Đặt vấn đề Cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour. thuộc họ Tiết dê - Menispermaceae) là một loài dược liệu từ lâu đời đã được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị nhiều chứng bệnh. Cây Bình vôi là một loài phân bố phổ biến ở vùng Đông Á. Ở Việt Nam các loài Bình vôi phân bố khá rộng ở cả 3 miền, thường ưa mọc ở những vùng có núi đá vôi như: Thanh Hóa, Hà Giang, Tuyên Quang, Hòa Bình, Cao Bằng, Vũng Tàu… Đây là một loại dược liệu quý có tác dụng an thần, dưỡng huyết, thanh nhiệt, giải độc, giảm đau.
Thường sử dụng phần củ của cây để làm thành thuốc chữa các bệnh: mất ngủ, sốt nóng, nhức đầu, đau dạ dày, trị ho có đờm, hen suyễn, khó thở… Trong các loại dược chất có hoạt tính trong củ, L - tetrahydropalmatin (rotundin) được sử dụng là nguyên liệu chính để tạo ra thuốc điều trị an thần, mất ngủ. Tuy nhiên cây Bình vôi hoang dã ở Việt Nam đang bị sụt giảm mạnh do sự khai thác bừa bãi và không có kế hoạch trồng tái sinh, cây Bình vôi được ghi trong Sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (V) và Danh mục Thực vật rừng quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ [18]. Trong những thập kỷ vừa qua, công nghệ sinh học đã đem lại những thành quả to lớn, đặc biệt là công nghệ chuyển gen thực vật với kĩ thuật chuyển gen cho phép con người can thiệp đưa một hoặc một vài gen quý hiếm vào cơ thể thực vật tạo ra thực vật biến đổi gen nhằm thay đổi hoặc cải thiện một số đặc tính của thực vật theo hướng có lợi cho con người. Với nhiều công trình nghiên cứu thành công trong lĩnh vực này đã đem lại lợi ích cho ngành y học khi ứng dụng công nghệ chuyển gen đã giúp tăng mạnh gấp nhiều lần nồng độ dược chất quý vốn có trong các cây dược liệu, tránh cho việc khai thác quá mức nguồn dược liệu để làm thuốc phục vụ nhu cầu chữa bệnh.
Hàm lượng dược chất cụ thể là rotundin trong cây Bình vôi tự nhiên là rất thấp, tùy thuộc từng loài và điều kiện sinh thái. Vì vậy định hướng nghiên cứu 1 nhằm tăng hàm lượng rotundin ở cây Bình vôi đang rất được quan tâm. Có nhiều cách tiếp cận tăng sinh khối để khai thác dược chất quý từ cây dược liệu, trong đó có kỹ thuật biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme chìa khóa bằng cách chuyển gen mục tiêu sẽ làm tăng tổng hợp rotundin ở cây Bình vôi. Tuy nhiên, trên thế giới và Việt Nam chưa có công trình khoa học nào công bố về việc xây dựng được quy trình chuyển gen ở cây Bình vôi.
Do vậy việc nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây Bình vôi để làm cơ sở cho việc chuyển gen đích tăng tổng hợp rotundin ở cây Bình vôi là rất cần thiết. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu quy trình chuyển gen uidA vào cây Bình vôi (Stephania rotunada Lour.)” làm tiền đề cho việc xây dựng quy trình chuyển gen mục tiêu làm tăng hàm lượng rotudin ở cây Bình vôi. Mục tiêu đề tài Nghiên cứu điều kiện tối ưu chuyển gen uidA vào cây Bình vôi. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu mật độ vi khuẩn A.
tumefaciens mang gen uidA phù hợp cho chuyển gen ở cây bình vôi. - Nghiên cứu nồng độ Acetosyringone phù hợp cho việc chuyển gen ở cây Bình vôi. - Nghiên cứu thời gian nhiễm khuẩn A. tumefaciens mang gen uidA phù hợp cho việc chuyển gen vào cây Bình vôi.
- Nghiên cứu thời gian đồng nuôi cấy phù hợp cho chuyển gen ở cây Bình vôi. - Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ kanamycin đến hiệu quả chọn lọc chồi và tái sinh in vitro ở cây chuyển gen. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cây Bình vôi 1.
Nguồn gốc, phân loại Chi Bình vôi hay chi Thiên kim đằng (danh pháp khoa học: Stephania, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có nguồn gốc ở miền đông và nam Châu Á. Chi Bình vôi trên thế giới có khoảng trên 45 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới ở các nước như Trung Quốc, Đông Nam Á, Úc, Ấn Độ, Châu Phi. Ở nước ta có khoảng từ 14 - 16 loài. Những loài Bình vôi hiện có ở nước ta khá đa dạng và phong phú.
Chúng sinh trưởng trong nhiều loại hình thảm thực vật, trên núi đá vôi, trên đất lẫn đá, và trên cát ven biển ở một số địa phương, cụ thể chúng phân bố khá rộng trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam. Nhưng thường tập trung hơn ở các vùng núi đá vôi: Tuyên Quang, Hoà Bình, Cao Bằng, Thanh Hoá, Lâm Đồng, Lạng Sơn, Lào Cai,… Một số loài đã được công bố có ở Việt Nam: Stephania rotunda Lour. Về mặt phân loại, cây Bình vôi được phân loại khoa học trong hệ thống giới Thực vật như sau : Giới (genum): Plantea Ngành: Magloliophyta Phân lớp: Magloliosida (Dicotyedones) Bộ (ordo): Ranunculales Họ (familia): Menispermaceae Chi (genus): Stephania 3 Tên thường gọi khác ở Việt Nam của loài Stephania rotunada Lour: củ Một, củ Ngếch, củ Thiên đầu thống, củ Ngải tượng, củ Mối tròn [6]. Đặc điểm sinh học cơ bản của cây Bình vôi Các cây trong chi Bình vôi đều là dây leo, sống lâu năm hoặc hàng năm.
