Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Khoai lang (Ipomoea batatas L.) là một trong những cây lương thực truyền thống quan trọng tại Việt Nam, xếp thứ ba về diện tích và sản lượng sau lúa và ngô. Số liệu từ Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho biết sản lượng khoai lang hàng năm của cả nước đạt khoảng 1,2 đến 1,5 triệu tấn. Trong các nhóm giống đang được gieo trồng, khoai lang Nhật có giá trị thương phẩm và dinh dưỡng cao, thịt củ ngọt đậm, màu sắc bắt mắt và được thị trường ưa chuộng, mang lại hiệu quả kinh tế đáng kể cho người sản xuất.

Tuy nhiên, tập quán nhân giống vô tính truyền thống bằng dây (hom) hoặc củ qua nhiều thế hệ canh tác đã làm phát sinh tình trạng thoái hóa giống nghiêm trọng, tích lũy sâu bệnh và lây nhiễm các chủng virus gây hại. Trong đó, nguy hiểm nhất là bệnh khảm lá đốm lông chim do Sweet Potato Feathery Mottle Virus (SPFMV, hay virus chân chim) gây ra. Bệnh dẫn đến hiện tượng lá khảm vàng, phiến lá co rút, vỏ củ nứt rạn sần sùi, ruột củ xốp và suy giảm nghiêm trọng năng suất cũng như chất lượng thương phẩm. Phương pháp nhân giống truyền thống không thể loại trừ triệt để virus và không đáp ứng được nhu cầu cung cấp số lượng lớn cây giống đồng đều, sạch bệnh cho sản xuất quy mô lớn.

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Hoàng Vạn Kim hướng tới mục tiêu: Nhân giống cây khoai lang Nhật (Ipomoea batatas L.) sạch bệnh SPFMV bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.

Nhiệm vụ nghiên cứu được xác định gồm 3 nội dung chính:

  1. Tạo nguồn vật liệu khởi đầu sạch bệnh SPFMV thông qua sàng lọc bằng kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp khử trùng bề mặt mô cấy.
  2. Thiết lập môi trường dinh dưỡng và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho quá trình nhân nhanh chồi in vitro.
  3. Xác định môi trường và tỷ lệ phối hợp chất điều hòa sinh trưởng tối ưu nhằm kích thích ra rễ và kéo dài thân để tái sinh cây hoàn chỉnh.

Đối tượng nghiên cứu là giống khoai lang Nhật. Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 03/2023 đến tháng 07/2023 tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường (các thí nghiệm nuôi cấy mô) và Phòng Sinh học phân tử, Công nghệ gen và tế bào (thí nghiệm RT-PCR), Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

Nghiên cứu được xây dựng trên cơ sở lý thuyết về nuôi cấy mô tế bào thực vật (tính toàn năng của tế bào thực vật, sự phát sinh hình thái in vitro dưới tác động của tỷ lệ auxin/cytokinin) và sinh học phân tử virus thực vật:

  • Cơ chế tác động của chất điều hòa sinh trưởng: Cytokinin (cụ thể là BA - 6-benzylaminopurine) có chức năng hoạt hóa sự phân chia tế bào, kích thích bật mầm ngủ và phát sinh chồi bên. Auxin (cụ thể là NAA - 1-naphthaleneacetic acid) kích thích sự phân chia tế bào tầng phát sinh và khởi tạo mầm rễ. Gibberellin (GA3) có vai trò thúc đẩy sự kéo dài lóng, vươn cao thân thông qua cơ chế nới lỏng thành tế bào.
  • Đặc điểm tác nhân gây bệnh: Virus SPFMV thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae, dạng sợi mềm kích thước khoảng 12 × 810–865 nm, hệ gen là phân tử RNA sợi đơn dương (~10 kb) bao bọc bởi vỏ capsid protein (~36 kDa), truyền lan chủ yếu qua rệp muội (Aphididae) hoặc vết thương cơ giới và nguồn giống nhiễm bệnh.
  • Nguyên lý chẩn đoán phân tử: Ứng dụng kỹ thuật phiên mã ngược kết hợp phản ứng chuỗi polymerase (RT-PCR) để tổng hợp cDNA từ RNA tổng số của mô lá khoai lang, sau đó khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của SPFMV nhằm phát hiện chính xác mẫu sạch bệnh ở mức độ phân tử.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quy trình thực nghiệm được triển khai tuần tự qua 5 thí nghiệm chuyên biệt:

  • Thí nghiệm 1 (Giám định virus bằng RT-PCR): Tách chiết RNA tổng số từ 10 mẫu lá (gộp thành 2 mẫu gộp, mỗi mẫu gồm 5 cá thể) bằng bộ kít Biobasic EZ-10 Spin Column Plant RNA Miniprep Kit. Tổng hợp cDNA bằng kít Bioline SensiFAST cDNA Synthesis. Phản ứng PCR One-step sử dụng cặp mồi đặc hiệu SPFMV-F (5’-GGATTAYGGTGTTGACGACACA-3’) và SPFMV-R (5’-TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA-3’) khuếch đại đoạn phân tử kích thước 589 bp. Chu trình luân nhiệt gồm biến tính ban đầu ở 95°C (2 phút); 35 chu kỳ gồm 95°C (30 giây), 55°C (30 giây), 72°C (40 giây); kéo dài cuối cùng ở 72°C (10 phút). Sản phẩm được điện di trên gel agarose 1,5% nhuộm GelRed, chạy trong đệm TBE 0,5X ở điện áp 100V trong 30 phút và quan sát dưới ánh sáng UV.
  • Thí nghiệm 2 (Khử trùng tạo vật liệu khởi đầu): Đốt thân mang mắt ngủ lấy từ chồi nách được rửa sạch, lau cồn 70°, ngâm xà phòng 30 phút. Trong tủ cấy vô trùng, xử lý bề mặt bằng cồn 70° (40 giây), sau đó khử trùng bằng dung dịch $\text{HgCl}_2$ 0,1% (khảo sát ở 5, 7, 9, 11 phút) hoặc $\text{NaOCl}$ (Javel) 5% (khảo sát ở 10, 15, 20, 25 phút). Cấy lên môi trường nền MS chứa 20 g/l saccharose, 7 g/l agar, pH 5,8 ± 0,1.
  • Thí nghiệm 3 (Nhân nhanh chồi): Đoạn chồi đơn dài khoảng 7 mm được cấy vào môi trường MS bổ sung 20 g/l saccharose, 7 g/l agar kết hợp BA ở 5 mức nồng độ: 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l.
  • Thí nghiệm 4 (Tạo rễ in vitro): Chồi dài 7 mm cấy trên môi trường MS bổ sung 20 g/l saccharose, 7 g/l agar và NAA ở 5 mức nồng độ: 0,0; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7 mg/l.
  • Thí nghiệm 5 (Hoàn thiện cây hoàn chỉnh): Môi trường MS bổ sung 0,3 mg/l NAA, 20 g/l saccharose, 7 g/l agar kết hợp GA3 ở 4 mức nồng độ: 0,0; 0,1; 0,3; 0,5 mg/l.

Điều kiện nuôi cấy và xử lý số liệu

  • Môi trường được khử trùng ở 121°C, áp suất 1 atm trong 15 phút.
  • Phòng nuôi duy trì nhiệt độ 25 ± 2°C, cường độ chiếu sáng 1000–3000 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày.
  • Bố trí thí nghiệm theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) 1 yếu tố, lặp lại 3 lần. Dữ liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab 16, phân tích phương sai (One-way ANOVA) và so sánh sự khác biệt giữa các giá trị trung bình theo trắc nghiệm Tukey ở mức ý nghĩa $P < 0,05$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Đặt vấn đề

Chương này phân tích vị thế kinh tế của khoai lang Nhật tại Việt Nam, những hạn chế kỹ thuật của phương pháp nhân giống truyền thống và sự suy thoái giống do virus SPFMV. Trên cơ sở đó, tác giả xác định tính cấp thiết của việc xây dựng quy trình nhân giống in vitro sạch bệnh nhằm bảo tồn nguồn gen và cung ứng cây giống đồng đều cho sản xuất hàng hóa.

