Luận án về mô hình QSAR và tổng hợp các dẫn xuất flavonoid mới

Luận án nghiên cứu mở rộng kỹ thuật xây dựng mô hình QSAR và tổng hợp các dẫn xuất flavonoid mới, góp phần vào phát triển dược phẩm.

• Trường học: Trường Đại Học
• Chuyên ngành: Hóa Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Mô Hình QSAR Và Tổng Hợp Dẫn Xuất Flavonoid Mới
• Loại tài liệu: Luận Án

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG
• 1.2. LIÊN HỆ GIỮA CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH
• 1.3. TÍNH TOÁN THÔNG TIN CẤU TRÚC
• 1.3.1. Cơ học phân tử
• 1.3.2. Cơ học lượng tử
• 1.3.3. Phương pháp bán thực nghiệm
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về mô hình QSAR

Mô hình QSAR (mô hình QSAR) là một công cụ quan trọng trong nghiên cứu hóa học, giúp thiết lập mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất. Nghiên cứu này tập trung vào việc áp dụng mô hình QSAR để thiết kế và tổng hợp các dẫn xuất flavonoid mới, nhằm cải thiện hoạt tính kháng ung thư. Các phương pháp như hồi quy tuyến tính đa biến (MLR), hồi quy thành phần chính (PCR), và mạng nơ ron nhân tạo (ANN) được sử dụng để xây dựng các mô hình này. Việc áp dụng các phương pháp này không chỉ giúp dự đoán hoạt tính kháng ung thư mà còn tiết kiệm thời gian và chi phí trong nghiên cứu thực nghiệm.

1.1. Tính toán QSAR

Tính toán QSAR (tính toán QSAR) dựa trên các tham số mô tả cấu trúc phân tử như điện tích nguyên tử, độ dịch chuyển hóa học, và các tính chất hóa lý. Các tham số này được sử dụng để xây dựng các mô hình định lượng, từ đó dự đoán hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất flavonoid. Việc sử dụng các phương pháp hóa lượng tử trong tính toán giúp nâng cao độ chính xác của các mô hình QSAR, đồng thời cung cấp thông tin quý giá về cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất.

II. Tổng hợp dẫn xuất flavonoid

Quá trình tổng hợp dẫn xuất flavonoid (tổng hợp flavonoid) là một phần quan trọng trong nghiên cứu này. Các flavonoid được chiết xuất từ các nguồn tự nhiên như gừng gió, đậu nành, và tía tô. Sau khi chiết tách, các hợp chất này được phân lập và xác định cấu trúc bằng các kỹ thuật phân tích hóa lý như phổ khối lượng và cộng hưởng từ hạt nhân. Việc tổng hợp các dẫn xuất flavonoid mới không chỉ giúp mở rộng danh mục các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư mà còn tạo ra cơ hội cho việc phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn.

2.1. Phân tích cấu trúc và hoạt tính

Phân tích cấu trúc và hoạt tính của các dẫn xuất flavonoid là bước quan trọng trong nghiên cứu. Các thông tin về cấu trúc 2D và 3D được sử dụng để xây dựng các mô hình QSAR, từ đó xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính kháng ung thư. Việc hiểu rõ mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính giúp các nhà nghiên cứu thiết kế các hợp chất mới có khả năng kháng ung thư cao hơn, đồng thời mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu dược phẩm.

III. Đánh giá hoạt tính kháng ung thư

Đánh giá hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất flavonoid là một phần không thể thiếu trong nghiên cứu này. Các hợp chất được thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào Hela để xác định hiệu quả kháng ung thư. Kết quả cho thấy một số dẫn xuất flavonoid mới có hoạt tính tốt hơn so với các hợp chất mẫu. Điều này chứng tỏ rằng việc áp dụng mô hình QSAR trong thiết kế và tổng hợp các dẫn xuất flavonoid là một phương pháp hiệu quả để phát hiện các dược chất mới có khả năng điều trị ung thư.

3.1. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy các mô hình QSAR được xây dựng có khả năng dự đoán chính xác hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất flavonoid. Các mô hình này không chỉ giúp xác định các vị trí nguyên tử quan trọng mà còn cung cấp thông tin về các nhóm chức có khả năng cải thiện hoạt tính. Việc áp dụng các phương pháp tính toán hiện đại trong nghiên cứu này mở ra nhiều cơ hội cho việc phát triển các hợp chất mới, đồng thời giảm thiểu chi phí cho các nghiên cứu thực nghiệm.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Đề tài luận án tiến sĩ: "Thiết kế, sàng lọc một số dẫn xuất flavonoid và đánh giá hoạt tính gây độc lên dòng tế bào Hela dựa vào các tính toán hóa lượng tử".

• Chuyên ngành: Hóa học (Hóa lý thuyết và Hóa lý / Hóa hữu cơ - Hóa dược).
• Hướng tiếp cận: Hỗn hợp, tích hợp giữa phương pháp hóa tính toán lượng tử, mô hình hóa quan hệ định lượng cấu trúc – hoạt tính (QSAR) và phương pháp thực nghiệm hóa học (chiết tách, phân lập, xác định cấu trúc) kết hợp thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Các phương pháp điều trị ung thư truyền thống hiện nay gồm phẫu thuật, xạ trị và hóa trị, tuy nhiên các phương pháp này vẫn đi kèm nhiều tác dụng phụ đối với bệnh nhân. Nhu cầu về các nguồn dược chất mới có khả năng phòng ngừa và điều trị ung thư rất lớn nhưng khả năng đáp ứng thực tế còn hạn chế. Nhóm hợp chất tự nhiên flavone và isoflavone phân bố nhiều trong thực vật, sở hữu các hoạt tính sinh học giá trị như kháng oxy hóa, kháng viêm và kháng ung thư.

