Luận án tiến sĩ bảo vệ thực vật nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn burkholderia glumae

Luận án tiến sĩ nghiên cứu ứng dụng thực khuẩn thể phòng trị bệnh thối hạt lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae, giải pháp sinh học hiệu quả.

• Tác giả: Đoàn Thị Kiều Tiên
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Thu Nga
• Trường học: Đại học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
• Đề tài: Nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Cần Thơ

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM TẠ
• CAM ĐOAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• DANH SÁCH BẢNG
• DANH SÁCH HÌNH
• DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Tính cấp thiết của luận án
• 1.2. Mục đích nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.4. Tính mới của luận án
• 1.5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 1.5.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.5.2. Phạm vi nghiên cứu
• 1.6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 1.6.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.6.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. BỆNH THỐI HẠT LÚA
• 2.1.1. Lịch sử và tình hình gây hại
• 2.1.2. Triệu chứng bệnh thối hạt
• 2.1.4. Sự xâm nhiễm và lưu tồn của vi khuẩn Burkholderia glumae
• 2.1.4.1. Sự xâm nhiễm
• 2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn Burkholderia glumae
• 2.1.7. Các yếu tố ảnh hưởng độc tính của vi khuẩn Burkholderia glumae
• 2.1.7.1. Độc tố toxoflavin
• 2.1.7.3. Khả năng di chuyển của chiên mao (Flagella)
• 2.1.7.4. Hệ thống cảm ứng III (type III effectors)
• 2.1.8. Biện pháp quản lí
• 2.1.8.1. Biện pháp hóa học
• 2.1.8.2. Biện pháp canh tác
• 2.1.8.3. Biện pháp sinh học
• 2.1.8.4. Biện pháp tổng hợp
• 2.2. TỔNG QUAN VỀ THỰC KHUẨN THỂ
• 2.2.1. Khái niệm về thực khuẩn thể
• 2.2.2. Lịch sử xuất hiện thực khuẩn thể
• 2.2.3. Phân loại thực khuẩn thể
• 2.2.3.1. Thực khuẩn thể dạng đuôi (tail phage)
• 2.2.3.2. Một số họ thực khuẩn thể khác
• 2.2.4. Quá trình xâm nhiễm của thực khuẩn thể vào tế bào vi khuẩn kí chủ
• 2.2.4.1. Chu trình sinh tan (lytic cycle)
• 2.2.4.2. Chu trình tiềm tan (lysogenic cycle)
• 2.2.5. Nuôi cấy thực khuẩn thể
• 2.2.6. Hình dạng đốm tan (plaque)
• 2.3. ỨNG DỤNG THỰC KHUẨN THỂ TRONG PHÒNG TRỪ SINH HỌC BỆNH HẠI DO VI KHUẨN TRÊN THỰC VẬT
• 2.3.1. Khái niệm phòng trừ sinh học
• 2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kiểm soát vi khuẩn bằng liệu pháp thực khuẩn thể
• 2.3.2.1. Tỷ số thực khuẩn thể/vi khuẩn
• 2.3.2.2. Khả năng tiếp cận đến vi khuẩn mục tiêu
• 2.3.2.3. Điều kiện môi trường
• 2.3.2.4. Tính đặc hiệu của thực khuẩn thể
• 2.3.2.5. Sự kháng thực khuẩn thể của vi khuẩn
• 2.3.3. Biện pháp bảo vệ thực khuẩn thể
• 2.3.4. Một số nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh do vi khuẩn trên cây trồng
• 2.3.4.1. Trên thế giới
• 2.3.4.3. Sử dụng hỗn hợp thực khuẩn thể trong phòng trừ bệnh vi khuẩn trên cây trồng
• 2.3.5. Sơ lược về giống lúa OM4900
• 3. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 3.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
• 3.2.1. Dụng cụ thiết bị và vật liệu
• 3.3. NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.3.1. Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn thực khuẩn thể và vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa
• 3.3.1.1. Phân lập thực khuẩn thể và vi khuẩn gây bệnh thối hạt ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long
• 3.3.1.2. Đánh giá khả năng kí sinh của các dòng thực khuẩn thể trên các dòng vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa
• 3.3.1.3. Định danh vi khuẩn gây bệnh thối hạt bằng kỹ thuật PCR (polymerase Chain Reaction)
• 3.3.1.4. Đánh giá khả năng gây hại của các dòng vi khuẩn Burkholderia glumae gây bệnh thối hạt trong điều kiện nhà lưới
• 3.3.1.5. Đánh giá khả năng tiêu diệt vi khuẩn Burkholderia glumae của những dòng thực khuẩn thể triển vọng
• 3.3.2. Nội dung 2: Đánh giá khả năng phòng trị bệnh thối hạt của các dòng thực khuẩn thể triển vọng trong điều kiện nhà lưới
• 3.3.2.1. Đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh thối hạt trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae bằng các dòng thực khuẩn thể triển vọng
• 3.3.2.2. Đánh giá hiệu quả của các mật số thực khuẩn thể khác nhau trong phòng trị bệnh thối hạt lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae
• 3.3.2.3. Khảo sát thời điểm xử lý của thực khuẩn thể trong phòng trị bệnh thối hạt do vi khuẩn Burkholderia glumae
• 3.3.3. Nội dung 3: Xác định tính an toàn của các dòng thực khuẩn thể triển vọng trong thực tiễn sản xuất
• 3.3.3.1. Khảo sát hình thái của thực khuẩn thể dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscopy)
• 3.3.3.2. Giải mã trình tự bộ gen của những dòng thực khuẩn thể triển vọng
• 3.3.4. Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả của các dòng thực khuẩn thể triển vọng phòng trị bệnh thối hạt lúa ở điều kiện ngoài đồng
• 3.3.4.1. Đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh thối hạt do vi khuẩn Burkholderia glumae trên lúa bằng các dòng thực khuẩn thể triển vọng vụ Đông Xuân 2017 - 2018
• 3.3.4.2. Đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh thối hạt do vi khuẩn Burkholderia glumae trên lúa bằng các dòng thực khuẩn thể triển vọng ở ngoài đồng vụ Hè Thu sớm 2018
• 3.3.5. Nội dung 5: Khảo sát điều kiện nhân nuôi thực khuẩn thể triển vọng
• 3.3.5.1. Khảo sát các loại môi trường lên khả năng nhân mật số thực khuẩn thể
• 3.3.5.2. Khảo sát thời gian cấy vi khuẩn lên khả năng nhân mật số thực khuẩn thể
• 3.3.5.3. Khảo sát chỉ số MOI ảnh hướng đến khả năng nhân mật số của dòng thực khuẩn thể triển vọng
• 3.3.5.4. Khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng nhân mật số thực khuẩn thể triển vọng
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Nội dung 1: Kết quả phân lập, tuyển chọn thực khuẩn thể và vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa
• 4.1.1. Kết quả phân lập các dòng thực khuẩn thể phân bố ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long
• 4.1.2. Kết quả khả năng kí sinh của thực khuẩn thể đối với các dòng vi khuẩn Burkholderia glumae phân lập ở một số tỉnh ĐBSCL
• 4.1.3. Kết quả xác định vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa bằng kỹ thuật sinh học phân tử
• 4.1.4. Kết quả khả năng gây hại của các dòng vi khuẩn Burkholderia glumae gây bệnh thối hạt trong điều kiện nhà lưới