Chương 2. Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa các tài liệu khoa học về:

  • Phân loại học, nguồn gốc, hình thái thực vật, chu kỳ sinh trưởng của khoai lang và tình hình lưu giữ nguồn gen tại CIP cũng như tại Việt Nam (528 mẫu tại Trung tâm Tài nguyên Thực vật, 118 mẫu tại FCRI, 78 mẫu tại Trung tâm Hưng Lộc, 30 mẫu tại Đại học Nông Lâm TP.HCM). Giới thiệu 3 giống khoai lang Nhật phổ biến: HL518 (Nhật đỏ), KOKEY 14 (Nhật vàng), MURASA KIMASARI (Nhật tím).
  • Lịch sử và kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, vai trò của các nhóm chất điều hòa sinh trưởng (Auxin, Cytokinin), các yếu tố ngoại cảnh (nhiệt độ, quang chu kỳ, môi trường MS).
  • Tác nhân gây bệnh SPFMV: phân loại potyvirus, hình thái học, cơ chế lan truyền, triệu chứng trên lá và củ, cùng các phương pháp chẩn đoán như ELISA, RFLP và RT-PCR.

Chương 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết nguồn gốc vật liệu, địa điểm, thời gian thực hiện đề tài; mô tả chi tiết hóa chất, công thức môi trường nền, quy trình thao tác và sơ đồ bố trí 5 khối thí nghiệm thực nghiệm; định nghĩa các chỉ tiêu theo dõi (tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn %, tỷ lệ chết %, số chồi/mẫu, chiều cao chồi, số rễ/cây, chiều dài rễ) và phương pháp phân tích thống kê ANOVA đơn yếu tố.

Chương 4. Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày toàn bộ số liệu thu thập được qua 5 thí nghiệm, đối chiếu với các công bố khoa học trong và ngoài nước:

  • Xác nhận độ sạch virus của mẫu ban đầu bằng RT-PCR không xuất hiện vạch 589 bp.
  • Đánh giá hiệu quả khử trùng mô cấy giữa $\text{HgCl}_2$ và $\text{NaOCl}$, phân tích mối tương quan giữa thời gian xử lý với tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu chết.
  • Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ BA đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi sau 2 tuần.
  • Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NAA đến số lượng và chiều dài rễ sau 3 tuần.
  • Phân tích hiệu quả kết hợp giữa NAA và GA3 lên sự sinh trưởng đồng bộ của thân và rễ nhằm hoàn thiện cây giống in vitro sau 3 tuần nuôi cấy.

Chương 5. Kết luận và kiến nghị

Tổng kết các thông số kỹ thuật tối ưu rút ra từ thực nghiệm cho từng công đoạn nhân giống và đề xuất các hướng nghiên cứu mở rộng trong tương lai.

Kết quả và đóng góp

Kết quả thực nghiệm chính

1. Kiểm tra độ sạch bệnh bằng kỹ thuật RT-PCR

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR cho thấy các mẫu lá củ giống thử nghiệm không xuất hiện vạch khuếch đại ở vị trí 589 bp (tương đồng với đối chứng âm và khác biệt rõ rệt với đối chứng dương). Điều này chứng minh nguồn vật liệu khởi đầu hoàn toàn sạch bệnh SPFMV, đạt tiêu chuẩn đưa vào nuôi cấy vô trùng.

