Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o Bé n«ng nghiÖp vµ PTNT Trêng ®¹i häc l©m nghiÖp NguyÔn thÞ thuú D¬ng Nghiªn cøu nh©n gièng mét sè dßng tÕch (Tectona grandis Linn) b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro LuËn v¨n th¹c sÜ khoa häc L©m nghiÖp Hà T©y 2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o Bé n«ng nghiÖp vµ PTNT Trêng ®¹i häc l©m nghiÖp NguyÔn thÞ thuú D¬ng Nghiªn cøu nh©n gièng mét sè dßng tÕch (Tectona grandis Linn) b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro Chuyªn ngµnh: L©m häc M· sè: 60.60 LuËn v¨n th¹c sÜ khoa häc L©m nghiÖp Ngêi híng dÉn: T.S Hµ huy thÞnh Hà T©y 2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lêi nãi ®Çu N©ng cao chÊt lîng ®µo t¹o b»ng nghiªn cøu khoa häc lµ môc tiªu quan träng trong viÖc ®µo t¹o cao häc cña Trêng ®¹i häc L©m nghiÖp. §Ó hoµn thµnh ch¬ng tr×nh ®µo t¹o Cao häc L©m nghiÖp kho¸ häc 2005- 2007, ®îc sù ®ång ý cña Khoa sau ®¹i häc - Trêng §¹i häc L©m nghiÖp, t«i thùc hiÖn ®Ò tµi tèt nghiÖp: "Nghiªn cøu nh©n gièng mét sè dßng TÕch (Tectona grandis Linn) b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro”. §îc sù nhÊt trÝ cña Ban l·nh ®¹o Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng, ®Ò tµi ®îc thùc hiÖn t¹i phßng nghiªn cøu nu«i cÊy m« - Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng. §Ó ®¹t ®îc kÕt qu¶ trong häc tËp vµ hoµn thµnh luËn v¨n tèt nghiÖp nµy, t¸c gi¶ ®· nhËn ®îc sù quan t©m vµ gióp ®ì tËn t×nh vÒ nhiÒu mÆt cña Trêng ®¹i häc L©m nghiÖp, ®Æc biÖt lµ Khoa sau ®¹i häc, cïng tÊt c¶ c¸c thÇy c« gi¸o trùc tiÕp gi¶ng d¹y, còng nh l·nh ®¹o Trung t©m nghiªn cøu gièng c©y rõng.
Cho phÐp t«i ®îc bµy tá lßng biÕt ¬n ch©n thµnh ®Õn c¸c thÇy, c« gi¸o, ®Æc biÖt lµ T.S Hµ Huy ThÞnh vµ Th.S §oµn ThÞ Mai, toµn thÓ c¸n bé c«ng nh©n viªn t¹i trung t©m ®· tËn t×nh híng dÉn, chØ b¶o gióp ®ì t«i hoµn thµnh b¶n luËn v¨n nµy. Trong b¶n luËn v¨n nµy kh«ng thÓ tr¸nh khái nh÷ng khiÕm khuyÕt, rÊt mong ®îc sù chØ b¶o bæ sung ý kiÕn cña c¸c nhµ khoa häc, c¸c b¹n ®ång nghiÖp ®Ó c«ng tr×nh nghiªn cøu nµy ®îc hoµn thiÖn. T«i xin ch©n thµnh c¶m ¬n! Hµ T©y, Ngµy 25/09/2007 T¸c gi¶ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1 §Æt vÊn ®Ò Theo quyÕt ®Þnh cña thñ tíng chÝnh phñ (Q§ sè 17/2006/N§-TTg), ®Õn n¨m 2020 chóng ta ph¶i t¹o ra c¸c gièng c©y trång, vËt nu«i… cã n¨ng suÊt cao, chÊt lîng vµ hiÖu qu¶ kinh tÕ cao phôc vô tèt nhu cÇu chuyÓn ®æi c¬ cÊu kinh tÕ trong lÜnh vùc N«ng nghiÖp vµ Ph¸t triÓn n«ng th«n. Mét trong nh÷ng nhiÖm vô cña ngµnh L©m nghiÖp lµ “ph¸t triÓn vi nh©n gièng vµ ®¸p øng ®ñ nhu cÇu vÒ gièng c©y L©m nghiÖp vµo n¨m 2015” [16].