Mặc dù các nghiên cứu thực nghiệm đã cung cấp cơ sở dữ liệu về nguồn dược chất tự nhiên, các quy trình thực nghiệm thuần túy gặp nhiều hạn chế trong việc tạo ra hợp chất có hoạt tính hiệu quả một cách nhanh chóng và kinh tế. Mặt khác, các nghiên cứu lý thuyết trong nước và quốc tế về nhóm flavone, isoflavone có hoạt tính kháng ung thư cổ tử cung còn khiêm tốn. Do đó, việc nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính nhằm định hướng thiết kế các dẫn xuất mới có hoạt tính nâng cao là tiền đề cần thiết để định hướng cho các nghiên cứu thực nghiệm.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 4 mục tiêu cụ thể:

1. Tính toán, sàng lọc các tham số mô tả phân tử gồm: tham số điện tích, độ dịch chuyển hóa học, tính chất hóa lý, tham số 2D và 3D của các dẫn xuất flavonoid.
2. Xây dựng các mô hình quan hệ cấu trúc – hoạt tính có khả năng dự đoán hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất flavone và isoflavone có cấu trúc tương tự.
3. Sàng lọc, phân lập, xác định cấu trúc và thử nghiệm in vitro hoạt tính kháng ung thư của 06 hợp chất flavonoid từ actiso, xa kê, đậu nành, tía tô, gừng gió.
4. Thiết kế, sàng lọc các dẫn xuất flavone và isoflavone, đánh giá hoạt tính kháng ung thư cổ tử cung cũng như các tính chất hóa lý của các dẫn xuất flavonoid mới thiết kế từ flavonoid mẫu.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu:
  • Khung cấu trúc các hợp chất flavonoid, trọng tâm là các phân nhóm flavone và isoflavone.
  • 06 hợp chất flavonoid tự nhiên được phân lập từ 5 đối tượng thực vật: lá tía tô, lá xa kê, lá actiso, hạt đậu nành và củ gừng gió.
  • Dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa người.
• Phạm vi nghiên cứu:
  • Về mặt lý thuyết và tính toán: Tối ưu hóa cấu trúc bằng phương pháp cơ học phân tử (MM+); tính toán các tham số cấu trúc lượng tử và hóa lý bằng các phương pháp bán thực nghiệm (CNDO, INDO, MNDO, AM1, PM3, TNDO); xây dựng và kiểm định các mô hình toán học hồi quy tuyến tính đa biến (MLR), hồi quy thành phần chính (PCR), hồi quy bình phương cực tiểu riêng phần (PLS), mạng nơ-ron nhân tạo (ANN, PCA-ANN) kết hợp giải thuật di truyền (GA).
  • Về mặt thực nghiệm: Chiết xuất, phân lập tinh sạch bằng sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng; xác định cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HSQC, HMBC) và nhiễu xạ tia X đơn tinh thể; đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro theo phương pháp Sulforhodamine B (SRB) xác định giá trị $p\text{GI}_{50}$.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được điểm lại trong văn bản

Tác giả đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế theo các nhóm nội dung:

• Bệnh học ung thư cổ tử cung và các yếu tố nguy cơ: Ung thư là tập hợp bệnh lý đặc trưng bởi sự phân chia tế bào mất kiểm soát, xâm lấn và di căn qua hệ tuần hoàn và bạch huyết [6]. Dịch tễ học ghi nhận ung thư cổ tử cung là một trong các bệnh phổ biến ở nữ giới, tập trung ở độ tuổi 30–59 [57, 70, 96, 112]. Triệu chứng lâm sàng gồm xuất huyết bất thường, đau nhức và suy kiệt [32]. Điều trị ở giai đoạn sớm (1 và 2) cho tỷ lệ khỏi 80–90%, trong khi giai đoạn muộn (3 và 4) chỉ đạt 3–25% [96]. Các yếu tố gây bệnh được tổng hợp gồm bức xạ, hóa chất công nghiệp (amiăng, polyvinyl clorua, nitrosamin), độc tố vi nấm (Aspergillus sinh aflatoxin) [26], lối sống, thuốc ngừa thai/DES [23, 99], virus [26] và yếu tố di truyền [62].
• Mối quan hệ định lượng cấu trúc – hoạt tính (QSAR/QSPR): Tiếp cận theo mô hình của Testa và Kier [17, 93], xem xét mối liên hệ biện chứng giữa cấu trúc (S), tính chất (P) và hoạt tính/tác dụng sinh học (A) thông qua biểu diễn giản đồ Venn và hàm toán học tổng quát $QSXR$. Cấu trúc phân tử được mô tả ở 3 mức độ: mức hình học (2D, 3D), mức lập thể điện tử (thể tích, diện tích bề mặt, phân bố điện tích, thế tĩnh điện) và mức tương tác môi trường (độ tan, hệ số phân bố, khả năng solvat hóa).
• Hóa toán và phương pháp tính toán lượng tử: Cơ học phân tử MM+ tính toán thế năng phân tử qua các thành phần biến dạng liên kết, góc liên kết, góc xoay, Van der Waals, liên kết hydro và tĩnh điện [25, 102]. Cơ học lượng tử dựa trên phương trình Schrödinger, toán tử Hamilton, phép xấp xỉ Born – Oppenheimer và định lý Hellmann – Feynman [60, 100]. Các phương pháp bán thực nghiệm (AM1, PM3, MNDO, CNDO, INDO, TNDO) được sử dụng để trích xuất điện tích nguyên tử, độ dịch chuyển hóa học NMR và tham số hóa lý.
• Kỹ thuật thống kê và trí tuệ nhân tạo: Phân tích hồi quy đa biến (MLR), kiểm định Fisher ($F$-test) và Student ($t$-test) [51, 66]; hồi quy thành phần chính (PCR) giải bài toán đa cộng tuyến qua thuật toán Jacobi [52, 107]; phương pháp bình phương cực tiểu riêng phần (PLS) giải theo thuật toán NIPALS [51, 106]; giải thuật di truyền (GA) tối ưu hóa tổ hợp biến dựa trên hàm thích nghi Friedman LOF [7, 10, 69, 76, 77, 110]; mạng nơ-ron nhân tạo (ANN) với thuật toán lan truyền ngược (Back-Propagation) điều chỉnh trọng số [5, 16, 21, 22, 30, 50, 86, 90, 95, 97, 101, 114].
• Hóa học và hoạt tính sinh học của Flavonoid: Cấu trúc khung $C_{15}$ ($C_6-C_3-C_6$) [74]; phân loại gồm euflavonoid, isoflavonoid, neoflavonoid, biflavonoid, triflavonoid, flavolignan [20]; phân bố trong các họ thực vật Leguminosae, Rutaceae, Moraceae, Ericaceae, Anacardiaceae [81]. Tác giả điểm lại các hoạt tính: chống oxy hóa liên quan đến liên kết đôi $C_2=C_3$ và nhóm carbonyl $C_4$ [67, 81]; kháng virus HIV của baicalin từ Scutellaria baicalensis [54], robustaflavone và hinokiflavone ($\text{IC}{50} = 65,\mu\text{M}$) [45]; kháng viêm của 8-hydroxyluteolin ($\text{IC}{50} \approx 10,\mu\text{M}$) [78], cyanidin ($\text{IC}{50} = 60-90,\mu\text{M}$); gây độc tế bào ung thư của pedicin từ Fissistigma lanuginosum ($\text{IC}{50} = 300,\mu\text{M}$) [74], flavanone từ Baeckea frutescens trên dòng bạch cầu L210 ($\text{IC}_{50} = 0,25,\mu\text{g/mL}$) [105], baicalein, kaempferol-3-$O$-$\beta$-D-glucopyranosid và tricin từ Wikstroemia indica [81].