2. Kết quả khử trùng mẫu khởi đầu in vitro (sau 2 tuần theo dõi)

Chất khử trùng Nghiệm thức Thời gian (phút) Tỷ lệ nhiễm nấm, khuẩn (%) Tỷ lệ mẫu chết (%)
$\text{HgCl}_2$ 0,1% NT1 5 $66,67^\text{a}$ $66,67^\text{a}$
$\text{HgCl}_2$ 0,1% NT2 7 $58,33^\text{a}$ $66,67^\text{a}$
$\text{HgCl}_2$ 0,1% NT3 9 $8,33^\text{b}$ $16,67^\text{c}$
$\text{HgCl}_2$ 0,1% NT4 11 $0,00^\text{b}$ $41,67^\text{b}$
$\text{NaOCl}$ 5% NT1 10 $91,67^\text{a}$ $91,67^\text{a}$
$\text{NaOCl}$ 5% NT2 15 $58,33^\text{b}$ $58,33^\text{b}$
$\text{NaOCl}$ 5% NT3 20 $8,33^\text{c}$ $41,67^\text{c}$
$\text{NaOCl}$ 5% NT4 25 $0,00^\text{c}$ $66,67^\text{b}$

Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ($P < 0,05$).

Khử trùng bằng cồn 70° (40 giây) kết hợp $\text{HgCl}_2$ 0,1% trong 9 phút cho tỷ lệ sống sạch cao nhất (nhiễm 8,33%, chết 16,67%). Tuy nhiên, xử lý bằng $\text{NaOCl}$ 5% trong 20 phút (nhiễm 8,33%, chết 41,67%) được khuyến khích sử dụng trong quy trình sản xuất vì ít độc hại cho người thao tác, giá thành rẻ và chồi tái sinh có khả năng bật mầm sinh trưởng tốt hơn.

3. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến nhân nhanh chồi (sau 2 tuần nuôi cấy)

Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Số chồi trung bình/mẫu Chiều cao trung bình chồi (cm)
NT1 0,0 $1,00 \pm 0,00^\text{c}$ $0,51 \pm 0,02^\text{b}$
NT2 0,5 $2,05 \pm 0,13^\text{ab}$ $0,67 \pm 0,03^\text{a}$
NT3 1,0 $2,33 \pm 0,17^\text{a}$ $0,71 \pm 0,03^\text{a}$
NT4 1,5 $1,91 \pm 0,22^\text{ab}$ $0,43 \pm 0,01^\text{c}$
NT5 2,0 $1,77 \pm 0,25^\text{b}$ $0,49 \pm 0,02^\text{bc}$

Môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l BA, 20 g/l saccharose, 7 g/l agar cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 2,33 chồi/mẫu và chiều cao chồi đạt 0,71 cm. Nồng độ BA vượt quá 1,0 mg/l có xu hướng ức chế sự nhân chồi và làm giảm chiều cao chồi.

4. Ảnh hưởng của NAA đến sự phát triển rễ (sau 3 tuần nuôi cấy)

Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) Số rễ trung bình/cây Chiều dài trung bình rễ (cm) Chiều cao trung bình thân (cm)
NT1 0,0 $1,93 \pm 0,70^\text{c}$ $1,60 \pm 0,40^\text{c}$ $0,73 \pm 0,25^\text{c}$
NT2 0,1 $3,87 \pm 0,41^\text{ab}$ $2,53 \pm 0,15^\text{b}$ $1,23 \pm 0,45^\text{ab}$
NT3 0,3 $4,70 \pm 0,10^\text{a}$ $3,97 \pm 0,20^\text{a}$ $1,83 \pm 0,15^\text{a}$
NT4 0,5 $3,40 \pm 0,35^\text{b}$ $2,33 \pm 0,15^\text{b}$ $0,63 \pm 0,05^\text{c}$
NT5 0,7 $3,30 \pm 0,56^\text{b}$ $2,17 \pm 0,45^\text{bc}$ $0,97 \pm 0,15^\text{bc}$

Nồng độ 0,3 mg/l NAA trên nền MS kích thích ra rễ tối ưu (4,70 rễ/cây, rễ dài 3,97 cm, thân cao 1,83 cm). Tuy nhiên, cây phát triển thân lá chưa cân đối, chiều cao còn hạn chế.

