MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Chi Bình Vôi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania spp, đồng nghĩa: Perichasma) thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae hay còn gọi là Biển bức cát), là nhóm loài cây trong củ chứa nhiều hoạt chất có giá trị dược liệu cao và được dùng rộng rãi trong các bài thuốc dân gian. Bình vôi có vị hơi ngọt, pha đắng, tính mát ngoài tác dụng, thanh nhiệt, giải độc, điều hóa nhịp tim, tan ứ máu, hạ huyết áp, chữa dạ dày, chữa đau răng, chống viêm… và đặc biệt còn có tác dụng an thần nên được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh mất ngủ, bệnh trầm cảm… Bên cạnh đó Bình vôi còn được ghi nhận có tác dụng chữa và hỗ trợ chữa bệnh ung thư da và bệnh tiểu đường tuýp 2. Hợp chất hóa học quan trọng nhất trong củ bình vôi là Rotundin, tên hóa học là Tetrahydropalmatin (C21H25O4N), có tác dụng làm giảm đau, an thần rất hiệu quả với hàm lượng từ 0,12 đến 0,3% trong củ tươi.
Thuốc an thần và hỗ trợ giấc ngủ "Rotunda" được bào chế từ rotundin có nguồn gốc từ cây Bình vôi hiện đang được sử dụng rộng rãi trong quá trình điều trị và cải thiện các bệnh liên quan đến vấn đề giấc ngủ. Mặc dù vậy, việc phát triển nguồn/vùng nguyên liệu loài cây thuốc quý này chỉ mới được quan tâm trong thời gian gần đây nên nguồn cây Bình vôi hiện đang được sử dụng làm nguồn dược liệu chủ yếu là được khai thác từ tự nhiên. Mặt khác, do nhiều nguyên nhân mà cách thức khai thác chủ yếu đối với loài cây này là khai thác tận diệt với tốc độ khai thác ngày càng gia tăng để đáp ứng nhu cầu thị trường. Do đó trong tự nhiên, số lượng cây cũng như loài Bình vôi ngày càng khan hiếm cũng như mức độ phân bố ngày càng thu hẹp.
Vì vậy, Bình vôi đã được các nhà khoa học và quản lý đưa vào danh mục các loại thực vật có mức độ cực kì nguy cấp (CR), đặc biệt trong đó có một số loài được coi là loài quý hiếm cần được bảo tồn (Sách Đỏ Việt Nam, 1996). 1 Thông thường, Bình vôi được nhân giống từ hạt, tuy nhiên với nhu cầu hiện nay thì phương thức nhân giống này không đảm bảo số lượng, chất lượng cây giống cũng không đồng đều nên gây ảnh hưởng rất lớn đến việc quy hoạch trồng và phát triển loài cây có giá trị dược liệu cao này. Trong khi đó, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là kỹ thuật hiện đang được ứng dụng rộng rãi trong nhân giống nhiều loài cây trồng do nó có thể tạo ra số lượng lớn cây giống đồng đều, sạch bệnh trong thời gian ngắn và quan trọng hơn là mang đầy đủ phẩm chất di truyền tốt từ cây vật liệu gốc. Vì thế, kỹ thuật này hiện đang được áp dụng rộng rãi trong việc phát triển giống cây trồng có năng suất, chất lượng đã qua khảo nghiệm và đặc biệt đang được sử dụng phổ biến trên nhiều đối tượng Bình vôi Bình vôi gồm nhiều loài khác nhau nhưng hầu hết các loài đều có giá trị cao về dược liệu.
Hiện nay, đã có một số nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô được thực hiện cho một số loài Bình vôi khác nhưng tính đến thời điểm hiện tại chưa có thử nghiệm cho Bình vôi nhị ngắn (Stephania brachyandra Diels). Với mục đích nhân giống, bảo tồn, duy trì và phát triển nguồn gen loài cây này, luận văn “Nghiên cứu nhân giống cây Bình vôi nhị ngắn bằng (Stephania brachyadra Diels) phương pháp nuôi cấy mô” đã được thực hiện. Từ đó có thể đề xuất tiến hành các hoạt động phục vụ bảo tồn và phát triển nguồn gen loài cây này. Luận văn là một phần nội dung nghiên cứu của đề tài cấp tỉnh “Bảo tồn nguồn gen cây Bình vôi (Stephania brachyandra Diels, Stephania cepharantha Hayata) trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên” (Mã số QGT16.03/2021) do Trường Đại học Nông lâm thực hiện.
Mục tiêu nghiên cứu Hoàn thiện quy trình nhân giống cây Bình vôi nhị ngắn (Stephania brachyandra Diels) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen loài cây có giá trị cao này. Ý nghĩa của đề tài 3. Ý nghĩa khoa học Xây dựng cơ sở khoa học cho việc tiến hành các nghiên cứu về nuôi cấy mô cũng như nhân nhanh các giống Bình vôi khác nhằm phục vụ cho công tác bảo tồn và phát triển nguồn gen nhóm loài có giá trị dược liệu cao này. Ý nghĩa thực tiễn Xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho cây Bình vôi nhị ngắn, từ đó có thể tạo được số lượng lớn cây giống đồng đều, sạch bệnh phục vụ công tác bảo tồn và phát triển nguồn gen.
Qua quá trình thực hiện đề tài, học viên nâng cao các kiến thức về lĩnh vực liên quan, trau dồi thêm kinh nghiệm, kỹ năng tiến hành các nghiên cứu và xây dựng tác phong làm việc trong môi trường khoa học để phục vụ cho công tác sau khi tốt nghiệp. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Khái niệm, cơ sở khoa học và các yếu tố chính của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1. Khái niệm Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô (propagation by tissue culture) hay còn được gọi là vi nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in vitro cho các nguồn vật liệu ban đầu là các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây vật liệu gốc.