Khoảng trống luận án giải quyết

Luận án kết nối giữa nghiên cứu hóa tính toán và thực nghiệm thực tế: thiết lập các mô hình QSAR tuyến tính và phi tuyến có độ tin cậy cao trên dòng tế bào HeLa, đồng thời phân lập trực tiếp 6 hợp chất flavonoid tự nhiên từ nguồn dược liệu trong nước (gừng gió, đậu nành, tía tô, xa kê, actiso) làm cấu trúc mẫu để dự báo và thiết kế các dẫn xuất mới có hoạt tính gây độc tế bào nâng cao.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Lý thuyết cấu trúc – tính chất – hoạt tính: Dựa trên quan điểm hóa học và sinh hóa hiện đại, phân tử hoạt tính gồm khung phân tử mang tính chất lý hóa và các nhóm chức quyết định tương tác sinh học.
• Phương pháp trường lực cơ học phân tử MM+: Năng lượng phân tử được mô hình hóa theo tổng năng lượng thành phần: $$E = E_b + E_a + E_t + E_v + E_h + E_e$$ (trong đó $E_b$: biến dạng liên kết; $E_a$: biến dạng góc liên kết; $E_t$: năng lượng xoay; $E_v$: tương tác Van der Waals; $E_h$: liên kết hydro; $E_e$: tương tác tĩnh điện).
• Phương pháp cơ học lượng tử và bán thực nghiệm: Giải phương trình Schrödinger trạng thái dừng $\hat{H}\Psi = E\Psi$ dưới phép xấp xỉ Born – Oppenheimer, sử dụng các Hamiltonian bán thực nghiệm (CNDO, INDO, MNDO, AM1, PM3, TNDO) để tính mật độ điện tích nguyên tử ($Q_i$), độ dịch chuyển hóa học ($\delta_i$) và năng lượng obitan phân tử.
• Lý thuyết học máy và thống kê đa biến:
  • Mô hình hồi quy tuyến tính đa biến (MLR): $\hat{y} = b_0 + \sum b_i X_i$, tối thiểu hóa tổng bình phương phần dư ($RSS$).
  • Hồi quy thành phần chính (PCR): Biến đổi hệ biến độc lập $X$ thành các thành phần chính $W = XZ$ trực giao nhằm triệt tiêu hiện tượng đa cộng tuyến.
  • Hồi quy bình phương tối thiểu riêng phần (PLS): Sử dụng thuật toán NIPALS để trích xuất các biến ẩn $t_k$ đồng thời tối đa hóa hiệp phương sai giữa biến độc lập $X$ và biến phụ thuộc $y$.
  • Giải thuật di truyền (GA): Tối ưu chọn lọc biến với nhiễm sắc thể nhị phân ($0/1$), sử dụng hàm mục tiêu Friedman LOF: $$LOF = \frac{RSS_p/N}{\left(1 - \frac{d(p+1)}{N}\right)^2}$$ Toán tử di truyền gồm chọn lọc bánh xe lăn (roulette wheel), xếp hạng tuyến tính, lai chéo đơn điểm, hai điểm, đồng nhất và đột biến điểm.
  • Mạng nơ-ron nhân tạo (ANN): Cấu trúc nhiều lớp $I(j) - HL(k) - HL(m) - O(n)$, sử dụng hàm kích hoạt Sigmoid $f(u) = \frac{1}{1 + e^{-u}}$, thuật toán lan truyền ngược cập nhật trọng số dựa trên sai số $E = \frac{1}{2}\sum (t_j - y_j)^2$.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quy trình thực nghiệm	Phương pháp / Thiết bị / Hóa chất	Thông số kỹ thuật / Điều kiện thực hiện
Chiết xuất	Ngâm chiết hồi lưu	Dung môi ethanol ($\text{EtOH}$) [105]
Phân lập tinh sạch	Sắc ký cột (CC) và sắc ký lớp mỏng (TLC)	Pha tĩnh: Silica gel pha thường, Sephadex LH20, pha đảo RP18 [3, 59]
Phát hiện chất	Đèn tử ngoại (UV) và thuốc thử hóa học	Bước sóng $254,\text{nm}$ và $365,\text{nm}$; thuốc thử dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4/\text{EtOH}$ [37, 94]
Xác định cấu trúc	Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)	$^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, phổ 2D (HSQC, HMBC) [4]
Cấu trúc không gian	Nhiễu xạ tia X đơn tinh thể	Phân tích tinh thể đơn (X-ray diffraction)
Thử nghiệm sinh học	Thử độc tính tế bào in vitro (phương pháp SRB)	Dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, môi trường $\text{E'MEM}$ (Sigma), đĩa 96 giếng ($10^4$ tế bào/giếng), $37^\circ\text{C}$, $5%,\text{CO}_2$ [91, 98]
Phép đo quang phổ	Đo mật độ quang (OD)	Bước sóng $\lambda_1 = 490,\text{nm}$ và $\lambda_2 = 620,\text{nm}$
Chất đối chứng	Chuẩn dương và chuẩn âm	Đối chứng dương: Camptothecin $0,01,\mu\text{g/mL}$; Đối chứng âm: nước cất vô trùng $10%$ và $\text{DMSO } 0,25%$
Xử lý thống kê	Đánh giá chéo loại bỏ dần (Leave-one-out)	Phần mềm Microsoft Office Excel 2007, bộ phần mềm QSARIS; tính $PRESS$, $Q^2$, $SDEP$, $R^2_{pr}$, $GMP_{mxi,%}$