Tóm tắt

I. Phân lập và tuyển chọn thực khuẩn thể và vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa

Nghiên cứu tập trung vào việc phân lập và tuyển chọn các dòng thực khuẩn thể và vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa từ các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả phân lập được 112 dòng thực khuẩn thể và 60 dòng vi khuẩn gây bệnh. Trong đó, 8 dòng thực khuẩn thể (ФBurTV25a, ФBurDT46, ФBurDT47a, ФBurDT47b, ФBurDT48a, ФBurVL34, ФBurVL39, ФBurAG58) có phổ ký sinh rộng trên nhiều dòng vi khuẩn gây bệnh, chiếm khoảng 75% tổng số vi khuẩn gây bệnh. Đồng thời, 6 dòng vi khuẩn (BurVL21, BurDT46, BurDT50, BurDT51, BurKG52, BurKG57) bị nhiều dòng thực khuẩn thể ký sinh, chiếm 55% tổng số thực khuẩn thể. Kỹ thuật sinh học phân tử xác định các dòng vi khuẩn này thuộc loài Burkholderia glumae.

1.1. Đánh giá khả năng gây hại của vi khuẩn Burkholderia glumae

Nghiên cứu đánh giá khả năng gây hại của 6 dòng vi khuẩn Burkholderia glumae (BurVL21, BurDT46, BurDT50, BurDT51, BurKG52, BurKG57) trên lúa. Kết quả cho thấy dòng BurDT46 phân lập tại Đồng Tháp có khả năng gây bệnh thối hạt lúa cao nhất so với các dòng còn lại. Điều này khẳng định sự nguy hiểm của Burkholderia glumae đối với cây lúa và sự cần thiết của các biện pháp phòng trị bệnh hiệu quả.

1.2. Đánh giá khả năng tiêu diệt vi khuẩn của thực khuẩn thể

Nghiên cứu so sánh khả năng tiêu diệt vi khuẩn BurDT46 của 8 dòng thực khuẩn thể. Kết quả xác định 4 dòng thực khuẩn thể (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a, ФBurDT48a) có khả năng phân giải cao hơn các dòng còn lại. Điều này mở ra tiềm năng sử dụng thực khuẩn thể như một biện pháp phòng ngừa hiệu quả trong nông nghiệp.

II. Đánh giá khả năng phòng trị bệnh thối hạt lúa của thực khuẩn thể trong điều kiện nhà lưới

Nghiên cứu đánh giá hiệu quả của 4 dòng thực khuẩn thể triển vọng (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a, ФBurDT48a) trong phòng trị bệnh thối hạt lúa do Burkholderia glumae gây ra. Kết quả cho thấy cả 4 dòng thực khuẩn thể đều có hiệu quả giảm bệnh so với đối chứng, trong đó dòng ФBurAG58 đạt hiệu quả giảm bệnh trên 70%. Nghiên cứu cũng xác định mật số thực khuẩn thể 108 pfu/ml và thời điểm phun trước khi lây bệnh 2 giờ là tối ưu nhất.

2.1. Hiệu quả của các mật số thực khuẩn thể khác nhau

Nghiên cứu so sánh hiệu quả của dòng thực khuẩn thể ФBurAG58 ở 4 mật số khác nhau (105, 106, 107, 108 pfu/ml). Kết quả cho thấy mật số 108 pfu/ml có hiệu quả phòng trị bệnh tốt nhất, giảm tỷ lệ hạt nhiễm bệnh đáng kể so với các mật số khác. Điều này khẳng định tầm quan trọng của việc điều chỉnh mật số thực khuẩn thể trong ứng dụng thực tế.

2.2. Thời điểm áp dụng thực khuẩn thể

Nghiên cứu xác định thời điểm áp dụng thực khuẩn thể tối ưu. Kết quả cho thấy phun thực khuẩn thể 2 giờ trước khi lây bệnh hoặc kết hợp phun trước và sau 5 ngày lây bệnh đều mang lại hiệu quả phòng trị bệnh cao hơn so với phun sau 5 ngày lây bệnh. Điều này cung cấp hướng dẫn quan trọng cho việc áp dụng thực khuẩn thể trong thực tế.

III. Nghiên cứu định danh và tính an toàn của thực khuẩn thể

Nghiên cứu định danh 3 dòng thực khuẩn thể triển vọng (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a) bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và giải trình tự bộ gen. Kết quả cho thấy cả 3 dòng đều thuộc họ Podoviridae với đầu đa diện và đuôi ngắn. Bộ gen của chúng có kích thước từ 44.466 bp đến 45.466 bp, với tỷ lệ G+C là 58%. Đặc biệt, cả 3 dòng đều thuộc nhóm thực khuẩn thể độc (virulent phage), không có gen mã hóa enzyme integrase, đảm bảo tính an toàn khi sử dụng trong nông nghiệp.

3.1. Hình thái và phân loại thực khuẩn thể

Nghiên cứu sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để xác định hình thái của 3 dòng thực khuẩn thể (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a). Kết quả cho thấy chúng đều thuộc họ Podoviridae với đầu đa diện và đuôi ngắn. Điều này khẳng định sự phù hợp của các dòng thực khuẩn thể này trong việc tiêu diệt vi khuẩn Burkholderia glumae.

3.2. Giải trình tự bộ gen và tính an toàn

Nghiên cứu giải trình tự bộ gen của 3 dòng thực khuẩn thể (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a). Kết quả cho thấy chúng đều thuộc nhóm thực khuẩn thể độc (virulent phage), không có gen mã hóa enzyme integrase. Điều này đảm bảo tính an toàn của thực khuẩn thể khi sử dụng trong phòng trị bệnh thực vật, không gây ra các rủi ro tiềm ẩn.

