Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Trong hệ sinh thái thủy vực, vi tảo đóng vai trò là mắt xích đầu tiên của chuỗi thức ăn, cung cấp nguồn dinh dưỡng thiết yếu gồm protein, khoáng chất, carbohydrate và các axít béo không bão hòa đa nối đôi (PUFAs) cho ấu trùng động vật thủy sản. Trong quy trình sản xuất giống tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), việc cung cấp thức ăn tươi sống có chất lượng dinh dưỡng cao và kích thước phù hợp trong 15 ngày đầu (đặc biệt là giai đoạn zoea 1-3 và mysis 1-3) giữ vai trò quyết định đến tỉ lệ sống và tốc độ biến thái của ấu trùng.

Thực tế sản xuất giống tại Việt Nam cho thấy loài vi tảo Thalassiosira weissflogii đang được sử dụng phổ biến nhưng có kích thước tế bào tương đối lớn, giá trị dinh dưỡng và mật độ tế bào đạt cực đại không cao, thời gian lưu giữ quần thể ngắn. Ngược lại, loài Thalassiosira pseudonana sở hữu kích thước tế bào nhỏ (4 - 5 µm), phù hợp với kích thước miệng mở của ấu trùng zoea, hàm lượng lipít cao (20,60 - 24,67% sinh khối khô), chứa nhiều axít béo thiết yếu (EPA, DHA), mật độ tế bào cực đại cao và có thể lưu giữ ở nhiệt độ thường từ 1 - 2 tháng. Tuy nhiên, các cơ sở sản xuất giống thường gặp trở ngại do tảo dễ bị nhiễm tạp vi sinh vật, nguồn giống suy thoái, thiếu quy trình nuôi sinh khối quy mô lớn ổn định và chưa có những nghiên cứu mang tính hệ thống về việc kiểm định an toàn sinh dược cũng như thử nghiệm thực tế trên ấu trùng tôm thẻ chân trắng ở quy mô pilot tại Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng được quy trình công nghệ thích hợp nuôi sinh khối Thalassiosira pseudonana ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot trong điều kiện trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng và thu sinh khối đủ tiêu chuẩn làm nguyên liệu thức ăn tươi sống cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng.

Nội dung nghiên cứu

  1. Phân lập lại khi tảo bị nhiễm vi sinh vật và tảo tạp, lưu giữ, nghiên cứu đặc điểm sinh học, thành phần dinh dưỡng của Thalassiosira pseudonana ở các quy mô bình thủy tinh 0,25 - 2 L và bể composite 0,2 - 3,5 m³.
  2. Xây dựng quy trình công nghệ tối ưu nuôi sinh khối Thalassiosira pseudonana trong các quy mô bình thủy tinh 0,25 - 2 L và bể composite 0,2 - 3,5 m³.
  3. Nghiên cứu độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và tác dụng sinh dược của sinh khối Thalassiosira pseudonana đạt tiêu chuẩn an toàn làm thức ăn cho các loài động vật thủy sản.
  4. Nghiên cứu sử dụng sinh khối Thalassiosira pseudonana tươi sống nuôi trồng được làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng ở các trang trại sản xuất giống.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu:
    • Chủng vi tảo silic Thalassiosira pseudonana Hasle và Heimdal, 1970 (nhập nội từ Trung tâm nghiên cứu Shrimp Genetic Improvement Center - Charoen Pokphand Foods PCL, Thái Lan).
    • Chủng vi tảo đối chứng: Thalassiosira weissflogii (Grunow) Hasle và Fryxell, 1977.
    • Động vật thử nghiệm an toàn sinh học: Chuột nhắt trắng chủng Swiss (20 - 25 g/con), chuột cống trắng chủng Wistar (200 ± 20 g/con) và chuột nhắt trắng đực (10 - 12 tuần tuổi, 20 - 30 g/con).
    • Động vật thủy sản thử nghiệm: Ấu trùng tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei Boone, 1931) giai đoạn nauplii 4 - 5 và hậu ấu trùng postlarvae 12.
  • Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm và trại sản xuất giống thuộc Công ty Cổ phần Chăn nuôi C.P Việt Nam; nguồn nước biển tự nhiên khai thác tại xã Ngư Thủy Bắc, huyện Lệ Thủy, tỉnh Quảng Bình; giám định sinh học phân tử tại Viện Công nghệ sinh học; xét nghiệm độc học tại Học viện Quân y.
  • Phạm vi quy mô và thời gian: Quy mô bình thủy tinh (0,25 L, 1 L, 2 L), bể composite pilot (0,2 m³, 1 m³, 3,5 m³) và bể xi măng (30 m³); chu kỳ theo dõi nuôi cấy tảo 14 ngày; thời gian ương ấu trùng từ nauplii đến postlarvae 12 và theo dõi nuôi thương phẩm.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trong và ngoài nước