Nguồn tư liệu và dữ liệu

• Dữ liệu thực vật: Thu hái và phân lập từ 5 đối tượng thực vật: lá tía tô (Perilla frutescens), lá xa kê (Artocarpus altilis), lá actiso (Cynara scolymus), hạt đậu nành (Glycine max), củ gừng gió (Zingiber zerumbet).
• Dữ liệu tính toán lượng tử: Tọa độ phân tử, bộ tham số điện tích nguyên tử, độ dịch chuyển hóa học và tham số 2D/3D được tính toán thông qua các phần mềm tính toán hóa học chuyên dụng và chương trình QSARIS.

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày bối cảnh nghiên cứu về bệnh ung thư cổ tử cung, tầm quan trọng của nhóm hợp chất flavonoid trong tự nhiên, tính tất yếu của việc ứng dụng các phương pháp hóa tính toán và mô hình hóa QSAR nhằm rút ngắn thời gian và giảm chi phí thử nghiệm thực nghiệm. Xác định rõ mục tiêu, đối tượng, phạm vi nghiên cứu, ý nghĩa khoa học và 4 đóng góp mới của luận án.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này gồm 6 nội dung trọng tâm:

1. Bệnh ung thư cổ tử cung: Trình bày dịch tễ học, cơ chế hình thành khối u tại biểu mô cổ tử cung ở phụ nữ độ tuổi 30–59, các triệu chứng lâm sàng và các giai đoạn phát triển của bệnh. Tổng quan các phương pháp điều trị hiện hành và phân tích các nhóm nguyên nhân gây bệnh (hóa học, bức xạ, vi sinh vật, lối sống, di truyền).
2. Liên hệ giữa cấu trúc và hoạt tính: Khái quát hóa lý thuyết QSAR/QSPR theo Testa và Kier. Phân tích các cấp độ mô tả cấu trúc phân tử (hình học 2D/3D, lập thể điện tử, tương tác môi trường) và vai trò của các nhóm chức đối với hoạt tính sinh học.
3. Tính toán thông tin cấu trúc: Trình bày chi tiết cơ sở toán học và vật lý của phương pháp cơ học phân tử MM+ và các phương pháp cơ học lượng tử bán thực nghiệm (CNDO, INDO, MNDO, AM1, PM3, TNDO) dùng để xác định điện tích nguyên tử $Q_i$ và độ dịch chuyển hóa học $\delta_i$.
4. Các mô hình toán học: Trình bày bản chất thuật toán và phương trình toán học của 4 lớp mô hình dự báo:
   • Hồi quy tuyến tính đa biến (MLR), các tiêu chuẩn kiểm định $F$-test và $t$-test.
   • Hồi quy thành phần chính (PCR) và quy trình chéo hóa ma trận bằng phương pháp Jacobi.
   • Hồi quy bình phương cực tiểu riêng phần (PLS) theo giải thuật NIPALS.
   • Giải thuật di truyền (GA) trong sàng lọc tổ hợp biến mô tả với các hàm thích nghi Fit1 ($R^2_{ad}$) và Fit2 ($LOF$).
   • Mạng thần kinh nhân tạo (ANN) với kiến trúc nhiều lớp và thuật toán lan truyền ngược (Back-Propagation).
   • Các đại lượng thống kê đánh giá mô hình: $PRESS$, $Q^2$ (yêu cầu $Q^2 \ge 0$), $R^2_{pr}$ (yêu cầu $R^2_{pr} > 0,5$), $SDEP$ và đóng góp trung bình toàn cục $GMP_{mxi,%}$.
5. Hợp chất Flavonoid: Khung cấu tạo $C_{15}$, cách đánh số nguyên tử trên khung phân tử. Hệ thống hóa 6 phân nhóm dẫn xuất chính và phân bố tự nhiên. Tổng hợp dữ liệu hoạt tính sinh học (kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật, ức chế enzyme, kháng viêm, độc tế bào ung thư).
6. Phân lập và xác định cấu trúc Flavonoid: Tổng quan quy trình ngâm chiết ethanol, phân tách sắc ký cột (Silica gel, Sephadex LH20, RP18), sắc ký lớp mỏng, các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D, nhiễu xạ tia X và quy trình thử hoạt tính gây độc tế bào HeLa bằng phương pháp nhuộm SRB.