IV. Đánh giá hiệu quả của thực khuẩn thể trong điều kiện ngoài đồng

Nghiên cứu đánh giá hiệu quả của dòng thực khuẩn thể ФBurAG58 và hỗn hợp 3 dòng thực khuẩn thể (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a) trong phòng trị bệnh thối hạt lúa ở điều kiện ngoài đồng. Kết quả cho thấy cả hai nghiệm thức đều có hiệu quả giảm bệnh tương đương với oxolinic acid, giảm tỷ lệ hạt nhiễm bệnh khoảng 50%. Điều này khẳng định tiềm năng ứng dụng thực khuẩn thể như một biện pháp phòng ngừa hiệu quả trong nông nghiệp.

4.1. Hiệu quả của thực khuẩn thể đơn và hỗn hợp

Nghiên cứu so sánh hiệu quả của dòng thực khuẩn thể ФBurAG58 đơn và hỗn hợp 3 dòng thực khuẩn thể (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a) trong phòng trị bệnh thối hạt lúa. Kết quả cho thấy cả hai nghiệm thức đều có hiệu quả giảm bệnh tương đương với oxolinic acid, giảm tỷ lệ hạt nhiễm bệnh khoảng 50%. Điều này khẳng định tính linh hoạt trong việc sử dụng thực khuẩn thể đơn hoặc hỗn hợp.

4.2. Ảnh hưởng đến năng suất lúa

Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của thực khuẩn thể đến năng suất lúa. Kết quả cho thấy việc sử dụng thực khuẩn thể giúp bảo vệ tỷ lệ hạt chắc và năng suất lúa, góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế trong nông nghiệp. Điều này khẳng định giá trị thực tiễn của thực khuẩn thể trong việc quản lý bệnh thối hạt lúa.

V. Khảo sát điều kiện nhân nuôi thực khuẩn thể

Nghiên cứu khảo sát các điều kiện nhân nuôi dòng thực khuẩn thể ФBurAG58 trong phòng thí nghiệm. Kết quả cho thấy môi trường King’s B lỏng, Nutrient lỏng và PDA + Peptone lỏng cho mật số thực khuẩn thể cao hơn so với PDA lỏng. Ngoài ra, thời gian cấy vi khuẩn ký chủ trước 16 giờ và chỉ số MOI 1.0 là tối ưu nhất cho việc nhân nuôi thực khuẩn thể. Nhiệt độ 30°C cũng được xác định là phù hợp nhất cho quá trình nhân nuôi.

5.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy lên khả năng nhân mật số thực khuẩn thể ФBurAG58. Kết quả cho thấy môi trường King’s B lỏng, Nutrient lỏng và PDA + Peptone lỏng cho mật số thực khuẩn thể cao hơn so với PDA lỏng. Điều này cung cấp thông tin quan trọng cho việc tối ưu hóa quy trình nhân nuôi thực khuẩn thể.

5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và chỉ số MOI

Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và chỉ số MOI lên khả năng nhân mật số thực khuẩn thể ФBurAG58. Kết quả cho thấy nhiệt độ 30°C và chỉ số MOI 1.0 là tối ưu nhất cho quá trình nhân nuôi. Điều này khẳng định tầm quan trọng của việc điều chỉnh các yếu tố môi trường trong quá trình sản xuất thực khuẩn thể.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh thối hạt (hay bệnh lép vàng, bạc bông) trên lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae là tác nhân gây thiệt hại nặng nề đến năng suất và phẩm chất lúa gạo trên phạm vi toàn cầu và tại Việt Nam. Tại Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), việc kiểm soát bệnh hại vi khuẩn hiện nay phụ thuộc chủ yếu vào các biện pháp hóa học như sử dụng hoạt chất oxolinic acid, thuốc gốc đồng và kháng sinh. Tuy nhiên, sự lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học đã dẫn đến hiện tượng vi khuẩn phát sinh tính kháng thuốc (được ghi nhận rộng rãi tại Nhật Bản do đột biến gen gyrA), gây suy giảm đa dạng sinh học và để lại tồn dư độc hại trong môi sinh. Trước bối cảnh biến đổi khí hậu làm nền nhiệt gia tăng — điều kiện tối ưu cho B. glumae phát triển mạnh ở nhiệt độ 30–35°C — việc nghiên cứu các giải pháp sinh học có tính chuyên biệt cao, an toàn với hệ sinh thái là yêu cầu cấp thiết.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết xuất phát từ thực tế: các nghiên cứu trong nước trước đây chỉ dừng lại ở quy mô thử nghiệm sơ khởi trong điều kiện phòng thí nghiệm hoặc nhà lưới, chưa có công trình nào đánh giá toàn diện hiệu quả phòng trị của thực khuẩn thể (bacteriophage) đối với bệnh thối hạt lúa ở điều kiện ngoài đồng ruộng thực tế; đồng thời chưa có nghiên cứu phân tích sâu về đặc điểm hình thái học siêu vi và cấu trúc bộ gen của các dòng thực khuẩn thể bản địa nhằm xác nhận tính an toàn sinh học trước khi áp dụng trên diện rộng.

Mục tiêu tổng quát của luận án là xác định hiệu quả và tính an toàn của thực khuẩn thể trong quản lý bệnh thối hạt lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae gây ra, đồng thời xác định điều kiện nhân nuôi tối hảo để ứng dụng thực khuẩn thể trong thực tế sản xuất nông nghiệp, góp phần giảm thiểu lượng thuốc hóa học bảo vệ thực vật.

Luận án triển khai 5 nội dung nghiên cứu chính (được đánh số theo văn bản):

1. Phân lập, tuyển chọn thực khuẩn thể và vi khuẩn gây bệnh thối hạt lúa.
2. Đánh giá khả năng phòng trị bệnh thối hạt của các dòng thực khuẩn thể triển vọng trong điều kiện nhà lưới.
3. Xác định tính an toàn của các dòng thực khuẩn thể triển vọng trong thực tiễn sản xuất.
4. Đánh giá hiệu quả của các dòng thực khuẩn thể triển vọng phòng trị bệnh thối hạt lúa ở điều kiện ngoài đồng.
5. Khảo sát điều kiện nhân nuôi thực khuẩn thể triển vọng.