Ở giai đoạn còn non thì thân thường nhẵn, màu xanh bóng hoặc xanh đậm. Giai đoạn già thân thường có những rãnh dọc, có những mụn cóc màu nâu xám, nâu đen hoặc nâu đất. Rễ dạng sợi hoặc phình to tạo thành rễ củ. Cụ thể, theo Phạm Thanh Kỳ và cs (1998) các loại Bình vôi có đặc điểm chung như sau: thuộc dạng thân leo, nhẵn, thường xanh, gốc hóa gỗ, sống lâu năm [6].
Cây Bình vôi Rễ phình to thành củ rất đa dạng thường có dạng hình cầu, hình trụ nặng khoảng 0,5 đến 2 kg nhưng có loài rất to (nặng trên 40 kg) vỏ ngoài xù xì màu nâu, nâu đen, hình dáng củ thay đổi tùy theo nơi cây sinh trưởng [6]. Cuống lá Bình vôi dài, đính vào phiến lá khoảng 1/3 chiều dài lá. Lá mọc cách, phiến lá mỏng, hai mặt nhẵn, hình tim hoặc gần như tròn có cạnh hoặc tam giác tròn, mép lá nguyên hoặc hơi chia thùy, gân lá xuất phát từ chỗ đính của cuống lá, nổi rõ ở mặt dưới lá, gân lá dạng chân vịt. Màu sắc của phiến lá tùy thuộc từng loài, thường là xanh nhạt, xanh vàng nhạt, xanh bóng hoặc xanh đậm [6].
Mặt trước và sau lá cây Bình vôi Cây Bình vôi có hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa hình xim tán mọc ở kẽ lá hoặc ở những cành già đã rụng lá; hoa đực và hoa cái khác gốc; hoa đực có 6 lá đài xếp thành hai vòng, 3 cánh hoa màu vàng cam; bộ nhị liền thành một trục với 6 bao phấn màu vàng nhạt xếp thành vòng tròn. Khi hoa nở các bao phấn mở nắp ngang quay ra xung quanh. Hạt phấn nhỏ màu vàng; hoa cái có một lá đài; hai cánh hoa, bầu hoa có hình trứng [6].
Quả của cây Bình vôi là dạng hạch hình cầu hơi dẹt, khi chín có màu đỏ hoặc da cam, hạt cứng hình móng ngựa, hình trứng hoặc hình gần tròn tùy theo loài. Bầu 2 noãn, nhưng chỉ có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, nhẵn bóng. Mùa hoa vào tháng 2 - 6, mùa quả vào tháng 7 - 10 [6]. Chi Bình vôi rất đa dạng về hình thái, sự đa dạng, phong phú này phụ thuộc vào điều kiện đất đai, khí hậu nơi cây sinh sống, phát triển và phụ thuộc vào đặc tính của tùy từng loài.
Một số tác dụng và hiện trạng khai thác cây Bình vôi Từ lâu củ Bình vôi đã được sử dụng như một loại thuốc nam có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe và được nhân dân ta sử dụng để chữa một số bệnh như mất ngủ, an thần, hen suyễn, kiết lỵ, lao, đau dạ dày,. Cây Bình vôi chứa nhiều hoạt chất có giá trị về dược liệu. Trong củ Bình vôi chứa một lượng chất alkaloid L- tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin. Những hợp chất này được sử dụng phổ biến để điều chế các loại thuốc, đặc biệt là thuốc an thần [9].
5 Ở Việt Nam có nhiều loài Bình vôi khác nhau, do đó ở mỗi loài lại cho một số thành phần alkaloid khác nhau. Trên thực nghiệm, chất L - tetrahydropalmatin của Bình vôi và hỗn hợp alkaloid chiết xuất từ một số loài Bình vôi có tác dụng an thần, chống co giật, hạ huyết áp, hạ sốt… [9]. Bình vôi được sử dụng làm dược liệu có nguồn gốc chủ yếu được khai thác từ ngoài tự nhiên hoang dã. Ngoài ra chúng có khu phân bố chia cắt, sống ở vùng núi đá vôi, nơi cư trú bị xâm hại do nạn chặt phá rừng.
Cây bị khai thác bằng cách đào rễ lấy củ và không có kế hoạch trồng tái sinh do vậy Bình vôi nguy cơ tuyệt chủng cao. Loài đã được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (V) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại [18]. Trước tình hình trên cần áp dụng các biện pháp, kỹ thuật sinh học hiện đại phù hợp để tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng được nhu cầu sử dụng củ Bình vôi làm thuốc tăng cao mà vẫn đảm bảo sự phát triển của cây Bình vôi hoang dã. Alkaloid và tác dụng của alkaloid trong cây Bình vôi 1.
Alkaloid Alkaloid ban đầu được định nghĩa là các chất kiềm được chiết xuất từ những loài thực vật có hoạt tính sinh học. Sau này được điều chỉnh để bao gồm cả các chất được tổng ngoài giới thức vật, cụ thể: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thuờng gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật, thường có dược lực tính rất mạnh và cho những phản ứng hoá học với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung cúa alkaloid [6], [21].