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết các bước triển khai kỹ thuật của luận án:

• Quy trình tối ưu hóa hình học không gian phân tử flavonoid bằng phương pháp MM+.
• Phương pháp tính toán các thông số điện tích, độ dịch chuyển hóa học và tham số hóa lý bán thực nghiệm.
• Thiết lập quy trình chọn biến bằng thuật toán di truyền (GA) và huấn luyện các mô hình QSAR (MLR, PCR, PLS, ANN).
• Quy trình thực nghiệm chiết tách, phân lập 6 hợp chất flavonoid từ 5 nguồn thực vật; thông số vận hành các thiết bị đo phổ NMR và nhiễu xạ tia X.
• Giao thức chuẩn thử nghiệm sinh học in vitro đo tỷ lệ ức chế tăng trưởng tế bào HeLa theo phương pháp SRB.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương kết quả tập trung vào các phát hiện chính:

• Phân lập và cấu trúc 06 flavonoid thực nghiệm: Xác định chính xác cấu trúc hóa học và đo hoạt tính thực nghiệm $p\text{GI}_{50}$ in vitro trên dòng tế bào HeLa của 6 hợp chất flavonoid tinh khiết tách từ lá tía tô, lá xa kê, lá actiso, hạt đậu nành và củ gừng gió.
• Xây dựng và đánh giá các mô hình QSAR: Thiết lập thành công các mô hình: QESAR (dựa trên điện tích), QSDAR (dựa trên độ dịch chuyển hóa học), QSSR, QSARNMR, QSARANN, QSARPCA-ANN, QSARPCR và QSARPLS. Khả năng dự báo của các mô hình đạt độ tương quan cao thông qua các giá trị $Q^2$ và $R^2_{pr} > 0,5$.
• Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính: Đánh giá định lượng phần trăm đóng góp $GMP_{mxi,%}$ của từng vị trí nguyên tử và nhóm thế trên khung phân tử flavonoid đối với khả năng ức chế tế bào ung thư HeLa.
• Thiết kế và dự báo dẫn xuất mới: Dựa trên các mô hình QSAR đã tối ưu, thiết kế các dẫn xuất flavone và isoflavone mới từ cấu trúc chất mẫu; dự báo hoạt tính sinh học và tính chất hóa lý. Kết quả cho thấy các dẫn xuất mới được thiết kế có hoạt tính kháng tế bào HeLa dự đoán tốt hơn hoạt tính của các chất mẫu tự nhiên ban đầu.

Kết luận và kiến nghị

Tổng kết toàn bộ các kết quả tính toán lý thuyết và thực nghiệm đã đạt được; nêu các kiến nghị phát triển hướng nghiên cứu tiếp theo.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

1. Xác định được cấu trúc hóa học và thử nghiệm hoạt tính $p\text{GI}_{50}$ in vitro đối với dòng tế bào ung thư HeLa cho 06 hợp chất flavonoid phân lập từ lá tía tô, lá xa kê, lá actiso, hạt đậu nành và củ gừng gió.
2. Tính toán và sàng lọc có hệ thống các tham số mô tả cấu trúc phân tử (tham số điện tích nguyên tử, độ dịch chuyển hóa học NMR, tham số 2D và 3D) ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất flavonoid.
3. Xây dựng và đánh giá thành công khả năng dự báo của một chuỗi các mô hình QSAR đa biến và phi tuyến: QESAR, QSDAR, QSSR, QSARNMR, QSARANN, QSARPCA-ANN, QSARPCR, QSARPLS.
4. Ứng dụng các mô hình QSAR đã thiết lập để dự đoán hoạt tính kháng ung thư và tính chất hóa lý của các hợp chất mới được thiết kế từ các chất mẫu tự nhiên. Hoạt tính kháng ung thư của các hợp chất mới thiết kế có giá trị dự báo vượt trội so với các chất mẫu ban đầu.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Ứng dụng quy trình tính toán QSAR kết hợp giữa hóa lượng tử và trí tuệ nhân tạo làm công cụ tiền thực nghiệm nhằm sàng lọc, định hướng gắn nhóm thế tại các vị trí nguyên tử trọng yếu trên khung flavonoid trước khi tiến hành tổng hợp hóa học, giúp tiết kiệm kinh phí và hóa chất.
• Mở rộng phương pháp luận này cho việc nghiên cứu, thiết kế và sàng lọc các nhóm hợp chất tự nhiên khác từ nguồn dược liệu phong phú tại Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Dữ liệu thực nghiệm phân lập trong công trình tập trung vào 6 hợp chất flavonoid từ 5 loài thực vật cụ thể; thử nghiệm độc tính sinh học in vitro giới hạn trên một dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa; các tính toán cấu trúc lượng tử dựa trên các phương pháp bán thực nghiệm và cơ học phân tử MM+.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng tổng hợp hóa học thực tế đối với các dẫn xuất mới được thiết kế có hoạt tính dự báo cao để kiểm chứng thực nghiệm.
  • Thử nghiệm đánh giá hoạt tính độc tế bào trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau nhằm khảo sát tính chọn lọc sinh học.
  • Ứng dụng các phương pháp hóa lượng tử mức độ cao hơn (như phiếm hàm mật độ DFT/ab-initio) để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tương tác ở mức phân tử.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học chuyên ngành Hóa học lý thuyết, Hóa lý và Hóa dược: Cung cấp khung phương pháp luận đầy đủ về kỹ thuật tính toán thông số lượng tử, quy trình lựa chọn biến bằng giải thuật di truyền (GA), phương pháp xây dựng và thẩm định chéo các mô hình QSAR tuyến tính (MLR, PCR, PLS) và phi tuyến (ANN, PCA-ANN).
• Đối với các nhà nghiên cứu Hóa học các hợp chất thiên nhiên: Cung cấp quy trình chiết tách, phân lập bằng sắc ký cột đa pha (Silica gel, Sephadex LH20, RP18) và bộ dữ liệu phổ NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, HSQC, HMBC), nhiễu xạ tia X của các dẫn xuất flavonoid từ gừng gió, đậu nành, tía tô, xa kê, actiso.
• Đối với các nhà nghiên cứu Dược học và Độc chất học: Cung cấp quy trình chi tiết về thử nghiệm độc tế bào in vitro bằng phương pháp nhuộm SRB trên đĩa 96 giếng đối với tế bào HeLa.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã sử dụng những phương pháp bán thực nghiệm nào để tính toán tham số cấu trúc lượng tử?