Vi tảo từ lâu đã được xác định là nguồn cung cấp vitamin, protein và lipít không thể thay thế trong ương nuôi ấu trùng thủy sản:

  • Nghiên cứu về giá trị dinh dưỡng và ứng dụng vi tảo trên thế giới: Brown và cộng sự (1996, 1997) xác định hàm lượng vitamin B1 (48 - 106 µg/g SKK), vitamin C (1,1 mg/g SKK), vitamin B2 (20 µg/g SKK) và thành phần PUFAs phong phú trong tảo silic. Emmerson (1980) sử dụng T. weissflogii cho ấu trùng Fenneropenaeus indicus đạt tỉ lệ sống 95,8%. Lodeiros và cộng sự (2002) nuôi P. vannamei bằng Chaetoceros calcitrans và Skeletonema costatum đạt tỉ lệ sống zoea 76%. Kiatmetha và cộng sự (2010, 2011) ứng dụng T. weissflogii cho ấu trùng tôm sú (P. monodon) đạt tỉ lệ sống PL1 98%, ghi nhận hàm lượng protein đạt 326,67 mg/g SKK, EPA đạt 11,57 pg/tb và DHA đạt 2,74 pg/tb. Pérez-Morales và cộng sự (2016) sử dụng Tetraselmis suesica cho tỉ lệ sống zoea ở tôm thẻ chân trắng đạt 92%.
  • Nghiên cứu về điều kiện nuôi và sinh lý của Thalassiosira: García và cộng sự (2012) khảo sát độ mặn (25 - 50‰) lên sinh trưởng T. weissflogii, xác định tốc độ sinh trưởng đặc trưng µ đạt 1,12 - 1,24/ngày ở 25 - 30‰. Li và cộng sự (2017) đánh giá tỉ lệ N/P (10:1) trên T. weissflogii. Zhukova (2004) ghi nhận sự thay đổi thành phần axít béo của T. pseudonana theo thời gian nuôi cấy (PUFAs dao động 37,0 - 48,7% TFA). Gao và Yang (2012) khảo sát nồng độ CO₂ (390 và 1000 µatm) đối với quang hợp và hô hấp của T. pseudonana. Vásquez-Suárez và cộng sự (2013) đạt mật độ 4,62 × 10⁶ tb/mL trên môi trường Humus. Widianingsih và cộng sự (2013) phân tích thành phần axít béo của Thalassiosira sp. trên môi trường F/2. La Vars và cộng sự (2013), Amzil và cộng sự (2016), Yan và cộng sự (2017), Tian và cộng sự (2018), Bromke và cộng sự (2013), Hewes (2015), Takabe và cộng sự (2018) đã khảo sát các khía cạnh quang phổ, hóa sinh và thu hoạch sinh khối của T. pseudonana.
  • Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam: Đoàn Văn Đẩu và cộng sự (2002) dùng Chaetoceros sp. ương nuôi Penaeus merguiensis. Nguyễn Thanh Mai và cộng sự (2009) nuôi C. calcitrans làm thức ăn cho ấu trùng tôm thẻ chân trắng đạt tỉ lệ sống PL1 76%. Đào Văn Trí (2012) kết hợp Chaetoceros sp. và thức ăn tổng hợp ương nuôi tôm thẻ chân trắng đạt tỉ lệ sống PL8 76,8%. Lê Thị Trung và Huỳnh Thị Ngọc Như (2010), Phan Văn Xuân (2010), Trần Anh Tuấn (2012) nuôi Thalassiosira sp. trong bình thủy tinh và túi nilon 50 L cho ấu trùng nhuyễn thể. Trần Thị Lê Trang (2014) khảo sát sinh hóa T. pseudonana ở các độ mặn trong bình 1 L. Trang Si Trung và cộng sự (2016) nghiên cứu thu hồi sinh khối T. pseudonana bằng chitosan đạt hiệu suất 94,71% và đánh giá hoạt tính chống ôxy hóa DPPH. Trần Thị Lê Trang và Lục Minh Diệp (2017) nuôi T. pseudonana trong túi nilon 60 L đạt mật độ cực đại 0,82 × 10⁶ tb/mL.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Các công trình trước đây chủ yếu dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm hoặc túi nilon thể tích nhỏ, chưa tối ưu hóa đồng bộ các thông số kỹ thuật (môi trường dinh dưỡng, mật độ ban đầu, ánh sáng, nhiệt độ, độ mặn, pH, độ kiềm, chế độ sục khí) trên hệ thống bể composite pilot thể tích lớn (0,2 - 3,5 m³). Đồng thời, chưa có công trình nào tại Việt Nam kiểm định độc tính an toàn sinh học của sinh khối T. pseudonana trên động vật có vú và đưa vào sử dụng thực tế làm thức ăn tươi sống cho các giai đoạn phát triển của ấu trùng tôm thẻ chân trắng kết hợp theo dõi chu kỳ nuôi thương phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và phân loại học

