MỞ ĐẦU Quinon đại diện cho một lớp các chất trung gian độc hại mà có thể tạo ra một loạt các tác động nguy hại trong cơ thể, bao gồm cả khả năng gây độc cấp tính, immunotoxicity, và ung thư. Các cơ chế tác động ảnh hưởng do quinon gây ra là rất phức tạp, và nó gây tổn hại cho tế bào có thể xảy ra thông qua quá trình alkyl hóa các protein quan trọng hay cả DNA của tế bào. Ngoài ra quinon là các phân tử hoạt động oxi hóa khử cao có thể tạo các semiquinone dẫn đến hình thành dạng phản ứng oxi hóa (ROS) đặc biệt bao gồm cả superoxide, hydrogen peroxide, và cuối cùng là gốc hydroxyl. Sự sản xuất ROS có thể gây bất lợi oxi hóa nghiêm trọng trong tế bào thông qua sự hình thành các phân tử lớn của tế bào bị oxi hóa bao gồm cả chất béo, protein và DNA, tạo cơ sở cho lão hóa và ung thư.
Quinon phổ biến trong tự nhiên và là một phần quan trọng cuả các hợp chất tự nhiên có trong thực vật, nấm và vi khuẩn. Chúng ta tiếp xúc với quinon không chỉ thông qua chế độ ăn uống mà còn thông qua các chất gây ô nhiễm như benzen, các hydrocarbon mạch vòng hay do chính chúng ta tạo ra như estrogen, catecholamin. Nhiều bằng chứng mạnh mẽ cho thấy cơ chế độc tính của quinon liên quan tới các bệnh lý đã được biết đến của các hợp chất trên. Tế bào chúng ta cũng có rất nhiều cơ chế để chống lại những ảnh hưởng tiêu cực của quinon và một trong số đó chính là NAD(P)H:quinone oxidoreductae 1 (NQO1), một enzyme đi đầu trong hàng rào bảo vệ tế bào chống lại các tác động gây độc của các hợp chất quinon.
Enzyme oxi hóa khử quinon chất nhận NADH- NQO1 là một flavoprotein được phân bố rộng rãi, phụ thuộc FAD, thúc đẩy sự khử 2 điện tử quinon, quioneimines, nitroaromatics, và azo dyes. Sự khử này làm giảm mức quinon và giảm thiểu cơ hội tạo phản ứng oxy trung gian và giảm các nhóm thiol nội bào. NQO1 là một enzyme cảm ứng mạnh được điều khiển bởi con đường Keap/Nrf2/ARE. Bằng chứng cho thấy tầm quan trọng chức năng chống oxi hóa của NQO1 trong stress oxi hóa được cung cấp bởi các mức độ biểu hiện cảm ứng NQO1 (knockout hoặc knockdown) liên quan đến tăng và giảm khả năng nhạy cảm tương ứng với stress oxi hóa.
Hơn nữa độc tính benzen được tăng cường rõ rệt khi NQO1 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm suy giảm hoạt tính. Ở người các đa hình ức chế hoạt động của NQO1 liên quan đến sự tăng cường khuynh hướng bệnh tật. Nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra vai trò bảo vệ mới của NQO1, dường như không liên quan đến hoạt động của enzyme. NQO1 bám vào giúp ổn định nhân tố ức chế khối u p53 chống lại sự phân hủy của proteasomal.
Hơn nữa NQO1 xuất hiện để điều khiển tính phân hủy của protein khác. Những phát hiện này có thể cho thấy một vai trò chọn lọc “gatekeeping” trong việc điều khiển sự phân hủy proteasomal của các protein đặc hiệu, do đó mở rộng vai trò bảo vệ tế bào của NQO1 vượt xa khả năng chống oxi hóa hiệu quả cao của nó. Để cung cấp một mô hình nghiên cứu xác định vai trò của NQO1 trong hoạt hóa các yếu tố bioreductive, chúng tôi thực hiện đề tài phân lập và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa enzyme NQO1 với mục tiêu: 1. Tạo ra vector tái tổ hợp chứa đoạn gen mã hóa enzyme NQO1.