Với các ưu điểm như: có hệ số nhân lớn, không phụ thuộc quá nhiều vào điều kiện thời tiết, có thể cung cấp được số lượng lớn cây giống đồng đều, tương đối sạch bệnh nên nuôi cấy in vitro là phương pháp đang được sử dụng phổ biến trong nhân giống cây trồng đặc biệt là nhân giống cho các giống có năng suất, chất lượng cao phục vụ cho sản xuất, đồng thời cũng là phương pháp nhân giống khá phù hợp phục vụ cho công tác bảo tồn. Các bộ phận thường được sử dụng để làm nguồn nguyên liệu đầu vào cho quá trình nuôi cấy in vitro là các chồi bất định, chồi bên, chồi đỉnh, bao phấn, phôi hay các bộ phận khác như vỏ cây, lá non, thân mầm (hypocotyl). Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu được phát triển mạnh và ứng dụng mạnh mẽ từ những năm 1960s, đây là thời điểm mà các nhà khoa học đã nghiên cứu được môi trường nuôi cấy chuẩn có sự kết hợp với các chất điều hóa sinh trưởng tổng hợp như Auxin, Cytokinin… Qua đó đã nhân giống hàng loạt một số giống cây trồng có chất lượng di truyền được cải thiện từ đó rút ngắn thời gian thu hoạch cho một loạt các loài cây nông-lâm nghiệp như khoai tây, cà chua, keo, bạch đàn… Ở nước ta, phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật lần đầu được du nhập vào áp dụng trong nghiên cứu nhân giống một số loài cây trồng nông nghiệp tại các tỉnh phía Bắc từ những năm 1970. Trước những năm 1975, Nguyễn Văn 4 Uyển, Lê Thị Xuân, Lê Văn Cát đã bắt đầu những thí nghiệm nuôi cấy mô sẹo lúa và bao phấn protoplast thuốc lá và hiện tại hầu như các loài cây đã được hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Trải qua gần 40 năm nghiên cứu và ứng dụng, đã có rất nhiều giống cây trồng được nhân giống bằng phương pháp này trong nghiên cứu cơ bản cũng như áp dụng vào sản xuất với quy mô hàng triệu cây giống/năm. Các kỹ thuật hiện đang được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy in vitro có thể kể đến là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nuôi cấy mô sẹo (callus), nuôi cấy huyền phù tế bào, nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần, nuôi cấy phôi hữu tính và vô tính. Trong các kỹ thuật này, nuôi cấy mô cho chồi bên và chồi bất định do có hệ số nhân cao, không đòi hỏi nhiều trang thiết bị phù trợ và kỹ thuật phức tạp (Lê Đình Khả và Đoàn Thị Mai, 2002) nên được xác định những kỹ thuật chính được dùng một cách phổ biến trong nhân giống cây trồng nói chung và cây lâm nghiệp nói riêng. Hiện nay, sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật cùng với sự ra đời và phát triển mạnh mẽ của công nghệ gen (chuyển gen, chỉnh sửa gen) trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống, đặc biệt trong lĩnh vực nông nghiệp đã mở ra một hướng nghiên cứu và ứng dụng mới cho nền nông nghiệp thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng.
Với số lượng lớn các giống cây trồng có năng suất, chất lượng cao được tạo bằng các phương pháp này, nền nông nghiệp thế giới được ghi nhận là đang bước vào “Cuộc cách mạng xanh lần thứ 2”, đây là cuộc cách mạng đang và sẽ góp phần một tỷ lệ không nhỏ trong việc đảm bảo an ninh lương thực toàn cầu và đặc biệt là các nước đang phát triển. Cơ sở khoa học của của nuôi cấy mô tế bào 1. Tính toàn năng của tế bào thực vật Ngay từ khi bắt đầu được nghiên cứu và ứng dụng, các nhà khoa học đã xác định “Tính toàn năng của tế bào thực vật” là nguyên lý khoa học cơ bản và quan trọng nhất của toàn bộ các kỹ thuật trong phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Nguyên lý này dựa trên cơ sở khoa học của di truyền tế bào, theo đó phần lớn 5 thông tin di truyền của cá thể (bộ gen hay hệ gen - Genome) được lưu giữ đầy đủ và nguyên vẹn trong mỗi tế bào đơn lẻ của cá thể đó.
Tùy thuộc vào các giai đoạn sinh trưởng và phá triển của mình, dưới ảnh hưởng của các điều kiện môi trường mà các đặc điểm hình thái, giải phẫu của mỗi cá thể thực vật được biểu hiện ra kiểu hình cụ thể. Quá trình biểu hiện này là kết quả của quá trình phiên mã và giải mã các thông tin di truyền đã được mã hóa trong các gen quy định tính trạng đó. Do đó, đối với nhiều loài thực vật từ một cơ quan, mô hay tế bào khi gặp điều kiện thích hợp đều có khả năng để phát triển thành một cá thể mới hoàn chỉnh và mang đầy đủ những đặc tính di truyền giống như đã có trong bộ gen của cây mẹ (Đỗ Năng Vịnh, 2002). Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào Cơ thể trưởng thành của bất kỳ một loài sinh vật nào nói chung và của các loài thực vật nói chung là một chỉnh thể thống nhất trong đó tập hợp và bao gồm rất nhiều cơ quan, bộ phận đảm bảo thực hiện những chức năng khác nhau.