Luận án dựa trên cơ sở phân loại học tảo silic của Cleve (1873), bộ Thalassiosirales; lý thuyết về đặc điểm sinh học sinh sản của tảo silic bao gồm phân cắt theo kiểu nắp hộp và hình thành bào tử phục hồi kích thước (auxospore) hoặc bào tử ngủ (resting spore) trong điều kiện bất lợi; động học sinh trưởng quần thể vi tảo qua 4 pha (tiềm phát, logarit, cân bằng, suy tàn); và cơ sở sinh lý dinh dưỡng động vật thủy sản về nhu cầu các axít béo thiết yếu (EPA, DHA, ARA, PUFA, MUFA, SFA).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Phương pháp chụp ảnh hình thái tế bào: Sử dụng kính hiển vi quang học Olympus CX21/CX23 (độ phóng đại 400 lần) và kính hiển vi điện tử quét SEM JEOL JSM-6400 (độ phóng đại 15.000 lần, cố định mẫu bằng 2,5% glutaraldehyde trong dung dịch đệm cacodylate pH 7,4, phủ màng vàng).
  • Phương pháp sinh học phân tử: Tách chiết ADN tổng số bằng kit ZR Plant/Seed DNA MiniPrep (Thermo Scientific). Khuếch đại một phần gen 18S rRNA kích thước 1.100 bp bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt:
    • Primer F: 5’-TACCACATCTAAGGAAGGCAGCAG-3’ (24 nu)
    • Primer R: 5’-GGCATCACAGACCTGTTATTGC-3’ (22 nu) Điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, tinh sạch sản phẩm bằng Gene JET Purification Kit, đọc trình tự trên máy tự động ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer. Phân tích và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng các phần mềm ClustalX 1.81, DNASTAR, MEGA7 và BLAST.
  • Phương pháp xác định chỉ tiêu sinh trưởng: Đếm mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer; tính tốc độ sinh trưởng đặc trưng $\mu = (\ln N_1 - \ln N_0)/(t_1 - t_0)$ (lần/ngày); thời gian nhân đôi thế hệ $t_d = \ln 2 / \mu_{max}$; khối lượng sinh khối khô (sấy ở 105°C đến khối lượng không đổi); hàm lượng chlorophyll a, b và carotenoit chiết xuất bằng axeton 90% qua đo quang phổ.
  • Phương pháp phân tích hóa sinh: Định lượng lipít tổng số theo phương pháp Bligh và Dyer (1959); phân tích thành phần axít béo no và không no đa nối đôi bằng sắc ký khí; phân tích protein, carbohydrate, khoáng đa vi lượng và kim loại nặng theo TCVN.
  • Phương pháp thử nghiệm độc tính và sinh dược: Thử độc tính cấp xác định liều gây chết $LD_{50}$; thử độc tính bán trường diễn trên chuột Swiss và chuột Wistar bằng đường uống dài ngày; theo dõi trọng lượng, xét nghiệm chỉ tiêu huyết học và công thức bạch cầu trên máy Swelab Alpha; định lượng enzyme gan (AST, ALT), thận (Urea, Creatinine) trên máy sinh hóa BTS 350; giải phẫu mô bệnh học gan, thận và theo dõi hành vi chuột.
  • Phương pháp thử nghiệm trên tôm thẻ chân trắng: Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các loại thức ăn (tảo tươi T. pseudonana, tảo T. weissflogii, thức ăn tổng hợp EZ Larva, Lansy, Frippak, V8), ảnh hưởng của mật độ ương đến tăng trưởng chiều dài (DLG), khối lượng (DWG), tỉ lệ sống và thời gian chuyển giai đoạn zoea, mysis, postlarvae. Thử nghiệm nuôi thương phẩm với tôm giống PL12 trong bể xi măng 30 m³.
  • Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm chuyên dụng, phân tích phương sai ANOVA một nhân tố và so sánh các giá trị trung bình.

