LỜI MỞ ĐẦU Hiện nay, nhiều loài rong biển đƣợc sử dụng để nghiên cứu trong lĩnh vực nông nghiệp nhằm phát triển các dạng phân bón. Trong đó, rong sụn Kappaphycus alvarezii đƣợc đặc biệt quan tâm vì thành phần chủ yếu κ- carrageenan, nếu chúng ta thủy phân đƣa về dạng oligo ( κ-oligo carrageenan) sẽ tác động tích cực đến sự sinh trƣởng của thực vật [1,2,3], ngoài ra rong sụn Kappaphycus alvarezii còn có chứa các khoáng chất vi lƣợng: niken, cabon, kẽm, đồng, sắt. ; khoáng đa lƣợng nhƣ natri, canxi [4] đáp ứng tốt cho nhu cầu sinh trƣởng, phát triển cho cây trồng. Rong sụn Kappaphycus alvarezii chứa hàm lƣợng carrageenan khá cao (40% trọng lƣợng chất khô).
Carrageenan ngày càng đƣợc ứng dụng phổ biển trong nhiều lĩnh vực khác nhau [4], [5], [6], [7]. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy việc thủy phân carrageenan đƣa về dạng oligo carrageenan đang là xu hƣớng cần thiết. Bởi lẽ, oligo carrageenan là một loại oligosaccharide có hoạt tính sinh học nhƣ kháng khuẩn, kháng vi-rút, chất chống oxy hóa, chất điều hòa miễn dịch, chống viêm và chống khối u [8,9] và nhiều ứng dụng thực phẩm nhƣ làm tăng khả năng nhũ hóa thuốc, tăng khả năng tạo độ dẻo dai cho thực phẩm. Đặc biệt oligo carrageenan còn thúc đẩy quá trình quang hợp, kích thích sự sinh trƣởng ở thực vật [1,10] đƣợc nghiên cứu và làm phân bón lá có hiệu quả rõ rệt [11,12,13].
Oligo carrageenan đƣợc đƣợc thủy phân bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau ( vật lí [14,15], hóa học [16,17,18], sinh học [19,20,21]). Trong phƣơng pháp hóa học, phƣơng pháp thủy phân bằng xúc tác axit có một số lợi thế quan trọng nhƣ tốc độ phản ứng nhanh, giá rẻ và dễ dàng có sẵn; nhƣợc điểm là quá trình tách sản phẩm trong dịch thủy phân sẽ khó khăn. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy việc sử dụng enzym để thu carrrageenan có nhiều ƣu điểm carrrageenan thu đƣợc dễ dàng tinh chế. Bởi vì, trong quá trình thủy phân enzym làm suy yếu các mô của rong biển và bào mòn thành tế bào của thân rong, giúp cho quá trình chiết đƣợc triệt để và dễ dàng hơn.
Tuy nhiên, Tan và Lee, (2014) [22] cho thấy κ-carrageenan không dễ dàng bị thủy phân bởi enzym do sự liên kết của κ-carrageenan và nƣớc tạo 10 một liên kết khá chắc chắn chống lại sự thủy phân của enzym dẫn đến hiệu suất thủy phân không cao. Vì thế sử dụng axit H3PO4 nhƣ là một chất xúc tác trong quá trình thủy phân carrageenan nhằm nâng cao hiệu suất thủy phân rong sụn Kappaphycus alvarezii. Nhằm đƣa ra quy trình thủy phân phù hợp để tạo ra hiệu suất thủy phân cao sử dụng sản phẩm (oligo carrageenan) từ rong sụn Kappaphycus alvarezii làm phân bón trong nông nghiệp. Vì vậy thực hiện đề tài ― Xác định hiệu suất, trọng lƣợng phân tử và đặc trƣng cấu trúc polysaccharide thủy phân từ rong sụn Kappaphycus alvarezii bằng phƣơng pháp kết hợp enzym với axit ‖ là cần thiết, góp phần mở ra một hƣớng phát triển cho ngành nông nghiệp, đặc biệt ngành công nghiệp phân bón nƣớc ta.
Mục tiêu của luận văn Xác định hiệu suất, trọng lƣợng phân tử và đặc trƣng cấu trúc của oligo carrageenan thu đƣợc bằng phƣơng pháp thủy phân enzym kết hợp axit (enzym Viscozyme L và axit H3PO4 0,15M) ở các điều kiện khác nhau (ảnh hƣởng của enzym, thời gian xử lí enzym, thời gian thủy phân), từ đó đƣa ra quy trình thủy phân phù hợp cho mục đích làm chất kích thích sinh trƣởng trong nông nghiệp. Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: - Khảo sát hiệu suất thủy phân ở các điều kiện thủy phân khác nhau. - Đƣa ra các điều kiện thủy phân đạt hiệu suất thủy phân thích hợp. - Phân tích trọng lƣợng phân tử trung bình và đặc trƣng cấu trúc của carrageenan trong dịch oligo carrageenan thu đƣợc sau quá trình thủy phân.