Theo nội dung công bố, luận án đã sử dụng 6 phương pháp tính toán hóa lượng tử bán thực nghiệm bao gồm: CNDO, INDO, MNDO, AM1, PM3 và TNDO để tính toán các thông số điện tích nguyên tử ($Q_i$), độ dịch chuyển hóa học phổ NMR ($\delta_i$) và các tham số hóa lý phân tử.

2. Sáu hợp chất flavonoid thực nghiệm được phân lập từ những nguồn thực vật nào?

Sáu hợp chất flavonoid được chiết tách và phân lập tinh khiết từ 5 đối tượng thực vật trong nước gồm: lá tía tô (Perilla frutescens), lá xa kê (Artocarpus altilis), lá actiso (Cynara scolymus), hạt đậu nành (Glycine max) và củ gừng gió (Zingiber zerumbet).

3. Quy trình thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro trên dòng tế bào HeLa được tiến hành như thế nào?

Thử nghiệm được thực hiện bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang phổ nhuộm Sulforhodamine B (SRB). Tế bào ung thư HeLa được nuôi trong môi trường $\text{E'MEM}$ có bổ sung phenol red $0,4%$, L-glutamine $200,\text{mM}$, $\text{NaHCO}_3,7,5%$, $\text{HEPES } 1,\text{M}$, Penicillin-Streptomycin $200,\text{IU/mL}$, Amphotericin-B $0,1%$ và huyết thanh phôi thai bò $5%$, nuôi trên đĩa 96 giếng với mật độ $10^4$ tế bào/giếng ở $37^\circ\text{C}$, $5%,\text{CO}_2$. Sau 24 giờ nuôi cấy, tế bào được ủ với dung dịch flavonoid nồng độ $100,\mu\text{g/mL}$ trong 48 giờ, nhuộm SRB và đo mật độ quang (OD) tại bước sóng $490,\text{nm}$ và $620,\text{nm}$. Chất đối chứng dương là Camptothecin $0,01,\mu\text{g/mL}$; đối chứng âm là nước cất vô trùng $10%$ và $\text{DMSO } 0,25%$.

4. Các mô hình QSAR được xây dựng và kiểm định qua các chỉ số thống kê nào?

Luận án đã thiết lập các mô hình QSAR đa dạng gồm: QESAR, QSDAR, QSSR, QSARNMR, QSARANN, QSARPCA-ANN, QSARPCR, QSARPLS. Khả năng dự báo của các mô hình được đánh giá qua kỹ thuật kiểm định chéo loại bỏ dần từng trường hợp (Leave-one-out cross-validation) với các tham số: tổng bình phương sai số dự báo ($PRESS$), hệ số tương quan chéo ($Q^2 \ge 0$), độ lệch chuẩn dự báo ($SDEP$), hệ số tương quan dự báo tập kiểm tra ($R^2_{pr} > 0,5$) và tỷ lệ phần trăm đóng góp trung bình toàn cục ($GMP_{mxi,%}$).

---

Kết luận

Luận án đã xây dựng hoàn chỉnh quy trình tích hợp giữa phương pháp hóa tính toán lượng tử, mô hình hóa QSAR và thực nghiệm hóa dược nhằm sàng lọc, thiết kế các dẫn xuất flavonoid có hoạt tính ức chế dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa. Công trình đã phân lập, giải cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính in vitro của 6 flavonoid tự nhiên từ tía tô, xa kê, actiso, đậu nành và gừng gió làm cấu trúc mẫu. Dựa trên các mô hình dự báo tin cậy đã thiết lập (QESAR, QSDAR, QSARANN, QSARPLS...), luận án đã thiết kế thành công các dẫn xuất flavone và isoflavone mới có hoạt tính kháng tế bào HeLa dự báo cao hơn các hợp chất tự nhiên ban đầu, tạo cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tổng hợp và phát triển dược chất mới.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 1. Các nguyên nhân gây ung thư Ung thư là một tập hợp các bệnh liên quan đến sự phân chia tế bào một cách mất kiểm soát, tiếp theo là quá trình các tế bào đó xâm lấn và di căn đến các mô khác qua hệ thống bạch huyết và máu [6].

Giai đoạn di căn là nguyên nhân chính gây tử vong của bệnh nhân ung thư. Hiện nay có trên 100 bệnh ung thư có loại từ bắp thịt và xương, có loại từ da hoặc lớp lót của các cơ quan, có loại xuất phát từ máu. Ở nam giới thường gặp ung thư phổi, gan, đại trực tràng, dạ dày, vòm hầu, thanh quản, thực quản, tuyến tiền liệt, ung thư máu [58, 70]. Ở nữ giới thường gặp ung thư vú, cổ tử cung, đại trực tràng, phổi, tuyến giáp, buồng trứng, gan, dạ dày, thân tử cung, da [70].