TÕch lµ loµi sinh trëng nhanh cã biªn ®é sinh th¸i réng h¬n n÷a gç TÕch ®îc sö dông phæ biÕn trong x©y dùng vµ lµm ®å gç gia dông v× cã kh¶ n¨ng chèng mèi mät, chÞu níc l©u ngµy, mÆt gç cã ®é bãng cao. Trong c«ng nghiÖp chÕ biÕn gç: TÕch lµ loµi c©y cã chÊt lîng gç mÞn cã thÓ bãc t¸ch thµnh tÊm máng. Do gç TÕch cã tû träng nhÑ, Ýt bÞ hµ b¸m, chÞu va ®Ëp vµ ng©m níc mÆn nªn ®îc dïng trong c«ng nghiÖp ®ãng tµu. MÆt kh¸c, nhu cÇu th¬ng m¹i cña gç TÕch ngµy cµng t¨ng bëi nã cã thÓ thay thÕ mét sè loµi gç quý kh¸c[42].
C©y TÕch ®îc trång th¨m dß ë níc ta vµo kho¶ng nh÷ng n¨m 30 cña thÕ kû 20. Lóc ®Çu, c©y TÕch ®îc trång thö ë c«ng viªn hoÆc trªn ®êng phè t¹i nhiÒu tØnh nh: Hµ Giang, Tuyªn Quang, S¬n La, Lai Ch©u, Hµ Néi, §¾c L¾c, §ång Nai, T©y Ninh, Sµi Gßn… Còng trong thêi gian nµy chØ riªng ë Léc Ninh, TØnh B×nh Phíc ®· g©y trång TÕch thµnh nh÷ng khu rõng nhá. Vµo nh÷ng n¨m 60, víi nguån gièng thu h¸i tõ Léc Ninh ®· trång thµnh c«ng mét khu rõng TÕch 200 ha t¹i §Þnh Qu¸n, tØnh §ång Nai vµ mét khu rõng TÕch 5 ha t¹i Eak – Mat, tØnh §¾c L¾c. Sau n¨m 1975, c©y TÕch ®îc trång më réng ë nhiÒu l©m trêng trong c¸c tØnh miÒn §«ng Nam Bé vµ T©y Nguyªn nh: §ång Nai, B×nh Phíc, T©y Ninh, §¾c L¾c, Gia Lai, Kom Tum…Nhng do cha cã gièng ®îc c¶i thiÖn nªn chÊt lîng rõng kh«ng cao, n¨ng suÊt rõng trång TÕch ë níc ta cßn thÊp (9 – 12m3/ n¨m) [17].
HiÖn nay, diÖn tÝch rõng TÕch trång míi cña c¸c níc trªn thÕ giíi mçi n¨m t¨ng nhanh, nhiÒu nhÊt lµ ë Indonesia kho¶ng 1.760 ngh×n ha, Ên §é kho¶ng 2.450 ngh×n ha, Myanmar lµ 139 ngh×n ha, Malaysia kho¶ng 4 ngh×n ha, Th¸i Lan lµ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2 836 ngh×n ha [29]. ë ViÖt Nam, diÖn tÝch trång TÕch chØ ®¹t 1.500 ha, rÊt Ýt so víi c¸c níc trong khu vùc do nhiÒu nguyªn nh©n kh¸c nhau mµ thiÕu gièng ®îc c¶i thiÖn lµ mét trong nh÷ng nguyªn nh©n quan träng. ChÝnh v× thÕ c«ng t¸c chän t¹o vµ nh©n gièng mét sè dßng tÕch cã n¨ng suÊt cao lµ vÊn ®Ò cÇn thiÕt. HiÖn nay, c©y gièng s¶n xuÊt tõ h¹t ®îc sö dông phæ biÕn nhng kh«ng ®¸p øng ®îc nhu cÇu trång rõng do kh«ng cã rõng gièng chuyªn canh, h¹t gièng thu h¸i x« bå nªn phÈm chÊt h¹t kÐm.
