (DPNH=NADH và TPNH=NADPH) bởi Lars Ernster vào năm 1958, và được thể hiện thông qua sự ức chế phản ứng oxi hóa khử vitamin K do dicoumarol đã được mô tả bởi Marki và Martius. Vai trò chống oxi hóa trực tiếp cơ bản của NQO1 trong cơ chế xúc tác: làm giảm 2 điện tử ở một loạt các quinon thành hydroquinone tương ứng bằng cách sử dụng NADPH hoặc NADH như chất cho điện tử [24]. Như vậy, NQO1 chuyển điện tử của quinon tham gia vào các phản ứng hoặc làm suy giảm sulfhydryl hoặc giảm sự mất 1 điện tử tạo ra semiquinone và các phản ứng khác nhau tạo ra các hợp chất oxi hóa trung gian như kết quả chu trình oxi hóa khử. Thêm vào đó, các sản phẩm hydroquinone của các phản ứng NQO1 có thể chuyển hóa glucuronide và các gốc sulfate do đó dễ dàng được bài tiết ra ngoài.

Đáng chú ý, sự khử quinon được tìm thấy ở hàng loạt các sinh vật nhân chuẩn từ nấm men đến động vật có vú [27]. Mặc dù trong nhiều hệ thống, các chức năng và sự điều hòa của các enzyme phức tạp vẫn được tìm hiểu, nhưng rõ ràng là trong các trường hợp khử quinon là đi đầu trong bảo vệ tế bào với điều kiện là có nhiều lớp bảo vệ [28, 30, 34]. Xung quanh thời điểm khám phá ra NQO1, Williams-Ashman và Huggins [68] đã tìm thấy enzyme này đã phản ứng mạnh trong gan chuột bởi azo dye và các hydrocarbon mạch vòng. Hơn nữa với sự hiệu quả của NQO1 trong bảo vệ chống lại độc tố và khả năng gây ung thư của các hydrocarbon mạch vòng, Huggins cho thấy sử dụng định lượng hoạt tính NQO1 như một phương pháp sàng lọc để xác định hiệu quả các tác nhân bảo vệ.

Trong những năm cuối thập niên 80 Hans Prochaska và các cộng sự [55] phát triển thử nghiệm sinh học định lượng cao trong đĩa 96 giếng cho NQO1 tế bào gan chuột. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm Thử nghiệm này hiện đang được sử dụng rộng rãi để sàng lọc cho hoạt tính gây cảm ứng NQO1 của các hợp chất tinh khiết hay hỗn hợp phức tạp, phân đoạn cho các hỗn hợp đó và xác định chính xác tác dụng của các chất gây cảm ứng [32]. Hơn nữa, nhiều hợp chất hóa học đã được tìm thấy cảm ứng NQO1 trong thử nghiệm này đã trực tiếp chỉ ra vai trò bảo vệ chống lại các độc tố và gây ung thư của hàng loạt chất gây ung thư trong một số tổ chức đích và ngược lại. Cấu trúc gen NQO1 Gen NQO1 nằm trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể 16 tại vị trí 16q22.

Gen NQO1 có kích thước khoảng 20 kb, trong đó kích thước mRNA là 2912bp và có sáu exon bị gián đoạn bởi năm intron. Vị trí của gen mã hóa NQO1 trên NST số 16 [72] Exon đầu tiên là dài 118 bp và mã hóa cho hai loại axit amin G, M và một codon khởi đầu đầu tiên của exon thứ hai. Exon thứ sáu là lớn nhất trong số các exon, có chiều dài là 1833 bp. Phân tích trình tự của exon thứ sáu cho thấy sự hiện diện của 4 chuỗi tín hiệu tiềm năng polyadenylation (AATAAA).

Trong tất cả các intron, intron thứ hai là nhỏ nhất (116 bp). Trong đó, trình tự nucleotide mã hóa cho protein NQO1 chỉ chiếm có 4% tổng số nucleotide của gen (Bảng 1). Kích thước các exon và intron của gen mã hóa cho enzyme NQO1. Exon íc t ƣớc(bp) Intron íc t ƣớc (bp) 1 519 1 7898 2 165 2 116 3 131 3 3045 4 114 4 1834 5 102 5 1746 6 1881 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm Gen NQO1 được sắp xếp theo trình tự 20kb nhưng phần trình tự mã hóa cho protein chỉ là 825bp tương ứng với 274aa (không tính mã kết thúc).

Trình tự gen và promoter NQO1 đã được xác định lần lượt là 2423bp và 2123bp. Trong nghiên cứu Asma Chinigarzadeh cùng cộng sự (2012) đã phân lập thành công đoạn 2.123 bp từ vị trí bắt đầu phiên mã tham gia vào điều hòa sự sao chép của gen NQO1 [21]. Các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu tiềm năng vị trí điều hòa ARE nằm ở - 477 tính từ vị trí bắt đầu phiên mã. Cấu trúc gen NQO1 với các intron và exon [72] 1.3 Sự điều hòa NQO1 bởi con đường Keap/Nrf2/ARE Một dãy các chất hóa học có khả năng cảm ứng [29] tăng cường NQO1 được thông qua con đường trung gian KEAP1/ Nrf2/ARE.

Bằng cách kiểm soát biểu hiện một dãy hơn 100 gen bảo vệ tế bào, con đường này là cần thiết cho sự thích ứng của tế bào động vật và các sinh vật khác với rất nhiều tác nhân gây stress như ái lực và oxi hóa [44, 50, 51]. Như tên của con đường, ba thành phần tế bào là trung tâm quan trọng đối với các cơ chế bởi sự phiên mã của nhiều gen được điều hòa: - Yếu tố phản ứng chống oxi hóa (ARE), trình tự DNA có mặt ở vùng điều hòa trước của gen và liên ứng TGAG/CNNNGC. Trong trường hợp gen NQO1 chuột trình tự chính xác đã được sửa bởi John Hayes và cộng sự [39, 52] đã chỉ ra rằng các nucleotide nhất định trước đây được cho là dư thừa trong ARE chức năng có vai trò thiết yếu, trong khi những nucleotide khác trước đó được coi là thiết yếu thì không cần thiết. - Nrf2 một nhân tố phiên mã zitrer leucine cơ bản của họ cap-n’collar liên kết như một heterodimer với protein nhỏ Maf, tới ARE do đó tăng cường tín hiệu phiên mã.

5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm - Keap1 (Kelch- như protein liên kết ECH), protein cảm biến các tác nhân gây cảm ứng một protein ức chế đa domain họ Keap cái mà gắn với Nrf2 và thúc đẩy uquitination và phân hủy proteasomal [42] bởi chức năng như một adaptor nối Cul3 dựa trên E3 [70]. Con đường Keap1/Nrf2/ARE [15] Trong điều kiện cơ bản (mũi tên nét đứt), protein hai domain Keap1 nối kết yếu tố phiên mã Nrf2 qua miền Kelch và thúc đẩy sự ubiquitination và sự phân hủy proteasomal của yếu tố phiên mã có chức năng như một bộ chuyển đổi cho Cul3 dựa trên ligase E3. Gây cảm ứng cho tất cả đều phản ứng với nhóm sulfhydryl, thay đổi hóa học cụ thể phản ứng mạnh aa cysteine của Keap1 mà sau đó mất khả năng nhằm vào đích Nrf2 cho sự phân hủy.