Ung thư làm cho cơ thể bệnh nhân tử vong bằng nhiều cách, nhưng đa số là làm cho cơ thể suy kiệt với các bệnh cơ hội. Trong đó, bệnh ung thư cổ tử cung hình thành ở biểu mô cổ tử cung (cổ tử cung là cơ quan nối giữa âm đạo với buồng trứng) [57, 96]. Ung thư cổ tử cung bắt đầu ở niêm mạc cổ tử cung, tại đây các tế bào phát triển bất bình thường và khó kiểm soát dẫn đến hình thành khối u. Phụ nữ trong độ tuổi từ 30 đến 59 thường dễ mắc bệnh hơn cả.

Đây là căn bệnh có thể điều trị và phòng ngừa nếu phát hiện sớm [96, 112]. Triệu chứng biểu hiện bệnh: âm đạo xuất huyết bất thường, có mùi khó chịu, cơ thể bệnh nhân gầy gò, da trắng bệch, cơ thể đau nhức [32]. Điều trị bệnh: tuỳ theo giai đoạn phát triển của bệnh mà được điều trị theo phác đồ khác nhau: giai đoạn 1 ung thư khu trú tại cổ tử cung; giai đoạn 2 ung thư xâm lấn vùng lân cận; giai đoạn 3 ung thư xâm lấn xa hơn; giai đoạn 3 di căn sang các bộ phận khác của cơ thể [96]. Giai đoạn 1 và 2: chỉ cần mổ và chiếu xạ thì khả năng khỏi bệnh sẽ rất cao, tỉ lệ khỏi bệnh là 80 – 90%.

Giai đoạn 3 và 4 chủ yếu là xạ trị, tỉ lệ khỏi bệnh rất thấp từ 3 – 25 %, tuỳ theo mức độ nặng hay nhẹ của bệnh [96]. 4 Các yếu tố bên ngoài gây bệnh ung thư bao gồm: các tia X, chất phóng xạ, tia cực tím, hóa chất gây hư hại cấu trúc gen di truyền. Các sản phẩm công nghiệp như: amiăng gây ung thư phổi; polivinylclorua gây ung thư gan; nitrosamin gây ung thư bao tử; các phẩm màu trong bánh kẹo, hay một số sản phẩm trong thuốc nhuộm tóc, các hoá chất kích thích trong chăn nuôi nhiễm estrogen cũng gây ung thư; thuốc ngừa thai và các chất kích thích nội tiết tố như DES (diethylstilbestrol) có khả năng gây ung thư; thuốc trừ sâu, rầy như DDT cũng có khả năng gây ung thư [23, 99]. Ô nhiễm không khí: các hoá chất gây ô nhiễm không khí như CO 2, hidrocacbon, benzopiren, bụi amiăng, khói thuốc lá gây ung thư phổi [70].

Ngoài ra còn có độc tố của nấm mốc chứa aflatoxin có trong nấm Aspergillus gây ung thư [26]. Các yếu tố do lối sống có thể là nguyên nhân gây bệnh ung thư như các hoá chất trong thuốc lá gây ung thư phổi, rượu gây ung thư thực quản; chế độ ăn gây ung thư: ăn nhiều mỡ động vật, bơ, ăn nhiều calo, ăn thiếu chất xơ, uống rượu, hay sử dụng thực phẩm không an toàn là nguyên nhân gây ung thư [23, 62]. Yếu tố sinh học gây ung thư thể hiện ở một số ít căn bệnh ung thư ở người được cho là do vi rút như ung thư gan, ung thư vòm họng, ung thư cổ tử cung [26]. Yếu tố di truyền gây ung thư chiếm tỉ lệ thấp, một số loại như ung thư mắt, ung thư vú, có khuynh hướng dễ gặp trong cùng một gia đình.

Tuy nhiên, yếu tố di truyền không có tầm quan trọng về mặt thực tiễn [62]. Điều trị Một số liệu pháp chính trong điều trị ung thư: phẫu trị là dùng lưỡi dao mổ để loại bỏ tận gốc khối u; xạ trị là phương pháp sử dụng dùng tia phóng xạ tàn tiêu diệt các tế bào ung thư; hoá trị là dùng hoá chất để tiêu diệt tế bào ung thư; liệu pháp miễn dịch là liệu pháp tăng cường khả năng đề kháng tự nhiên của cơ thể để kháng lại sự phát triển của tế bào ung thư [23, 58]. Phẫu thuật và xạ trị có ưu điểm là tấn công mạnh các loại ung thư thời kì còn khu trú, nhưng phương pháp này không hiệu quả khi ung thư di căn trên cơ thể người bệnh. Đối với phương pháp hoá trị chỉ cho kết quả tạm thời và không hiệu 5 quả.