Đối tượng nghiên cứu bao gồm cây lúa (giống lúa OM4900), vi khuẩn gây bệnh thối hạt Burkholderia glumae và các dòng thực khuẩn thể ký sinh chuyên tính trên vi khuẩn B. glumae. Phạm vi không gian nghiên cứu bao gồm: thu thập mẫu bệnh và mẫu thực khuẩn thể tại 9 tỉnh thuộc ĐBSCL; các thí nghiệm in vitro và nhà lưới tại Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ; khảo sát siêu cấu trúc hình thái dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) tại Viện Kỹ thuật Kyoto (Kyoto Institute of Technology, Nhật Bản); giải trình tự bộ gen (WGS) tại Bộ môn Công nghệ Gen, Trường Đại học Leuven (Vương quốc Bỉ); các thí nghiệm đồng ruộng thực hiện tại huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long qua 2 vụ lúa (Đông Xuân 2017–2018 và Hè Thu sớm 2018). Phạm vi thời gian nghiên cứu được thực hiện liên tục từ năm 2015 đến năm 2019.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án tổng thuật có hệ thống các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến bệnh thối hạt lúa và liệu pháp thực khuẩn thể:

Về bệnh thối hạt lúa và tác nhân gây bệnh: Bệnh thối hạt được ghi nhận lần đầu tại Nhật Bản vào năm 1950 (CPC, 2007) và bùng phát gây hại lớn trên 900.000 ha lúa tại đảo Kyushu vào năm 1989 (Mew et al., 1989). Tại Việt Nam, bệnh được ghi nhận đầu tiên tại miền Trung và Đồng bằng sông Hồng vào năm 1991–1992, gây thiệt hại năng suất đến 75% trên diện tích 25.000 ha (Trung et al., 1993). Vi khuẩn gây bệnh ban đầu có tên là Pseudomonas glumae (Kurita & Tabei, 1967), sau đó được phân loại lại thành Burkholderia glumae dựa trên mức độ tương đồng DNA-DNA, rRNA và tỷ lệ % G+C (Yabuuchi et al., 1992; Urakami et al., 1994). Cơ chế gây bệnh và độc lực của vi khuẩn được xác định chủ yếu do độc tố toxoflavin, fervenulin (Ham et al., 2011; Zhou-qi et al., 2016), enzyme lipase (Kang et al., 2008; Devescovi et al., 2007), chiên mao di động (Kim et al., 2007), hệ thống tiết type III (T3SS) (Kang et al., 2008) và hệ thống cảm ứng mật độ quorum sensing qua tín hiệu C8-HSL (Ham et al., 2011). Vấn đề vi khuẩn kháng thuốc oxolinic acid do đột biến gen gyrA đã được Maeda et al. (2007) và Mizobuchi et al. (2020) chứng minh tại nhiều tỉnh của Nhật Bản.

Về thực khuẩn thể và ứng dụng sinh học: Lịch sử nghiên cứu thực khuẩn thể khởi đầu từ các phát hiện của Twort (1915) và d’Herelle (1917). Hệ thống phân loại của Ackermann (2007, 2011) và Pelzek et al. (2013) xác định phần lớn thực khuẩn thể thuộc bộ Caudovirales (chiếm 96%) với 3 họ chính: Myoviridae (đuôi co rút), Siphoviridae (đuôi dài không co rút) và Podoviridae (đuôi ngắn). Cơ chế hấp phụ và xâm nhiễm của thực khuẩn thể có đuôi qua các thụ thể bề mặt (LPS, Omp, pili, flagella) được tổng hợp bởi Nobrega et al. (2018). Các ứng dụng thực khuẩn thể trên cây trồng đã ghi nhận thành công trong quản lý Xanthomonas axonopodis pv. citri trên cam (Balogh et al., 2008), Ralstonia solanacearum trên cà chua (Fujiwara et al., 2011), Xanthomonas axonopodis pv. allii trên hành (Lang et al., 2007; Nga et al., 2021), Erwinia carotovora trên hoa loa kèn (Ravensdale et al., 2007), và chế phẩm thương mại AgriPhage được Cơ quan Bảo vệ Môi sinh Hoa Kỳ (EPA) phê duyệt năm 2005 (Nagy et al., 2012). Tại Việt Nam, các nghiên cứu bước đầu của Huy và ctv. (2015) ghi nhận tiềm năng của các dòng phage ФVL34, ФVL39, ФAG58 trong nhà lưới; Phến và Nhân (2020) nghiên cứu vi khuẩn đối kháng Bacillus; Nga và Khởi (2020) nghiên cứu Pseudomonas fluorescens.

Vị trí của luận án: Luận án là công trình hoàn thiện chuỗi nghiên cứu từ cơ bản đến ứng dụng tại Việt Nam, giải quyết khoảng trống về việc xác lập dữ liệu kiểu hình siêu vi học (TEM), dữ liệu hệ gen học (WGS) để chứng minh tính an toàn sinh học (không mang gen integrase), đánh giá hiệu lực của thực khuẩn thể đơn lẻ và hỗn hợp trên đồng ruộng qua nhiều vụ mùa, đồng thời chuẩn hóa các thông số nhân nuôi in vitro mật số cao.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về sinh học vi sinh vật và liệu pháp thực khuẩn thể (phage therapy). Thực khuẩn thể là virus ký sinh bắt buộc trên vi khuẩn, hoạt động theo hai chu trình: chu trình sinh tan (lytic cycle) dẫn đến sự phá vỡ tế bào vi khuẩn để giải phóng các phage hạt mới; và chu trình tiềm tan (lysogenic cycle) trong đó bộ gen phage tích hợp vào nhiễm sắc thể vi khuẩn (prophage) qua enzyme integrase. Về mặt an toàn sinh học, chỉ những thực khuẩn thể độc (virulent/lytic phages), hoàn toàn không chứa gen mã hóa integrase, mới đủ tiêu chuẩn ứng dụng trong bảo vệ thực vật nhằm loại trừ nguy cơ tải nạp gen độc lực hoặc gen kháng kháng sinh giữa các chủng vi khuẩn. Khung đánh giá dịch tễ học bệnh cây dựa trên các chỉ số tỷ lệ hạt bệnh, hiệu quả giảm bệnh, diện tích dưới đường cong tiến triển bệnh (AUDPC), cùng các chỉ tiêu cấu thành năng suất lúa.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