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học về giá trị dinh dưỡng của vi tảo và vai trò của sinh khối tươi sống trong ương nuôi ấu trùng động vật thân mềm, cá biển và tôm biển. Chương tổng quan chi tiết về vị trí phân loại, chu kỳ sinh học và đặc tính sinh sản của loài Thalassiosira pseudonana. Đồng thời, phân tích thực trạng công nghệ nuôi sinh khối loài tảo này trên thế giới và tại Việt Nam qua các dạng hệ thống kín (túi nilon) và hệ thống hở (bể composite, bể xi măng), chỉ rõ các hạn chế về suy thoái giống, nhiễm vi sinh vật và thiếu hụt dinh dưỡng ở các trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng thương phẩm hiện nay.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc chủng vi tảo T. pseudonana, vi tảo đối chứng T. weissflogii, quy chuẩn động vật thí nghiệm (chuột nhắt, chuột cống) và nguồn ấu trùng tôm thẻ chân trắng nauplii 4 - 5 sạch bệnh EHP, VPA: AHPND.

Trình bày quy trình xử lý nước biển cấp (lắng thô, khử trùng $ClO_2$ 5 - 10 ppm, lọc cát TD, xử lý $O_3$ 0,4 - 0,6 ppm, màng siêu lọc UF 0,05 µm, bổ sung 120 g $CaCO_3$/m³ và 10 g $Na_2EDTA$/m³). Chi tiết hóa thành phần 5 môi trường dinh dưỡng thí nghiệm (AGP, F/2, TMRL, Conway, Walne) được tóm lược tại bảng sau:

Thành phần dinh dưỡng Môi trường F/2 (g/L) Môi trường TMRL (g/L) Môi trường Conway (g/L) Môi trường Walne (g/L) Môi trường AGP 20%
NaNO₃ 75 500 100 - Dung dịch pha gốc
NaH₂PO₄ / Na₂HPO₄ 5 50 20 20 Pha loãng tỉ lệ 20%
Na₂EDTA 4,36 15 45 - Bổ sung 1 mL/L
FeCl₃.6H₂O 3,15 4 1,3 1,3 Nước biển tự nhiên
Vi lượng (CuSO₄...) 9 9 9 9 Đầy đủ vi lượng
Vitamin (B₁, B₁₂, Biotin) Có B₁, B₁₂ Đầy đủ - Theo quy chuẩn
Na₂SiO₃.5H₂O 30 30 30 30 Bổ sung 2 mL/L

Chương này cũng thiết lập toàn bộ quy trình khảo sát 8 thông số nuôi cấy ở các dải giá trị: môi trường AGP (5 - 25%), mật độ ban đầu (0,1 - 0,3 × 10⁶ tb/mL), nhiệt độ (15 - 35°C), ánh sáng (3 - 12 klux), pH (4,0 - 9,0), độ mặn (15 - 35‰), độ kiềm (150 - 180 mg $CaCO_3$/L), sục khí (15/24 - 24/24 giờ), cùng hệ thống phương pháp phân tích hóa học, sinh học phân tử và thử nghiệm sinh học.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được theo 3 nhóm nội dung chính:

1. Đặc điểm sinh học và định danh loài

  • Hình thái tế bào: Dưới kính hiển vi quang học và SEM, tế bào vi tảo phân lập có dạng hình trụ ngắn, mặt cắt hình vuông hoặc hơi tròn, kích thước dao động 4 - 5 µm, tế bào đứng đơn lẻ hoặc nối chuỗi ngắn, không có roi, màu nâu vàng đặc trưng của tảo silic.
  • Sinh học phân tử: Phản ứng PCR nhân thành công phân đoạn gen 18S rRNA có kích thước 1.100 bp. Kết quả so sánh trình tự nucleotide và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp Neighbor-Joining khẳng định mẫu nghiên cứu đồng nhất với loài Thalassiosira pseudonana đăng ký trên GenBank (CCAP 1085/12, mã số KU900218.1).
  • Lưu giữ giống và sinh sản: Chủng tảo lưu giữ ổn định ở nhiệt độ phòng (25°C) trong thời gian 1 - 2 tháng mà không làm thay đổi hình thái và sức sống tế bào. Trong điều kiện cấy chuyển, vi tảo trải qua phân cắt nắp hộp và hình thành bào tử sinh trưởng (auxospore) phục hồi kích thước ban đầu.

2. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và quy trình công nghệ

Qua khảo sát thực nghiệm liên tục ở các thể tích từ 0,25 L, 1 L, 2 L đến các bể composite pilot 0,2 m³, 1 m³ và 3,5 m³, các thông số tối ưu cho sinh trưởng của T. pseudonana được xác lập đồng nhất:

Thông số nuôi cấy Giá trị tối ưu ở PTN (0,25 - 2 L) Giá trị tối ưu ở Pilot (0,2 - 3,5 m³)
Môi trường dinh dưỡng AGP 20% (bổ sung $Na_2SiO_3$ 2 mL/L) AGP 20% (bổ sung $Na_2SiO_3$ 2 mL/L)
Mật độ tế bào ban đầu 0,2 × 10⁶ tb/mL 0,2 × 10⁶ tb/mL
Nhiệt độ nuôi 25°C 25 - 27°C
Cường độ ánh sáng (CĐAS) 5,0 - 6,0 klux (chu kỳ 12:12 giờ) 10,0 klux (ở bể 3,5 m³)
Độ mặn 30‰ 30‰
Độ pH 7,0 7,0 - 7,5
Độ kiềm 150 - 180 mg $CaCO_3$/L 150 - 180 mg $CaCO_3$/L
Chế độ sục khí (CĐSK) 24/24 giờ (khí vô trùng) 24/24 giờ (hệ thống sục khí đáy)
Thời gian đạt đỉnh sinh khối 5 - 6 ngày 5 - 6 ngày

Quy trình nhân sinh khối tuần tự được thiết lập: Ống nghiệm 10 mL $\rightarrow$ Bình 0,25 L $\rightarrow$ Bình 1 L $\rightarrow$ Bình 2 L $\rightarrow$ Bể composite 0,2 m³ $\rightarrow$ Bể composite 1 m³ $\rightarrow$ Bể composite 3,5 m³.

  • Thành phần hóa học sinh khối thu hoạch ở bể 3,5 m³: Hàm lượng protein chiếm 18 - 30% SKK; lipít đạt 20,60 - 24,67% SKK; carbohydrate đạt 17 - 26% SKK. Trong thành phần lipít, axít béo bão hòa (SFAs) chiếm 36,72% TFA, axít béo không bão hòa một nối đôi (MUFAs) chiếm 44,67% TFA, axít béo không bão hòa đa nối đôi (PUFAs) chiếm 12,85% TFA, hàm lượng EPA đạt từ 11,32 - 16,65% TFA và DHA đạt 0,80 - 1,33% TFA.