11 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. TỔNG QUAN VỀ RONG SỤN Rong sụn thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta), phân lớp: Rhodophyceae, bộ: Gigartinales, họ: Solieriaceae, giống: Kappaphycus, loài: alvarezii, trong đó loài Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty là loài có sản lƣợng lớn nhất [23]. Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty đƣợc trồng phổ biến với mục đích làm thức ăn hoặc nhƣ một nguồn cung cấp carrageenan cho ngành công nghiệp. Loài này đã đƣợc nuôi thành công ở Philippines kể từ những năm 1970 và đã đƣợc giới thiệu ở hơn 20 quốc gia cho mục đích nuôi trồng thủy sản.
alvarezii đã thu hút sự chú ý đáng kể không chỉ nhƣ một nguồn cung cấp carrageenans còn là nguồn protein có giá trị thực tiễn trong y học. Vào năm 1993, Viện nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã di nhập rong sụn giống từ Nhật Bản để nghiên cứu nhân giống và tiến hành nuôi trồng thử nghiệm rong sụn tại các vùng ven biển của Việt Nam (Khánh Hòa, Ninh Thuận…). Rong sụn tƣơi thƣờng có màu xanh đỏ nâu hoặc màu xanh do trong rong có hai loại sắc tố là phycobline (bao gồm phycocyanine có màu xanh tím, phycocythine có màu đỏ) và chlorophyll. Rong sụn thuộc loài đơn trụ bao gồm 2 phần: Phần lõi: gồm một tế bào trung trụ chạy dọc thân từ gốc đến ngọn.
Xung quanh có từ 3 ÷ 4 hàng tế bào vây trụ có kích thƣớc lớn, hình tròn hay hình đa giác, trong suốt, vách mỏng chứa các chất dinh dƣỡng. Phần da: gồm nhiều tế bào nhỏ sắp xếp khít nhau, hình tròn hay hình bầu dục, không trong suốt, chứa đầy sắc tố. Ngoài cùng là lớp vỏ keo chứa cellulose, chiếm khoảng 4% trọng lƣợng rong khô, đóng vai trò bảo vệ các lớp bên trong [24]. 12 Thành phần chính của rong sụn là carrageenan.
Hàm lƣợng carrageenan có thể chiếm đến 40% trọng lƣợng khô của rong sụn. Thành phần hóa học cơ bản của rong sụn nguyên liệu trình bày ở Bảng 1. Thành phần hóa học của rong sụn [25] Tên thành phần hóa học % (khối lƣợng) Protein 2,4 Cellulose 4,0 Ẩm 19,4 Tro tổng 20,0 Carrageenan 40,0 Thành phần khác 14,2 1. TỔNG QUAN VỀ CARRAGEENAN VÀ OLIGO CARRAGEENAN 1.
Giới thiệu chung về carrageenan Tên carrageenan có nguồn gốc từ loài rong biển Chondrus crispus đƣợc gọi là Carrageen Moss hoặc Ailen Moss ở Anh, và Carraigin ở Ireland. Carraigin đã đƣợc sử dụng ở Ireland từ 400 năm sau công nguyên dƣới dạng gelatin và làm thuốc tại nhà để chữa ho và cảm lạnh. Carrageenan đƣợc sử dụng trong nhiều ứng dụng thƣơng mại nhƣ chất tạo gel, làm đặc và ổn định, đặc biệt là trong thực phẩm sản phẩm và nƣớc sốt. Ngoài những chức năng này, carrageenan đƣợc sử dụng trong y học thực nghiệm, dƣợc phẩm công thức, mỹ phẩm và các ứng dụng công nghiệp.
Từ thế kỷ 19, rong biển đỏ Chondrus crispus cũng đƣợc sử dụng trong công nghiệp bia. Năm 1930 ở Mỹ bắt đầu sản xuất carrageenan thƣơng mại chuyển từ bột rong biển khô sang carrageenan tinh chế [26]. Sau chiến tranh thế giới thứ hai, việc đáp ứng lƣợng carrageenan ngày càng tăng cao. Do đó, 13 vào đầu những năm 1950.