H¬n n÷a c¸ch nh©n gièng nµy cßn g©y ra hiÖn tîng ph©n ly tÝnh tr¹ng v× thô phÊn tù do lµm cho c©y trång kh«ng ®ång ®Òu dÉn ®Õn n¨ng suÊt rõng biÕn ®éng. Mét khã kh¨n n÷a lµ n¨ng suÊt h¹t trªn mét c©y còng rÊt thÊp (1 ha rõng 15 tuæi chØ cho kho¶ng 50 kg h¹t). Kh«ng nh÷ng thÕ, h¹t TÕch trong tù nhiªn cã kh¶ n¨ng n¶y mÇm thÊp, trong vên ¬m tû lÖ n¶y mÇm còng kh«ng cao, chØ ®¹t kho¶ng 5-10% [28] [42]. §Ó kh¾c phôc nh÷ng nhîc ®iÓm trªn th× gi¶i ph¸p nh©n gièng sinh dìng ngµy cµng ®îc quan t©m.
Tuy nhiªn ®èi víi loµi TÕch th× ph¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh b»ng hom còng gÆp nhiÒu khã kh¨n do tû lÖ ra rÔ kh«ng cao chØ ®¹t kho¶ng 24-30% [3]. ChÝnh v× nh÷ng lý do trªn nªn gi¶i ph¸p nh©n gièng sinh dìng b»ng nu«i cÊy m« tÕ bµo ®ang ®îc quan t©m nghiªn cøu. Nh©n gièng b»ng kü thuËt nu«i cÊy m« tÕ bµo, cßn gäi lµ nh©n gièng in vitro, lµ ph¬ng ph¸p s¶n xuÊt c©y con tõ chåi vît cña c©y mÑ b»ng c¸ch nu«i cÊy chóng trong èng nghiÖm, ë ®iÒu kiÖn v« trïng tuyÖt ®èi víi m«i trêng thÝch hîp vµ cã thÓ kiÓm so¸t trong ®iÒu kiÖn hoµn c¶nh ®ång nhÊt. Nu«i cÊy m« tÕ bµo cã thÓ nh©n nhanh víi sè lîng c©y con lín trong mét kho¶ng thêi gian ng¾n, ®îc tiÕn hµnh trong ®iÒu kiÖn phßng thÝ nghiÖm nªn hoµn toµn chñ ®éng trong s¶n xuÊt.
Ngoµi ra, kü thuËt nµy cßn gióp chóng ta cã thÓ t¹o ra gièng míi, t¹o nguån c©y s¹ch bÖnh, t¹o ra c©y con cã ®é ®ång ®Òu cao vµ duy tr× ®îc nh÷ng ®Æc tÝnh tèt nhÊt cña c©y mÑ. Tõ nh÷ng lý do trªn ®Ò tµi “Nghiªn cøu nh©n gièng mét sè dßng TÕch b»ng ph¬ng ph¸p nu«i cÊy in vitro” ®îc tiÕn hµnh. §©y lµ mét néi dung trong ®Ò tµi cÊp bé “Nghiªn cøu tuyÓn chän vµ nh©n gièng Xoan ta vµ TÕch cã n¨ng suÊt cao”. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3 Ch¬ng 1 Tæng quan vÊn ®Ò nghiªn cøu 1.
Kh¸i niÖm vµ c¬ së khoa häc cña ph¬ng ph¸p nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt 1. Kh¸i niÖm Nh©n gièng b»ng nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt hay cßn gäi lµ vi nh©n gièng lµ ph¬ng ph¸p s¶n xuÊt hµng lo¹t c©y con tõ chåi non cña c©y (c¬ quan, m« tÕ bµo) b»ng c¸ch nu«i cÊy chóng trong èng nghiÖm ë c¸c ®iÒu kiÖn v« trïng tuyÖt ®èi víi m«i trêng thÝch hîp vµ ®îc kiÓm so¸t. ThuËt ng÷ “nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt” hay “nu«i cÊy in vitro” lµ ph¹m trï kh¸i niÖm chØ tÊt c¶ c¸c lo¹i nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo ë ®iÒu kiÖn v« trïng, bao gåm: Nu«i cÊy c©y: nu«i cÊy thùc vËt. Nu«i cÊy c¸c bé phËn ®· ®îc t¸ch khái thùc c¬ thÓ thùc vËt: nu«i cÊy c¬ quan Nu«i cÊy c¸c ph«i thµnh thôc hay cha thµnh thôc ®· ®îc t¸ch khái c¬ thÓ thùc vËt: nu«i cÊy ph«i.