5. Hiệu quả kết hợp giữa NAA và GA3 đến sự hoàn thiện cây (sau 3 tuần nuôi cấy)

Nghiệm thức Nồng độ GA3 (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) Số rễ trung bình/cây Chiều dài trung bình rễ (cm) Chiều cao trung bình thân (cm)
NT1 0,0 0,3 $4,70 \pm 0,10^\text{c}$ $3,97 \pm 0,21^\text{c}$ $1,83 \pm 0,15^\text{d}$
NT2 0,1 0,3 $4,23 \pm 0,15^\text{c}$ $3,80 \pm 0,20^\text{c}$ $2,20 \pm 0,10^\text{c}$
NT3 0,3 0,3 $5,00 \pm 0,15^\text{b}$ $4,37 \pm 0,06^\text{b}$ $2,90 \pm 0,10^\text{b}$
NT4 0,5 0,3 $5,73 \pm 0,55^\text{a}$ $4,80 \pm 0,17^\text{a}$ $3,20 \pm 0,15^\text{a}$

Sự kết hợp giữa 0,3 mg/l NAA và 0,5 mg/l GA3 trên nền môi trường MS (bổ sung 20 g/l saccharose, 7 g/l agar) tạo ra cây hoàn chỉnh đạt chất lượng vượt trội nhất: số rễ đạt 5,73 rễ/cây, chiều dài rễ đạt 4,80 cm và chiều cao thân đạt 3,20 cm, tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển cây ra đất.

Đóng góp của đề tài

  • Xác lập quy trình vi nhân giống hoàn chỉnh từ khâu kiểm định sinh học phân tử bằng RT-PCR đến tái sinh cây hoàn chỉnh cho giống khoai lang Nhật.
  • Đưa ra giải pháp khử trùng an toàn thay thế hợp chất độc hại $\text{HgCl}_2$ bằng $\text{NaOCl}$ (Javel) 5% trong 20 phút.
  • Chứng minh hiệu ứng hiệp đồng của việc bổ sung đồng thời auxin (NAA 0,3 mg/l) và gibberellin (GA3 0,5 mg/l) trong giai đoạn tạo cây in vitro hoàn chỉnh, giúp khắc phục nhược điểm lùn thân khi chỉ sử dụng NAA đơn lẻ.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Nghiên cứu mới chỉ thực hiện chẩn đoán và sàng lọc đối với một đối tượng virus là SPFMV, chưa đánh giá các tác nhân virus khác có thể tồn tại đồng thời trên khoai lang như Sweet Potato Chlorotic Stunt Virus (SPCSV) hay Sweet Potato Leaf Curl Virus (SPLCV).
  • Đề tài dừng lại ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh in vitro trong phòng thí nghiệm; chưa theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng, tỷ lệ sống và khả năng phát triển củ sau khi chuyển cây ra vườn ươm và đất trồng tự nhiên.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Mở rộng phạm vi xét nghiệm các chủng virus phổ biến khác trên khoai lang Nhật và các giống khoai lang kinh tế trước khi đưa vào quy trình vi nhân giống.
  • Nghiên cứu kết hợp BA với các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin hoặc auxin khác (như Kinetin, TDZ, IBA) nhằm nâng cao hơn nữa hệ số nhân chồi.
  • Hoàn thiện giai đoạn huấn luyện (ra ngôi) cây giống in vitro ngoài vườn ươm, xác định giá thể và chế độ chăm sóc tối ưu để đạt tỷ lệ sống cao nhất trước khi cung ứng ra đồng ruộng.
  • Kiểm tra lại độ sạch virus SPFMV trên cây con trước khi xuất vườn.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Khoa học Cây trồng, Nông học và Bảo vệ Thực vật.