Liệu pháp miễn dịch chưa được nghiên cứu chuyên sâu nên chỉ là phương pháp bổ trợ trong điều trị bệnh [58, 96]. Phòng ngừa Biện pháp phòng ngừa ung thư bao gồm một số biện pháp như: Giảm thiểu việc tiếp xúc với thuốc lá, rượu, hoá chất công nghiệp; thực hiện các biện pháp bảo vệ cơ thể chặt chẽ khi tiếp xúc với tia phóng xạ; ngừa ung thư qua việc chọn lựa chế độ ăn uống an toàn như không nên ăn một số thức ăn được khuyến cáo có thể gây ung thư, thức ăn có chứa các hóa chất nguy hiểm và các hormon; khám sức khoẻ định kỳ, tầm soát ung thư sớm đều đặn; tiêm vacxin ngừa ung thư; lối sống lành mạnh [47, 99]. LIÊN HỆ GIỮA CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH Liên hệ giữa cấu trúc – hoạt tính là nguyên tắc cơ bản nhất để xây dựng các mô hình quan hệ cấu trúc – hoạt tính (QSAR) hay mô hình quan hệ cấu trúc – tính chất (QSPR), mô hình quan hệ cấu trúc - cấu trúc để dự đoán tính chất vì cấu trúc – tính chất - hoạt tính có mối quan hệ biện chứng với nhau, là các mối liên hệ nhân – quả có thể được tính toán một cách chính xác và thiết lập theo những mô hình toán học rõ ràng [17, 93]. Theo Testa và Kier, quan hệ định lượng cấu trúc – tác dụng là tổng hòa các mối quan hệ thể hiện trên Hình 1.

Trên cơ sở này nhiều kiểu mô hình được xây dựng với các thông tin về cấu trúc khác nhau. Mô hình tổng quát dạng QSXR: X có thể là A – hoạt tính (Activity); tính chất – P (Property); cấu trúc – S (Structure) [17, 93]. Cấu trúc – tính chất không phải lúc nào cũng được phân định rõ ràng, nên mối liên quan giữa chúng được biểu hiện bằng phần giao trên giản đồ Venn, Hình 1. Tính chất – tác dụng có thể là một trong một số trường hợp nên mối liên quan giữa tính chất và tác dụng cũng được diễn tả bằng giản đồ Venn có phần giao.

Cấu trúc – hoạt tính có sự phân định rõ ràng nên mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng, điều này được mô tả bởi hai vòng tròn không có phần giao nhau mà tiếp xúc tại một điểm. 6 Hoạt tính Dữ liệu Tính chất cấu trúc Sàng lọc dữ liệu QSXR X=aixi + b0 Mô hình phân tử Hình 1.1 Mối liên quan định lượng cấu trúc, tính chất, độ phản ứng, hoạt tính Tính chất Cấu trúc Tác dụng Hình 1.2 Giản đồ Venn mối liên quan định lượng cấu trúc và tác dụng [93] Theo quan điểm hóa học, một phân tử có tác dụng sinh học mang hai nhóm chức: nhóm tác dụng (thường có cấu tạo đặc biệt) và nhóm ảnh hưởng (thường là các nhóm có khả năng thay đổi tính chất lý hóa của phân tử như hydroxyl, halogen, carboxyl, nitro,. Theo quan điểm sinh hóa, một phân tử có tác dụng sinh học có 2 thành phần chính: Khung phân tử đặc trưng cho tính chất lý hóa, còn nhóm chức quyết định hoạt tính sinh học [17, 93]. Theo quan điểm hiện đại, phân tử hợp chất là một thể thống nhất (gồm các nguyên tử tạo khung phân tử, nhóm chức.

Tác dụng sinh học không những do 7 cấu trúc phân tử trực tiếp quyết định mà còn gián tiếp chịu ảnh hưởng bởi các quá trình như hấp thụ, vận chuyển, phân bố hay chuyển hóa của phân tử trong cơ thể sinh vật [17, 93]. Do đó, khi nghiên cứu mô hình liên quan giữa cấu trúc với tác dụng, cấu trúc với hoạt tính người ta không những phải khảo sát cấu trúc mà còn xem xét những yếu tố ảnh hưởng. Mô tả cấu trúc phân tử: cấu trúc hóa học là sự sắp xếp trong không gian của các nguyên tử trong lượng mô tả hay thông tin cấu trúc [17, 93]. Mức hình học: cấu trúc phân tử có thể được trình bày dưới dạng 2 chiều (thông tin cấu trúc gồm độ liên kết nguyên tử, cấu hình Z/E) hay 3 chiều (thông tin cấu trúc gồm cấu hình tương đối cũng như cấu hình tuyệt đối).

Các thông tin của cấu trúc 2 chiều (2D) và 3 chiều (3D) hữu ích cho nghiên cứu mối liên quan định lượng cấu trúc và tác dụng [17, 93]. Mức lập thể điện tử: đó là vật thể có thể tích và hình thù nhất định như cấu trúc lập thể có tính chất cơ động hay là cấu trúc lập thể với sự phân bố mật độ điện tử của các nguyên tử [17, 93]. Các thông tin cấu trúc bao gồm thể tích, diện tích bề mặt, sự thay đổi cấu dạng, sự phân bố điện tử, thế tĩnh điện phân tử,. Các thông tin này có thể có từ tính toán trên máy tính, đặc biệt là sử dụng các phương pháp hóa lượng tử.

Mức tương tác với môi trường: cấu trúc phân tử thể hiện hoạt tính, độc tính, điểm chảy, điểm sôi, khả năng solvat hóa, tính chất sắc ký, hệ số phân bố, độ tan, áp suất tới hạn, v.v, trong môi trường sinh học [17, 93]. Cấu trúc phân tử ảnh hưởng đặc biệt quan trọng đối với hoạt tính sinh học, đó là chìa khóa quan trọng để thiết lập mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính. Sự phát triển của mối liên hệ này làm nền tảng để xây dựng các mô hình có khả năng dự đoán. Với một chuỗi các hợp chất có cấu trúc tương tự, có thể xây dựng các mô hình quan hệ giữa cấu trúc - hoạt tính (QSAR) [17, 93].

TÍNH TOÁN THÔNG TIN CẤU TRÚC 1. Cơ học phân tử Trong các phương pháp lý thuyết liên quan đến việc tối ưu hóa hình học của cấu trúc thì phương pháp cơ học phân tử (Molecular Mechanic - MM) khá thông dụng.