• Phương pháp thu mẫu và phân lập: Thu thập mẫu bông lúa bệnh và mẫu nước ruộng tại 9 tỉnh ĐBSCL. Phân lập vi khuẩn trên môi trường King’s B agar và Nutrient agar; phân lập thực khuẩn thể bằng phương pháp làm giàu mẫu và kỹ thuật đĩa thạch hai lớp (double-layer agar method).
• Đánh giá phổ ký sinh và hoạt tính tan: Sử dụng kỹ thuật nhỏ giọt (spot test) và đo đường kính đốm tan (plaque diameter) để đánh giá khả năng phân giải vi khuẩn.
• Phương pháp sinh học phân tử: Giám định vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu 1416S (5'-GAA GTC GTA ACA AGG TAG CCG-3') và 1414A (5'-CTA CAG CGT GTA CCG TTT GAA-3') đặc hiệu cho loài Burkholderia glumae.
• Đánh giá khả năng gây bệnh và hiệu lực trong nhà lưới: Thử nghiệm lây nhiễm nhân tạo theo quy tắc Koch trên giống lúa OM4900. Khảo sát hiệu lực phòng trị của các dòng phage đơn lẻ và hỗn hợp ở mật số 10⁸ pfu/ml; khảo sát 4 dải mật số (10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸ pfu/ml); đánh giá 3 thời điểm xử lý (2 giờ trước khi lây bệnh - GTKLB, 5 ngày sau khi lây bệnh - NSKLB, và kết hợp cả hai thời điểm).
• Xác định hình thái và giải mã bộ gen: Khảo sát hình thái dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) với kỹ thuật nhuộm âm bản bằng uranyl acetate. Giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing) trên nền tảng giải trình tự thế hệ mới, phân tích tin sinh học để xác định kích thước genome, tỷ lệ % G+C và tìm kiếm sự hiện diện của gen mã hóa integrase.
• Thử nghiệm đồng ruộng: Bố trí thí nghiệm khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD) trên giống lúa OM4900 tại Vĩnh Long qua vụ Đông Xuân 2017–2018 và vụ Hè Thu sớm 2018, so sánh nghiệm thức xử lý phage với đối chứng không xử lý và đối chứng hóa học (oxolinic acid - Starner 20WP).
• Khảo sát thông số nhân nuôi in vitro: Đánh giá 4 loại môi trường lỏng (King’s B lỏng, Nutrient broth, PDA + Peptone lỏng, PDA lỏng); khảo sát thời điểm cấy vi khuẩn trước (0 giờ và 16 giờ); khảo sát tỷ lệ đa bội nhiễm MOI (Multiplicity of Infection: 0,01; 0,1; 1,0) và dải nhiệt độ nuôi cấy (27°C, 30°C, 37°C) thông qua đo mật số quang học (OD) và chuẩn độ đốm tan (pfu/ml).

Nguồn dữ liệu: Toàn bộ số liệu sơ cấp thu thập từ các đợt khảo sát, phân lập, đo đạc đường kính đốm tan, đếm số khuẩn lạc (cfu/ml), đếm đốm tan (pfu/ml), tính toán tỷ lệ hạt bệnh, tỷ lệ hạt chắc và năng suất thực tế qua các mốc thời gian thí nghiệm.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu

Chương 1 thiết lập cơ sở khoa học và thực tiễn của đề tài. Tác giả chỉ rõ mức độ gây hại nghiêm trọng của bệnh thối hạt lúa do Burkholderia glumae tại Việt Nam và trên thế giới, nêu bật áp lực từ việc vi khuẩn kháng thuốc hóa học và yêu cầu giảm phát thải hóa chất trong nông nghiệp. Chương này xác định rõ mục tiêu nghiên cứu, 5 nội dung triển khai, đối tượng nghiên cứu (cây lúa OM4900, vi khuẩn B. glumae, thực khuẩn thể) và phạm vi không gian, thời gian từ năm 2015 đến năm 2019. Tác giả khẳng định 3 điểm mới then chốt: (1) xác định B. glumae là tác nhân chính gây bệnh thối hạt ở ĐBSCL; (2) tuyển chọn được 3 dòng thực khuẩn thể thuộc nhóm lytic an toàn có hiệu quả giảm bệnh ngoài đồng tương đương oxolinic acid; (3) thiết lập điều kiện nhân nuôi in vitro tối hảo đạt mật số 10¹⁰ pfu/ml.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 cung cấp hệ thống cơ sở lý thuyết toàn diện gồm 3 phân phần lớn:

• Bệnh thối hạt lúa: Trình bày lịch sử phân bố dịch hại trên 18 quốc gia; mô tả chi tiết 3 dạng triệu chứng (bạc bông, thối hạt/lép vàng và thối cây mạ); phân tích đặc điểm sinh học của B. glumae (trực khuẩn Gram âm, 2–4 chiên mao cực, tạo sắc tố vàng trên King’s B 2% agar, nhiệt độ sinh trưởng 11–41°C, tối thích 30–35°C). Phân tích chu trình xâm nhiễm sơ cấp (lưu tồn hạt giống, bẹ lá) và thứ cấp (lây lan mạnh vào 7 ngày sau khi trổ đều). Phân tích các yếu tố quyết định độc lực: độc tố toxoflavin (cụm gen toxABCDE), lipase, hệ thống tiết type III (T3SS), polygalacturonase (pehA, pehB), hệ thống quorum sensing (TofI/TofR điều khiển bởi C8-HSL). Tổng kết các biện pháp quản lý hóa học, canh tác, sinh học và tích hợp (IPM).
• Tổng quan về thực khuẩn thể: Tổng thuật lịch sử 100 năm phát triển nghiên cứu phage; cấu trúc và phân loại 20 họ vi rút vi khuẩn; cấu trúc hình thái bộ Caudovirales (Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae); cơ chế phân tử của chu trình sinh tan (hấp phụ, xâm nhập, sao chép, lắp ráp, giải phóng) và chu trình tiềm tan; các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ (MOI, cation hóa trị 2 như Ca²⁺, Mg²⁺, pH, nhiệt độ).
• Ứng dụng thực khuẩn thể trong bảo vệ thực vật: Phân tích các yếu tố quyết định hiệu quả của liệu pháp phage trên đồng ruộng; tổng kết các thành tựu ứng dụng quốc tế và nghiên cứu trong nước trên bệnh cháy bìa lá, héo xanh, cháy lá hành và thối hạt lúa. Giới thiệu đặc tính nông học của giống lúa thử nghiệm OM4900.