Nu«i cÊy m« b¾t nguån tõ c¬ quan thùc vËt: nu«i cÊy m« hay nu«i cÊy m« sÑo. Nu«i cÊy tÕ bµo ®¬n lÎ hay c¸c côm tÕ bµo rÊt nhá trong m«i trêng láng. Nu«i cÊy tÕ bµo thùc vËt sau khi ®· t¸ch bá vá tÕ bµo, cßn gäi lµ nu«i cÊy tÕ bµo trÇn (protoplast) [14]. C¬ së khoa häc cña cña nu«i cÊy m« tÕ bµo * TÝnh toµn n¨ng (totipotence) N¨m 1902 lÇn ®Çu tiªn nhµ thùc vËt häc ngêi §øc Haberlandt ®· ®a ra quan niÖm: “Mçi tÕ bµo bÊt kú (®· biÖt ho¸) lÊy tõ mét c¬ thÓ thùc vËt ®Òu cã kh¶ n¨ng tiÒm tµng ®Ó cã thÓ ph¸t triÓn thµnh mét c¬ thÓ hoµn chØnh”.
Theo LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4 quan niÖm cña sinh häc hiÖn ®¹i th× mçi tÕ bµo riªng rÏ ®· biÖt ho¸ ®Òu chøa toµn bé th«ng tin di truyÒn (ADN) cÇn thiÕt cña c¬ thÓ ®ã, nÕu gÆp ®iÒu kiÖn thÝch hîp th× mçi tÕ bµo ®Òu cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn thµnh mét c¬ thÓ hoµn chØnh, ®ã lµ tÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo thùc vËt. TÝnh toµn n¨ng cña tÕ bµo chÝnh lµ c¬ së lý luËn cña nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËy. Cho ®Õn nay, con ngêi ®· hoµn toµn chøng minh ®îc kh¶ n¨ng t¸i sinh mét c¬ thÓ thùc vËt hoµn chØnh tõ mét tÕ bµo riªng rÏ. * Sù ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n ho¸ tÕ bµo C¬ thÓ thùc vËt trëng thµnh lµ mét chØnh thÓ thèng nhÊt bao gåm nhiÒu c¬ quan chøc n¨ng kh¸c nhau, trong ®ã cã nhiÒu lo¹i tÕ bµo kh¸c nhau thùc hiÖn c¸c chøc n¨ng cô thÓ kh¸c nhau.
Tuy nhiªn, tÊt c¶ c¸c lo¹i tÕ bµo ®ã ®Òu b¾t nguån tõ tÕ bµo ph«i sinh. Sù ph©n ho¸ tÕ bµo lµ sù chuyÓn ho¸ c¸c tÕ bµo ph«i sinh thµnh c¸c tÕ bµo cña c¸c m« chuyªn ho¸ ®¶m nhËn c¸c chøc n¨ng kh¸c nhau cña c¬ thÓ. Qu¸ tr×nh ph©n ho¸ cã thÓ biÓu thÞ nh sau: Ph©n ho¸ TÕ bµo ph«i sinh TÕ bµo d·n TÕ bµo chuyªn ho¸ Ph¶n ph©n ho¸ S¬ ®å 1.1: Qu¸ tr×nh ph©n ho¸ vµ ph¶n ph©n ho¸ tÕ bµo Qu¸ tr×nh nµy gåm cã c¸c giai ®o¹n - Sù ph©n chia tÕ bµo: Qu¸ tr×nh ph©n chia tÕ bµo x¶y ra trong m« ph©n sinh lµm cho sè lîng tÕ bµo t¨ng lªn mét c¸ch ®¸ng kÓ. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5 - Sù d·n tÕ bµo: TÕ bµo d·n ra c¶ vÒ chiÒu ngang vµ chiÒu däc lµm t¨ng kÝch thíc cña tõng c¬ quan nãi riªng vµ toµn bé c¬ thÓ nãi chung.