Thiết kế vector biểu hiện tạm thời thành công đoạn gen đó trong tế bào động vật HEK. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm ƣơn TỔNG QUAN TÀI LI U 1. Tổng quan về gen NQO1 1.1 Giới thiệu chung về gen NQO1 Gen NQO1 mã hóa cho enzyme NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 là enzyme có nhiều vai trò bảo vệ tế bào, ngoài chức năng xúc tác còn có chức năng mở rộng [56]. NQO1 là một flavoprotein phụ thuộc FAD được phân bố rộng rãi xúc tác cho sự phân giải quinon, quinoneimines, nitroaromatics, và azo dyes.
NQO1 đã được phát hiện và đặt tên DT-diaphorase (DPNH=NADH và TPNH=NADPH) bởi Lars Ernster vào năm 1958, và được thể hiện thông qua sự ức chế phản ứng oxi hóa khử vitamin K do dicoumarol đã được mô tả bởi Marki và Martius. Vai trò chống oxi hóa trực tiếp cơ bản của NQO1 trong cơ chế xúc tác: làm giảm 2 điện tử ở một loạt các quinon thành hydroquinone tương ứng bằng cách sử dụng NADPH hoặc NADH như chất cho điện tử [24]. Như vậy, NQO1 chuyển điện tử của quinon tham gia vào các phản ứng hoặc làm suy giảm sulfhydryl hoặc giảm sự mất 1 điện tử tạo ra semiquinone và các phản ứng khác nhau tạo ra các hợp chất oxi hóa trung gian như kết quả chu trình oxi hóa khử. Thêm vào đó, các sản phẩm hydroquinone của các phản ứng NQO1 có thể chuyển hóa glucuronide và các gốc sulfate do đó dễ dàng được bài tiết ra ngoài.
Đáng chú ý, sự khử quinon được tìm thấy ở hàng loạt các sinh vật nhân chuẩn từ nấm men đến động vật có vú [27]. Mặc dù trong nhiều hệ thống, các chức năng và sự điều hòa của các enzyme phức tạp vẫn được tìm hiểu, nhưng rõ ràng là trong các trường hợp khử quinon là đi đầu trong bảo vệ tế bào với điều kiện là có nhiều lớp bảo vệ [28, 30, 34]. Xung quanh thời điểm khám phá ra NQO1, Williams-Ashman và Huggins [68] đã tìm thấy enzyme này đã phản ứng mạnh trong gan chuột bởi azo dye và các hydrocarbon mạch vòng. Hơn nữa với sự hiệu quả của NQO1 trong bảo vệ chống lại độc tố và khả năng gây ung thư của các hydrocarbon mạch vòng, Huggins cho thấy sử dụng định lượng hoạt tính NQO1 như một phương pháp sàng lọc để xác định hiệu quả các tác nhân bảo vệ.
Trong những năm cuối thập niên 80 Hans Prochaska và các cộng sự [55] phát triển thử nghiệm sinh học định lượng cao trong đĩa 96 giếng cho NQO1 tế bào gan chuột. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm Thử nghiệm này hiện đang được sử dụng rộng rãi để sàng lọc cho hoạt tính gây cảm ứng NQO1 của các hợp chất tinh khiết hay hỗn hợp phức tạp, phân đoạn cho các hỗn hợp đó và xác định chính xác tác dụng của các chất gây cảm ứng [32]. Hơn nữa, nhiều hợp chất hóa học đã được tìm thấy cảm ứng NQO1 trong thử nghiệm này đã trực tiếp chỉ ra vai trò bảo vệ chống lại các độc tố và gây ung thư của hàng loạt chất gây ung thư trong một số tổ chức đích và ngược lại. Cấu trúc gen NQO1 Gen NQO1 nằm trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể 16 tại vị trí 16q22.
Gen NQO1 có kích thước khoảng 20 kb, trong đó kích thước mRNA là 2912bp và có sáu exon bị gián đoạn bởi năm intron. Vị trí của gen mã hóa NQO1 trên NST số 16 [72] Exon đầu tiên là dài 118 bp và mã hóa cho hai loại axit amin G, M và một codon khởi đầu đầu tiên của exon thứ hai. Exon thứ sáu là lớn nhất trong số các exon, có chiều dài là 1833 bp. Phân tích trình tự của exon thứ sáu cho thấy sự hiện diện của 4 chuỗi tín hiệu tiềm năng polyadenylation (AATAAA).