Chương 3: Phương tiện và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm tương ứng với 5 nội dung:

• Quy trình phân lập 112 dòng thực khuẩn thể và 60 dòng vi khuẩn từ 9 tỉnh ĐBSCL; phương pháp xác định phổ ký sinh chéo bằng spot test; quy trình phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu với cặp mồi 1416S/1414A; phương pháp đánh giá độc tính của 6 dòng vi khuẩn trong nhà lưới; phương pháp đo đường kính đốm tan của 8 dòng phage trên dòng vi khuẩn BurDT46.
• Bố trí thí nghiệm nhà lưới đánh giá hiệu lực của 4 dòng phage đơn lẻ (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a, ФBurDT48a) và hỗn hợp 4 dòng; thí nghiệm so sánh 4 dải mật số (10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸ pfu/ml) của dòng ФBurAG58; thí nghiệm xác định thời điểm xử lý (2 giờ trước lây bệnh, 5 ngày sau lây bệnh, kết hợp cả hai).
• Phương pháp chuẩn bị mẫu và quan sát siêu cấu trúc hình thái TEM; quy trình chiết tách DNA, giải trình tự genome và phân tích tin sinh học để tìm gen integrase.
• Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng (RCBD) trên giống OM4900 tại Tam Bình, Vĩnh Long trong vụ Đông Xuân 2017–2018 (phun 2 lần: trước và sau trổ) và vụ Hè Thu sớm 2018 (khảo sát mật số 10⁷ và 10⁸ pfu/ml), theo dõi tỷ lệ hạt bệnh, mật số tồn tại của phage trên bông, AUDPC, tỷ lệ hạt chắc và năng suất lúa thực tế so với đối chứng Starner 20WP (oxolinic acid).
• Phương pháp bố trí thí nghiệm in vitro tối ưu hóa nhân nuôi phage ФBurAG58: thử nghiệm 4 loại môi trường dinh dưỡng lỏng; khảo sát thời gian cấy vi khuẩn trước (0 giờ, 16 giờ); đánh giá ảnh hưởng của chỉ số MOI (0,01; 0,1; 1,0); và khảo sát 3 mức nhiệt độ nuôi cấy (27°C, 30°C, 37°C) theo dõi qua các mốc thời gian đến 72 giờ.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 trình bày các phát hiện thực nghiệm được cấu trúc theo 5 nội dung:

• Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn thực khuẩn thể và vi khuẩn:
  • Phân lập được 112 dòng thực khuẩn thể và 60 dòng vi khuẩn gây bệnh thối hạt từ 9 tỉnh ĐBSCL. Tuyển chọn được 8 dòng phage (ФBurTV25a, ФBurDT46, ФBurDT47a, ФBurDT47b, ФBurDT48a, ФBurVL34, ФBurVL39, ФBurAG58) có phổ ký sinh rộng, làm tan khoảng 75% các dòng vi khuẩn phân lập; đồng thời chọn được 6 dòng vi khuẩn (BurVL21, BurDT46, BurDT50, BurDT51, BurKG52, BurKG57) bị ký sinh bởi 55% tổng số dòng phage.
  • Kỹ thuật PCR với cặp mồi 1416S/1414A khuếch đại thành công đoạn DNA đặc hiệu, xác định chính xác 6 dòng vi khuẩn thử nghiệm thuộc loài Burkholderia glumae. Đánh giá độc tính trong nhà lưới xác định dòng vi khuẩn BurDT46 (phân lập tại Đồng Tháp) có khả năng gây bệnh thối hạt cao nhất.
  • Thử nghiệm khả năng phân giải trên vi khuẩn BurDT46 xác định 4 dòng phage cho đường kính đốm tan lớn nhất gồm ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a và ФBurDT48a.

Dòng thực khuẩn thể triển vọng	Nơi phân lập	Ký sinh trên chủng vi khuẩn thử nghiệm	Đặc điểm đốm tan (Plaque) trên BurDT46
ФBurVL34	Vĩnh Long	BurDT46, BurKG52, BurVL21...	Đốm tròn, trong suốt, đường kính lớn
ФBurAG58	An Giang	BurDT46, BurKG52, BurDT50...	Đốm tròn, trong suốt, viền rõ, đường kính lớn
ФBurDT47a	Đồng Tháp	BurDT46, BurKG52, BurDT51...	Đốm tròn, tâm trong, đường kính lớn
ФBurDT48a	Đồng Tháp	BurDT46, BurKG52, BurKG57...	Đốm tròn, đường kính lớn

• Nội dung 2: Hiệu lực phòng trị trong điều kiện nhà lưới:

  • Tất cả các nghiệm thức xử lý phage đơn lẻ hoặc hỗn hợp ở mật số 10⁸ pfu/ml đều làm giảm tỷ lệ hạt bệnh có ý nghĩa so với đối chứng. Dòng ФBurAG58 đạt hiệu quả giảm bệnh cao nhất (trên 70%).
  • Khảo sát mật số cho thấy mật số 10⁸ pfu/ml của dòng ФBurAG58 mang lại hiệu quả giảm bệnh tốt nhất so với các mật số 10⁵, 10⁶, 10⁷ pfu/ml.
  • Khảo sát thời điểm xử lý xác định việc phun phage vào thời điểm 2 giờ trước khi lây bệnh (GTKLB) hoặc kết hợp phun trước 2 giờ và sau 5 ngày (NSKLB) cho hiệu quả giảm bệnh vượt trội so với chỉ phun ở thời điểm 5 NSKLB.

• Nội dung 3: Xác định tính an toàn sinh học của các dòng phage:

  • Quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM): Cả 3 dòng phage triển vọng (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a) đều có cấu trúc đầu khối đa diện và đuôi ngắn không co rút, được phân loại thuộc họ Podoviridae.
  • Phân tích hệ gen học (WGS): Kích thước bộ gen của 3 dòng phage lần lượt là ФBurVL34 (44.657 bp), ФBurAG58 (36.275 bp), ФBurDT47a (45.466 bp); tất cả đều có hàm lượng G+C đạt 58%. Phân tích chức năng gen xác nhận bộ gen của cả 3 dòng hoàn toàn không chứa gen mã hóa enzyme integrase, khẳng định đây là các thực khuẩn thể độc chuyên tính (virulent/lytic phages), bảo đảm tính an toàn sinh học tuyệt đối khi ứng dụng ngoài sản xuất.