3. Đánh giá an toàn sinh dược và thử nghiệm sản xuất giống, nuôi thương phẩm

  • An toàn sinh học: Thử nghiệm độc tính cấp trên chuột không ghi nhận liều gây chết ($LD_{50}$ không xác định, an toàn tuyệt đối ở liều uống tối đa). Độc tính bán trường diễn dài ngày cho thấy chuột tăng trọng bình thường, các chỉ tiêu huyết học (hồng cầu, huyết sắc tố, công thức bạch cầu), chỉ số men gan (AST, ALT) và chức năng thận (Urea, Creatinine) không sai khác có ý nghĩa thống kê so với lô đối chứng; cấu trúc vi thể mô gan, thận hoàn toàn bình thường.
  • Ứng dụng ương ấu trùng tôm thẻ chân trắng: Sử dụng sinh khối tươi sống T. pseudonana ở giai đoạn zoea cho kết quả vượt trội so với đối chứng T. weissflogii và thức ăn tổng hợp: ấu trùng bắt mồi mạnh, đường ruột đầy, tỉ lệ sống ở giai đoạn zoea và mysis đạt cao, thời gian biến thái rút ngắn, chất lượng postlarvae 12 đồng đều, âm tính với các mầm bệnh nguy hiểm (WSD, TS, YHD, IHHN, NHP, IMN, EHP, AHPND) và không tồn dư kháng sinh hay kim loại nặng.
  • Thử nghiệm nuôi thương phẩm: Đàn tôm giống sản xuất từ quy trình sử dụng thức ăn T. pseudonana được đưa vào nuôi thương phẩm cho tốc độ tăng trưởng nhanh về chiều dài và khối lượng, hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) thấp, tỉ lệ sống cao và đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý luận khoa học

  1. Cung cấp bộ dẫn liệu khoa học hoàn chỉnh về đặc điểm hình thái tế bào (LM, SEM) và dữ liệu trình tự gen 18S rRNA (1.100 bp) của chủng vi tảo biển Thalassiosira pseudonana nuôi cấy tại Việt Nam, bổ sung nguồn dữ liệu di truyền chuẩn xác cho tập đoàn giống vi tảo bản địa và nhập nội.
  2. Làm sáng tỏ quy luật động học sinh trưởng, thời gian nhân đôi thế hệ và sự biến đổi thành phần sinh hóa (protein, lipít, carbohydrate, các phân đoạn axít béo SFA, MUFA, PUFA, EPA, DHA) của T. pseudonana dưới tác động của các yếu tố sinh thái và dinh dưỡng ở các quy mô nuôi cấy khác nhau.

Đóng góp về mặt thực tiễn

  1. Xây dựng thành công quy trình công nghệ hoàn chỉnh nuôi nhân sinh khối Thalassiosira pseudonana từ quy mô phòng thí nghiệm (0,25 - 2 L) đến quy mô pilot bể composite (0,2 - 3,5 m³) vận hành ổn định trong điều kiện trại giống ở Việt Nam.
  2. Thiết lập quy trình phân lập lại giống khi bị tạp nhiễm và phương pháp lưu giữ giống vi tảo ở nhiệt độ phòng kéo dài từ 1 - 2 tháng, giúp các cơ sở sản xuất giống chủ động nguồn giống sạch bệnh và chất lượng.
  3. Đưa ra bằng chứng thực nghiệm về độ an toàn dược lý và sinh dược học của sinh khối vi tảo T. pseudonana trên động vật có vú, khẳng định nguồn nguyên liệu an toàn cho sản xuất thức ăn thủy sản.
  4. Khẳng định hiệu quả thực tế của việc sử dụng sinh khối tươi sống T. pseudonana thay thế hoặc bổ sung trong giai đoạn ấu trùng zoea của tôm thẻ chân trắng, tạo nguồn tôm giống PL12 khỏe mạnh, sạch bệnh phục vụ nuôi thương phẩm đạt hiệu quả kinh tế cao.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Đưa quy trình công nghệ nuôi sinh khối T. pseudonana ở quy mô bể composite 3,5 m³ vào ứng dụng rộng rãi tại các hệ thống trại sản xuất giống tôm thẻ chân trắng trên toàn quốc.
  • Tiếp tục nghiên cứu các phương pháp bảo quản sinh khối thu hoạch (dạng paste hoặc đông khô) nhằm kéo dài thời gian sử dụng mà vẫn duy trì được hoạt tính của các axít béo không no đa nối đôi.
  • Mở rộng phạm vi ứng dụng của sinh khối T. pseudonana làm thức ăn cho các đối tượng thủy sản giá trị cao khác như cá biển, nhuyễn thể hai mảnh vỏ và làm giàu dinh dưỡng cho luân trùng, Artemia.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Nghiên cứu thực nghiệm quy mô pilot mới dừng lại ở thể tích bể composite 3,5 m³ và bể xi măng 30 m³ trong nhà có kiểm soát ánh sáng và nhiệt độ, chưa mở rộng ra các mô hình nuôi hở hoàn toàn ngoài trời với thể tích hàng chục đến hàng trăm mét khối.
  • Sinh khối vi tảo thu hoạch chủ yếu được sử dụng trực tiếp ở dạng tươi sống trong ngày, chưa đánh giá sâu ảnh hưởng của các phương pháp chế biến sâu (cô đặc, đông khô, chiết tách tinh dầu chứa EPA/DHA) đến thời hạn bảo quản và độ ổn định sinh hóa.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Nghiên cứu nâng quy mô nuôi sinh khối liên tục hoặc bán liên tục trên các hệ thống kín photobioreactor hoặc bể hở công nghiệp ngoài trời có kiểm soát tạp nhiễm.
  • Khai thác các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học từ sinh khối T. pseudonana (như chất chống ôxy hóa, sắc tố, polysacarit) ứng dụng trong dược phẩm và thực phẩm chức năng.