Quá trình phân đoạn chiết xuất carrageenan thô ra đời [27]. Carrageenan là thành phần chính của thành tế bào ở tảo đỏ hay Rhodophyta, là một polysaccharide có chứa các đơn vị galactose lặp lại và 3,6-anhydrogalactose ở cả hai loại sulfat và không sulfat hóa [28]. Trong số đó, κ-carrageenan chiết xuất từ rong sụn Kappaphycus alvarezii thƣờng đƣợc sử dụng cho các ứng dụng rộng rãi trong khoa học thực phẩm, công nghệ dƣợc phẩm và nông nghiệp [29]. Trong cấu tạo của carrageenan gồm có D-Galactose (17 ÷ 31%) còn L- Galactose chiếm lƣợng rất nhỏ.
Do đó, carrageenan tạo thành chủ yếu bởi các mạch poly D-Galactose bị sulfat hoá có phân tử lƣợng 500 ÷ 700kDalton [30]. Cấu trúc hóa học của carrageenan Carrageenan là một polysaccharide dị thể của galactose –galactan. Ngoài mạch polysaccharide chính còn có thể có các nhóm sulfat đƣợc gắn vào carrageenan ở những vị trí và số lƣợng khác nhau. Vì vậy, carrageenan không chỉ là một polysaccharide đơn lẻ, có cấu trúc nhất định mà là các galactan sulfat.
Mỗi galactan sulfat là một dạng riêng của carrageenan và có ký hiệu riêng. Cấu trúc carrageenan Bằng phƣơng pháp cộng hƣởng từ hạt nhân phát hiện carrageenan có nhiều dạng cấu trúc hoá học khác nhau. Dựa vào cấu trúc hoá học, ngƣời ta có thể phân carrageenan thành các loại nhƣ sau: mu, kappa, nu, iota, lamda, theta và xi. Các loại này chỉ khác nhau ở mức độ sulfat hoá, vị trí sulfat hoá, mức độ dehydrat hoá của chuỗi polysacharid.
Khối lƣợng phân tử của đại phân tử 14 carrageenan khoảng từ 105 đến 106 phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu và quá trình chiết [32], [33], [34], [35]. Về cơ bản carrageenan chia thành 3 loại chính: κ-car, ι -car, λ -car. Trong đó, κ-car chiếm thị phần lớn nhất (80%). Mu và Nu là chất ban đầu tổng hợp nên kappa và iota, việc chuyển đổi này là do enzym dekinkase có trong rong biển hay trong quá trình sản xuất khi dùng xúc tác để loại nhóm 6 sulfat [30].
* κ-carrageenan: là một loại polymer mạch ngắn, có cấu tạo xen kẽ giữa D- galactose-4-sulfat (GalS) và 3,6 anhydro D-galactose (GalA) (Hình 1. Cấu trúc phân tử của κ-car là vòng xoắn kép bậc III. Cấu trúc của κ-carrageenan *ι -carrageenan : là một loại car có số lƣợng gốc sulfat nằm trung gian giữa số lƣợng gốc sulfat của κ-car và λ -car (Hình 1. Khi tạo gel, khối gel của ι -car có tính đàn hồi tốt hơn khối gel của các loại carrageenan khác.
Cấu trúc của ι –carrageenan 15 *λ -carrageenan: Trong mạch phân tử gồm các đơn vị monomer gồm: D- galactose-2-sulfat (1,3) và D-Galactose-2-6-disulfat nối xen kẽ với nhau (Hình 1. Cấu trúc của λ -carrageenan Các loại carrageenan đều có tính đa phân tán, nhƣng chúng chỉ khác nhau về thành phần sulfat ester và gốc quay quang. λ -Car có khối lƣợng phân tử cao và mạch dài hơn κ-Car. Thành phần của phân đoạn này cũng phụ thuộc vào nhiệt độ chiết và loại rong nguyên liệu [30], [35], [36].
Sự khác nhau của các loại carrageenan trên ở vị trí và số lƣợng nhóm ester sulfat đính vào chuỗi polysacharide, do đó mỗi loại có tính chất vật lý và hoá học đặc trƣng khác nhau. Tính chất lí hóa carrageenan Khả năng phản ứng hóa học của carrageenan phụ thuộc chủ yếu vào các nhóm este sulfat. Carrageenan là anion mạnh có thể so sánh với chất vô cơ. Liên kết cation cùng với cấu trúc của đƣờng các đơn vị trong chuỗi polyme xác định thuộc tính vật lý của carrageenan.
Ví dụ: kappa- và iota- carrageenan tạo thành gel khi có của các ion kali hoặc canxi trong khi lamda- carrageenan thì không [37]. Chức năng của carrageenan trong các ứng dụng khác nhau phụ thuộc phần lớn vào tính chất lƣu biến. Carrageenan dạng polyme mạch thẳng, tan trong nƣớc, thƣờng tạo thành các dung dịch nƣớc có độ nhớt cao.