Chỉ tiêu hệ gen	ФBurVL34	ФBurAG58	ФBurDT47a
Họ vi rút (TEM)	Podoviridae	Podoviridae	Podoviridae
Kích thước bộ gen (bp)	44.657	36.275	45.466
Hàm lượng G+C (%)	58%	58%	58%
Gen mã hóa Integrase	Không có (Khuyết thiếu)	Không có (Khuyết thiếu)	Không có (Khuyết thiếu)
Nhóm chức năng	Virulent (Lytic phage)	Virulent (Lytic phage)	Virulent (Lytic phage)

• Nội dung 4: Hiệu quả phòng trị ngoài đồng ruộng:

  • Thí nghiệm vụ Đông Xuân 2017–2018: Phun 2 lần (trước trổ và sau trổ) với dòng đơn ФBurAG58 hoặc hỗn hợp 3 dòng (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a) ở mật số 10⁸ pfu/ml giúp giảm bệnh thối hạt khoảng 50%, tương đương với hiệu quả của thuốc hóa học oxolinic acid, bảo vệ tỷ lệ hạt chắc và năng suất lúa thực tế khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng.
  • Thí nghiệm vụ Hè Thu sớm 2018: Khẳng định mật số 10⁸ pfu/ml của nghiệm thức đơn ФBurAG58 và hỗn hợp 3 dòng phage đạt hiệu lực phòng trừ bệnh thối hạt tương đương thuốc hóa học oxolinic acid (~50%), mật số phage duy trì ổn định trên bông lúa qua các thời điểm khảo sát.

• Nội dung 5: Khảo sát điều kiện nhân nuôi in vitro:

  • Môi trường nuôi cấy: Môi trường King’s B lỏng, Nutrient lỏng và PDA + Peptone lỏng cho mật số phage nhân lên cao hơn rõ rệt so với môi trường PDA lỏng thông thường.
  • Thời gian cấy vi khuẩn: Cấy vi khuẩn ký chủ B. glumae trước 16 giờ rồi mới bổ sung phage ФBurAG58 vào môi trường King’s B lỏng cho mật số phage đạt cực đại.
  • Chỉ số đa bội nhiễm: Chỉ số MOI = 1,0 giúp mật số phage đạt giá trị log 10,00 (tương ứng 10¹⁰ pfu/ml), cao hơn có ý nghĩa so với MOI 0,01 và MOI 0,1.
  • Nhiệt độ nhân nuôi: Nhiệt độ 30°C cho mật số phage đạt cao nhất tại thời điểm 24 giờ sau khi nuôi cấy, khác biệt có ý nghĩa so với mức nhiệt 27°C và 37°C.

Chương 5: Kết luận và đề xuất

Tác giả đúc kết các kết luận khoa học: đã xác định Burkholderia glumae là loài vi khuẩn chủ yếu gây bệnh thối hạt lúa tại ĐBSCL; tuyển chọn thành công 3 dòng thực khuẩn thể họ Podoviridae (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a) thuộc nhóm lytic an toàn sinh học; chứng minh hiệu quả giảm bệnh ngoài đồng ruộng đạt xấp xỉ 50% ở mật số 10⁸ pfu/ml (tương đương oxolinic acid); xác lập quy trình nhân nuôi in vitro trên môi trường King’s B lỏng (cấy vi khuẩn trước 16 giờ, MOI = 1,0, nhiệt độ 30°C) đạt mật số 10¹⁰ pfu/ml. Đề xuất tiếp tục nghiên cứu công thức bảo quản và mở rộng khảo nghiệm trên nhiều vùng sinh thái khác nhau.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án mang lại các đóng góp mới về mặt lý luận khoa học và giá trị thực tiễn:

1. Đóng góp về lý luận và khoa học:

   • Cung cấp dẫn liệu khoa học hoàn chỉnh đầu tiên tại Việt Nam về đặc điểm siêu cấu trúc hình thái học (qua TEM) và dữ liệu giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) của các dòng thực khuẩn thể bản địa ký sinh vi khuẩn Burkholderia glumae.
   • Chứng minh trên cơ sở sinh học phân tử rằng các dòng thực khuẩn thể triển vọng (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a) thuộc họ Podoviridae, sở hữu chu trình sinh tan thuần túy (virulent/lytic phages), hoàn toàn không chứa gen mã hóa enzyme integrase, giải quyết triệt để yêu cầu về an toàn sinh học trong ứng dụng nông nghiệp.

2. Đóng góp về mặt thực tiễn:

   • Chứng minh trên đồng ruộng khả năng sử dụng dòng thực khuẩn thể đơn lẻ (ФBurAG58) hoặc hỗn hợp 3 dòng (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a) ở mật số 10⁸ pfu/ml để thay thế hoặc luân phiên với thuốc hóa học oxolinic acid, đạt hiệu quả giảm bệnh thối hạt khoảng 50%, bảo vệ tỷ lệ hạt chắc và năng suất lúa trong cả hai vụ Đông Xuân và Hè Thu.
   • Chuẩn hóa quy trình nhân nuôi thực khuẩn thể in vitro đạt mật số rất cao (10¹⁰ pfu/ml) bằng môi trường King’s B lỏng với các thông số tối ưu (cấy vi khuẩn trước 16 giờ, MOI = 1,0, 30°C), tạo cơ sở kỹ thuật cho việc sản xuất chế phẩm sinh học ở quy mô lớn.