Trong tất cả các intron, intron thứ hai là nhỏ nhất (116 bp). Trong đó, trình tự nucleotide mã hóa cho protein NQO1 chỉ chiếm có 4% tổng số nucleotide của gen (Bảng 1). Kích thước các exon và intron của gen mã hóa cho enzyme NQO1. Exon íc t ƣớc(bp) Intron íc t ƣớc (bp) 1 519 1 7898 2 165 2 116 3 131 3 3045 4 114 4 1834 5 102 5 1746 6 1881 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm Gen NQO1 được sắp xếp theo trình tự 20kb nhưng phần trình tự mã hóa cho protein chỉ là 825bp tương ứng với 274aa (không tính mã kết thúc).
Trình tự gen và promoter NQO1 đã được xác định lần lượt là 2423bp và 2123bp. Trong nghiên cứu Asma Chinigarzadeh cùng cộng sự (2012) đã phân lập thành công đoạn 2.123 bp từ vị trí bắt đầu phiên mã tham gia vào điều hòa sự sao chép của gen NQO1 [21]. Các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu tiềm năng vị trí điều hòa ARE nằm ở - 477 tính từ vị trí bắt đầu phiên mã. Cấu trúc gen NQO1 với các intron và exon [72] 1.3 Sự điều hòa NQO1 bởi con đường Keap/Nrf2/ARE Một dãy các chất hóa học có khả năng cảm ứng [29] tăng cường NQO1 được thông qua con đường trung gian KEAP1/ Nrf2/ARE.
Bằng cách kiểm soát biểu hiện một dãy hơn 100 gen bảo vệ tế bào, con đường này là cần thiết cho sự thích ứng của tế bào động vật và các sinh vật khác với rất nhiều tác nhân gây stress như ái lực và oxi hóa [44, 50, 51]. Như tên của con đường, ba thành phần tế bào là trung tâm quan trọng đối với các cơ chế bởi sự phiên mã của nhiều gen được điều hòa: - Yếu tố phản ứng chống oxi hóa (ARE), trình tự DNA có mặt ở vùng điều hòa trước của gen và liên ứng TGAG/CNNNGC. Trong trường hợp gen NQO1 chuột trình tự chính xác đã được sửa bởi John Hayes và cộng sự [39, 52] đã chỉ ra rằng các nucleotide nhất định trước đây được cho là dư thừa trong ARE chức năng có vai trò thiết yếu, trong khi những nucleotide khác trước đó được coi là thiết yếu thì không cần thiết. - Nrf2 một nhân tố phiên mã zitrer leucine cơ bản của họ cap-n’collar liên kết như một heterodimer với protein nhỏ Maf, tới ARE do đó tăng cường tín hiệu phiên mã.
5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Th Thanh Nga K20 Sinh học thực nghiệm - Keap1 (Kelch- như protein liên kết ECH), protein cảm biến các tác nhân gây cảm ứng một protein ức chế đa domain họ Keap cái mà gắn với Nrf2 và thúc đẩy uquitination và phân hủy proteasomal [42] bởi chức năng như một adaptor nối Cul3 dựa trên E3 [70]. Con đường Keap1/Nrf2/ARE [15] Trong điều kiện cơ bản (mũi tên nét đứt), protein hai domain Keap1 nối kết yếu tố phiên mã Nrf2 qua miền Kelch và thúc đẩy sự ubiquitination và sự phân hủy proteasomal của yếu tố phiên mã có chức năng như một bộ chuyển đổi cho Cul3 dựa trên ligase E3. Gây cảm ứng cho tất cả đều phản ứng với nhóm sulfhydryl, thay đổi hóa học cụ thể phản ứng mạnh aa cysteine của Keap1 mà sau đó mất khả năng nhằm vào đích Nrf2 cho sự phân hủy.