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng

  • Nghiên cứu sinh, học viên và giảng viên: Chuyên ngành Nuôi trồng thủy sản, Công nghệ sinh học, Sinh học biển và Động vật học thủy sinh có thể sử dụng làm tài liệu tham khảo chuyên sâu về phân loại học tảo silic, sinh thái vi tảo và phương pháp tối ưu hóa nuôi cấy.
  • Kỹ thuật viên, cán bộ quản lý trại giống thủy sản: Tham khảo trực tiếp quy trình chuẩn bị nước biển, công thức môi trường dinh dưỡng AGP 20%, kỹ thuật nhân cấy tuần tự và chế độ cho ăn thích hợp đối với ấu trùng tôm thẻ chân trắng giai đoạn zoea và mysis.
  • Nhà hoạch định chính sách và cơ quan kiểm định chất lượng: Sử dụng các dẫn liệu về an toàn sinh học, tồn dư kim loại nặng và kháng sinh để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho thức ăn tươi sống trong nuôi trồng thủy sản.

Nội dung đáng tham khảo

  • Bộ thông số kỹ thuật tối ưu hóa chi tiết về môi trường AGP, cường độ ánh sáng, chế độ sục khí và quy trình xử lý nước biển cấp lọc qua màng siêu lọc UF 0,05 µm.
  • Quy trình phân lập và làm sạch giống vi tảo bị nhiễm tạp kết hợp kỹ thuật lưu giữ giống sống ở nhiệt độ thường từ 1 - 2 tháng.
  • Quy trình tích hợp từ nuôi cấy vi tảo pilot đến ứng dụng trực tiếp trên ấu trùng tôm và chu kỳ nuôi thương phẩm thực tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Loài vi tảo Thalassiosira pseudonana có ưu điểm sinh học gì vượt trội so với Thalassiosira weissflogii trong ương nuôi ấu trùng tôm?

Thalassiosira pseudonana sở hữu kích thước tế bào nhỏ từ 4 - 5 µm (trong khi T. weissflogii có kích thước lớn hơn), rất vừa vặn với kích thước miệng mở của ấu trùng tôm thẻ chân trắng giai đoạn zoea (zoea 1 - 3). Ngoài ra, loài tảo này có hàm lượng lipít cao (20,60 - 24,67% SKK), giàu axít béo không bão hòa đa nối đôi thiết yếu (PUFAs, EPA, DHA), tốc độ sinh trưởng nhanh, mật độ tế bào đạt cực đại cao và có khả năng lưu giữ ở nhiệt độ phòng kéo dài từ 1 - 2 tháng.