3. Kiến nghị và giải pháp đề xuất:

   • Áp dụng thực khuẩn thể theo phương thức phun phòng ngừa ở 2 thời điểm then chốt: trước khi trổ (trổ lẹt xẹt) và sau khi trổ đều (cách nhau 5–7 ngày) để cắt đứt giai đoạn xâm nhiễm sơ cấp và ngăn chặn lây lan thứ cấp.
   • Tích hợp liệu pháp thực khuẩn thể vào quy trình quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) cùng với các biện pháp xử lý hạt giống sạch bệnh, san phẳng mặt ruộng và bón phân cân đối đạm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của luận án: Các thí nghiệm đồng ruộng mới được thực hiện tập trung trên giống lúa OM4900 tại địa bàn huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long qua 2 vụ mùa; chưa đánh giá sự tương tác trên nhiều cơ cấu giống lúa khác nhau tại các tiểu vùng sinh thái khác của ĐBSCL; chưa đi sâu nghiên cứu các chất mang sinh học và phụ gia chống tia cực tím (UV) nhằm kéo dài thời gian tồn lưu của hạt phage trên tán lá dưới ánh nắng trực tiếp.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Nghiên cứu công nghệ bào chế, thử nghiệm các chất bảo vệ thực khuẩn thể khỏi bức xạ mặt trời và nhiệt độ cao ngoài đồng ruộng để nâng cao độ bền sinh học của chế phẩm.
  • Mở rộng khảo nghiệm diện rộng trên nhiều giống lúa mẫn cảm và tại các vùng sản xuất lúa trọng điểm khác nhau ở ĐBSCL và toàn quốc.
  • Nghiên cứu phối hợp thực khuẩn thể với các tác nhân vi sinh vật đối kháng (Pseudomonas fluorescens, Bacillus spp.) hoặc các hoạt chất kích kháng sinh học để tối ưu hóa hiệu lực phòng trừ tổng hợp.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên sâu và hữu ích cho nhiều nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên chuyên ngành Bảo vệ thực vật, Vi sinh vật học, Bệnh cây học và Công nghệ sinh học nông nghiệp: tham khảo phương pháp luận phân lập, tuyển chọn, đánh giá phổ ký sinh, kỹ thuật PCR định danh vi khuẩn, và phương pháp phân tích hệ gen virus vi khuẩn.
• Giảng viên và các nhà nghiên cứu: sử dụng làm tài liệu tham khảo trong giảng dạy bệnh học vi khuẩn thực vật, liệu pháp thực khuẩn thể và ứng dụng công nghệ gen trong an toàn sinh học vi sinh.
• Cán bộ khuyến nông và nhà hoạch định chính sách nông nghiệp: tham khảo cơ sở khoa học để xây dựng các gói kỹ thuật quản lý bệnh thối hạt lúa theo tiêu chuẩn sản xuất lúa an toàn, lúa hữu cơ, giảm thiểu thuốc bảo vệ thực vật hóa học.
• Các doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học: khai thác quy trình và các thông số nhân sinh khối thực khuẩn thể in vitro mật số cao (King's B lỏng, MOI 1,0, 30°C) để phát triển các sản phẩm thương phẩm phòng trừ sinh học.

Câu hỏi thường gặp

1. Tác nhân chính gây bệnh thối hạt lúa tại Đồng bằng sông Cửu Long được luận án xác định là loài nào và bằng phương pháp gì? Tác nhân chính gây bệnh thối hạt lúa được xác định là vi khuẩn Burkholderia glumae. Kết luận này được chứng minh qua việc phân lập 60 dòng vi khuẩn từ 9 tỉnh ĐBSCL, đánh giá triệu chứng lây bệnh theo quy tắc Koch, và thực hiện phản ứng PCR sinh học phân tử với cặp mồi đặc hiệu 1416S/1414A cho kết quả khuếch đại chính xác phân đoạn DNA của loài B. glumae.

2. Ba dòng thực khuẩn thể triển vọng nhất trong nghiên cứu thuộc họ vi rút nào và có kích thước bộ gen bao nhiêu? Ba dòng thực khuẩn thể triển vọng (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a) dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) đều thuộc họ Podoviridae (đầu đa diện, đuôi ngắn). Kết quả giải trình tự bộ gen (WGS) xác định kích thước bộ gen của ФBurVL34 là 44.657 bp, ФBurAG58 là 36.275 bp và ФBurDT47a là 45.466 bp, tất cả đều có tỷ lệ G+C là 58%.

3. Vì sao các dòng thực khuẩn thể trong luận án được khẳng định là an toàn sinh học khi áp dụng ngoài đồng ruộng? Tính an toàn sinh học được khẳng định dựa trên kết quả giải mã toàn bộ hệ gen (WGS): bộ gen của cả 3 dòng phage hoàn toàn không chứa gen mã hóa enzyme integrase. Sự khuyết thiếu gen này chứng minh các phage thử nghiệm thuộc nhóm phage độc chuyên tính (virulent/lytic phages), chỉ thực hiện chu trình sinh tan tiêu diệt vi khuẩn mà không tham gia vào chu trình tiềm tan, loại bỏ nguy cơ tải nạp gen độc lực hoặc gen kháng thuốc.

4. Hiệu quả phòng trị bệnh thối hạt lúa của thực khuẩn thể ngoài đồng ruộng đạt mức độ nào so với thuốc hóa học? Trong các thử nghiệm đồng ruộng tại Vĩnh Long (vụ Đông Xuân 2017–2018 và Hè Thu sớm 2018), xử lý dòng đơn ФBurAG58 hoặc hỗn hợp 3 dòng phage ở mật số 10⁸ pfu/ml (phun 2 lần trước và sau trổ) cho hiệu quả giảm bệnh thối hạt đạt khoảng 50%, tương đương với hiệu lực của thuốc đối chứng hóa học oxolinic acid (Starner 20WP), đồng thời bảo vệ tốt tỷ lệ hạt chắc và năng suất lúa thực tế.

5. Điều kiện tối hảo để nhân nuôi dòng thực khuẩn thể ФBurAG58 đạt mật số cực đại trong phòng thí nghiệm là gì? Điều kiện tối hảo gồm: sử dụng môi trường King’s B lỏng, cấy vi khuẩn ký chủ B. glumae trước 16 giờ rồi mới bổ sung phage, duy trì chỉ số đa bội nhiễm MOI = 1,0 và nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C. Điều kiện này giúp mật số thực khuẩn thể đạt giá trị log 10,00 (tương đương 10¹⁰ pfu/ml) tại thời điểm 24 giờ sau khi nhân nuôi.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Đoàn Thị Kiều Tiên đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu nghiên cứu sử dụng thực khuẩn thể bản địa trong phòng trị bệnh thối hạt lúa do vi khuẩn Burkholderia glumae tại Đồng bằng sông Cửu Long. Công trình đã tuyển chọn được 3 dòng thực khuẩn thể triển vọng thuộc họ Podoviridae (ФBurVL34, ФBurAG58, ФBurDT47a), xác định đặc tính sinh học phân tử lytic an toàn và chứng minh hiệu quả giảm bệnh ngoài đồng ruộng đạt khoảng 50%, tương đương thuốc hóa học oxolinic acid. Đồng thời, luận án đã chuẩn hóa quy trình nhân nuôi in vitro đạt mật số cao 10¹⁰ pfu/ml, cung cấp luận cứ khoa học vững chắc và giải pháp kỹ thuật khả thi cho chiến lược quản lý bệnh thối hạt lúa theo hướng nông nghiệp sinh học bền vững.