Các nội dung có giá trị ứng dụng thực tiễn cao gồm:

  • Quy trình tách chiết RNA và thông số cặp mồi, chu trình nhiệt RT-PCR chẩn đoán SPFMV đặc hiệu kích thước 589 bp.
  • Bảng thông số khử trùng bề mặt mô cấy khoai lang sử dụng nước Javel 5% an toàn và dễ tiếp cận.
  • Công thức phối hợp môi trường nhân chồi (MS + 1,0 mg/l BA) và môi trường kích thích ra rễ đồng thời vươn thân (MS + 0,3 mg/l NAA + 0,5 mg/l GA3) có thể ứng dụng trực tiếp tại các phòng nuôi cấy mô thương mại.

Câu hỏi thường gặp

1. Kỹ thuật sinh học phân tử nào được tác giả sử dụng để sàng lọc bệnh virus SPFMV và sản phẩm PCR đặc hiệu có kích thước bao nhiêu bp?
Tác giả sử dụng kỹ thuật One-step RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu SPFMV-F và SPFMV-R để khuếch đại đoạn gen có kích thước 589 bp từ RNA tổng số của mẫu lá.

2. Tại sao tác giả khuyến khích sử dụng dung dịch NaOCl (Javel) 5% thay cho HgCl2 0,1% dù tỷ lệ chết mô của NaOCl cao hơn?
Mặc dù $\text{NaOCl}$ 5% trong 20 phút có tỷ lệ mẫu chết cao hơn (41,67% so với 16,67% của $\text{HgCl}_2$ 0,1% trong 9 phút), dung dịch Javel giúp chồi sau khử trùng bật mầm nhanh và phát triển tốt hơn, đồng thời có chi phí rẻ, dễ kiếm và ít độc hại cho sức khỏe con người cũng như môi trường.

3. Nồng độ BA tối ưu cho giai đoạn nhân nhanh chồi khoai lang Nhật là bao nhiêu và đạt kết quả như thế nào sau 2 tuần?
Nồng độ BA tối ưu là 1,0 mg/l (trên nền MS bổ sung 20 g/l saccharose và 7 g/l agar), đạt số chồi trung bình cao nhất là 2,33 ± 0,17 chồi/mẫu và chiều cao chồi đạt 0,71 ± 0,03 cm sau 2 tuần nuôi cấy.

4. Việc bổ sung GA3 vào môi trường ra rễ chứa 0,3 mg/l NAA mang lại tác dụng cụ thể gì cho cây in vitro?
Bổ sung thêm 0,5 mg/l GA3 vào môi trường MS chứa 0,3 mg/l NAA giúp cây tăng trưởng đồng đều cả về thân và rễ: số rễ đạt 5,73 rễ/cây, chiều dài rễ đạt 4,80 cm và chiều cao thân tăng từ 1,83 cm (ở nghiệm thức chỉ có NAA) lên 3,20 cm sau 3 tuần nuôi cấy.

5. Các số liệu thực nghiệm trong khóa luận được xử lý bằng phần mềm và phương pháp thống kê nào?
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Minitab 16, phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) và kiểm định phân hạng khác biệt trung bình theo phương pháp Tukey với mức ý nghĩa thống kê $P < 0,05$.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của Lê Hoàng Vạn Kim đã xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro cây khoai lang Nhật (Ipomoea batatas L.) sạch bệnh virus SPFMV từ nguồn mẫu được kiểm định bằng kỹ thuật RT-PCR. Nghiên cứu đã xác định được công thức khử trùng mô cấy an toàn bằng $\text{NaOCl}$ 5% trong 20 phút, môi trường nhân nhanh chồi tối ưu trên nền MS bổ sung 1,0 mg/l BA và môi trường hoàn thiện cây con vượt trội khi kết hợp 0,3 mg/l NAA với 0,5 mg/l GA3. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học và quy trình thực nghiệm tin cậy phục vụ công tác sản xuất giống khoai lang sạch bệnh chất lượng cao.