2. Trình tự cặp mồi và đoạn gen nào được tác giả sử dụng để định danh loài Thalassiosira pseudonana?

Tác giả sử dụng cặp mồi chuyên biệt nhân đoạn gen 18S rRNA có kích thước 1.100 bp (nằm từ vị trí 290 bp đến 1.330 bp trên gen):

  • Primer F: 5’-TACCACATCTAAGGAAGGCAGCAG-3’ (24 nucleotide)
  • Primer R: 5’-GGCATCACAGACCTGTTATTGC-3’ (22 nucleotide) Trình tự đọc được có độ tương đồng di truyền cao với chủng chuẩn Thalassiosira pseudonana CCAP 1085/12 (mã số KU900218.1 trên GenBank).

3. Điều kiện kỹ thuật tối ưu để nuôi sinh khối Thalassiosira pseudonana ở quy mô bể composite pilot (0,2 - 3,5 m³) là gì?

Các thông số tối ưu gồm: môi trường dinh dưỡng AGP 20% (bổ sung $Na_2SiO_3$ 2 mL/L); mật độ tế bào ban đầu 0,2 × 10⁶ tb/mL; nhiệt độ 25 - 27°C; cường độ ánh sáng 10,0 klux với chu kỳ chiếu sáng 12 giờ sáng : 12 giờ tối; độ mặn 30‰; pH 7,0 - 7,5; độ kiềm 150 - 180 mg $CaCO_3$/L; và chế độ sục khí liên tục 24/24 giờ bằng hệ thống cấp khí đáy đã qua lọc vô trùng.

4. Đánh giá độ an toàn sinh học của sinh khối vi tảo Thalassiosira pseudonana được tiến hành như thế nào?

Độ an toàn sinh học được đánh giá qua thử nghiệm độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng Swiss và chuột cống trắng Wistar. Kết quả cho thấy sinh khối vi tảo không gây chết động vật ($LD_{50}$ không xác định), không làm thay đổi các chỉ số huyết học, không ảnh hưởng đến chức năng gan (AST, ALT), chức năng thận (Urea, Creatinine) và không gây bất kỳ biến đổi bệnh lý nào trên cấu trúc vi thể mô gan, thận cũng như hành vi của động vật thực nghiệm.

5. Việc sử dụng sinh khối tươi sống Thalassiosira pseudonana mang lại kết quả thực tế nào trong sản xuất giống tôm thẻ chân trắng?

Ấu trùng tôm thẻ chân trắng giai đoạn zoea được cho ăn sinh khối tươi sống T. pseudonana có khả năng bắt mồi tốt, đường ruột đầy, tỉ lệ sống cao ở các giai đoạn zoea và mysis, rút ngắn thời gian biến thái so với các nghiệm thức đối chứng sử dụng T. weissflogii hoặc thức ăn tổng hợp. Con giống postlarvae 12 thu được khỏe mạnh, âm tính hoàn toàn với các bệnh nguy hiểm (WSD, TS, YHD, IHHN, NHP, IMN, EHP, AHPND), không chứa tồn dư kháng sinh và kim loại nặng, khi nuôi thương phẩm đạt tốc độ tăng trưởng nhanh và hệ số FCR thấp.

Kết luận

Luận án tiến sĩ đã hoàn thành việc định danh chính xác chủng vi tảo Thalassiosira pseudonana bằng phương pháp hình thái học và sinh học phân tử đoạn gen 18S rRNA, đồng thời làm chủ quy trình phân lập lại và lưu giữ giống sống ở nhiệt độ thường. Đề tài đã tối ưu hóa toàn diện các thông số kỹ thuật nuôi sinh khối từ quy mô phòng thí nghiệm đến quy mô pilot bể composite 3,5 m³ trên môi trường AGP 20%, tạo ra nguồn sinh khối giàu protein, lipít và axít béo không bão hòa đa nối đôi (EPA, DHA). Các kết quả thử nghiệm độc học khẳng định sinh khối vi tảo an toàn tuyệt đối, và việc ứng dụng sinh khối tươi sống trong sản xuất giống tôm thẻ chân trắng đã nâng cao rõ rệt tỉ lệ sống, rút ngắn thời gian biến thái và tạo nguồn giống chất lượng cao cho nuôi thương phẩm.