Tổng quan luận án

Nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps sinensis (đồng tên khoa học: Ophiocordyceps sinensis) là loại dược liệu quý trong y học cổ truyền và y học hiện đại nhờ chứa các hoạt chất sinh học quan trọng như adenosine, cordycepin, polysaccharide, sterol và acid béo. Nguồn nấm tự nhiên phân bố hạn chế ở vùng cao nguyên Tây Tạng và dãy Himalaya ngày càng cạn kiệt do khai thác quá mức và biến đổi khí hậu. Trong khi kỹ thuật nuôi cấy bán rắn tạo quả thể nhân tạo đòi hỏi thời gian kéo dài (khoảng 140 ngày) và chi phí cao, phương pháp lên men chìm trong môi trường lỏng để thu nhận sinh khối hệ sợi nấm mang lại hiệu quả kinh tế, thời gian nuôi cấy ngắn và chất lượng ổn định ở quy mô công nghiệp.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định xuất phát từ nhu cầu bổ sung vi chất selen (Se) hữu cơ có khả dụng sinh học cao nhằm thực hiện "Chiến lược quốc gia về dinh dưỡng giai đoạn 2011-2020 và tầm nhìn đến năm 2030" của Việt Nam. Mặc dù một số dược liệu trong nước như tỏi, nấm linh chi, quả nhàu có chứa Se, nhưng hàm lượng thường thấp và không đồng đều. Việc bổ sung Se vô cơ vào môi trường nuôi cấy nấm C. sinensis đối mặt với rào cản độc tính cao của các muối Se ở nồng độ lớn, gây ức chế mạnh sự sinh trưởng của sợi nấm. Do đó, việc xây dựng phương pháp nuôi cấy thích nghi, tối ưu hóa môi trường lên men bằng mô hình toán học và đánh giá toàn diện các hoạt chất chứa Se cùng hoạt tính sinh học là vấn đề then chốt cần giải quyết.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án gồm:

  • Mục tiêu tổng quát: Sản xuất sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu Se có hoạt tính sinh học được cải thiện và tạo nguồn Se có khả dụng sinh học cao.
  • Mục tiêu cụ thể:
    1. Xây dựng quy trình lên men sản xuất sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu Se.
    2. Đánh giá một số hoạt tính sinh học của các hoạt chất chứa Se từ sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu Se.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Chủng nấm Cordyceps sinensis CS-YK2007 do Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Nông nghiệp Công nghệ cao (Trường Đại học Đà Lạt) cung cấp; các nguồn selen vô cơ và hữu cơ gồm natri selenite ($\text{Na}_2\text{SeO}_3\cdot5\text{H}_2\text{O}$), natri selenate ($\text{Na}_2\text{SeO}_4\cdot10\text{H}_2\text{O}$) và selenourea ($\text{SeC(NH}_2)_2$).
  • Phạm vi không gian: Thực hiện tại Phòng thí nghiệm Viện Sinh học Nhiệt đới, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh) và Viện Y tế Công cộng TP. Hồ Chí Minh.
  • Phạm vi thời gian: Quá trình thực nghiệm và thu thập dữ liệu diễn ra từ tháng 01/2015 đến tháng 06/2020.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Về phân loại học, Sung và cộng sự (2007) dựa trên phân tích 5–7 locus gen gồm tiểu đơn vị ribosome nhỏ và lớn ($\text{nrSSU}$, $\text{dnrLSU}$), nhân tố kéo dài $\text{tef1}$, hai tiểu đơn vị RNA polymerase II ($\text{rpb1}$, $\text{rpb2}$), $\beta\text{-tubulin}$ ($\text{tub}$) và ATP synthase ti thể ($\text{atp6}$) đã chuyển Cordyceps sinensis sang chi Ophiocordyceps. Shrestha và cộng sự (2013) mô tả chi tiết đặc điểm phân bố tự nhiên của nấm ký sinh trên sâu bướm Thitarodes armoricanus ở độ cao 3500–5000 m.

Về vai trò sinh học của selen, nguyên tố này tham gia cấu tạo acid amin thứ 21 (selenocysteine) và nằm trong tâm hoạt động của các enzyme chống oxy hóa quan trọng như glutathione peroxidase (GPx), iodothyronine deiodinases (Dio1, Dio2) và thioredoxin reductase. WHO/FAO đưa ra nhu cầu khuyến nghị hàng ngày (RNI) về Se dao động từ 6 $\mu\text{g/ngày}$ ở trẻ sơ sinh đến 25–34 $\mu\text{g/ngày}$ ở người trưởng thành và 28–42 $\mu\text{g/ngày}$ ở phụ nữ mang thai hoặc cho con bú, với ngưỡng an toàn tối đa là 400 $\mu\text{g/ngày}$. Thiếu hụt Se liên quan trực tiếp đến bệnh Keshan (bệnh cơ tim) và bệnh viêm xương khớp hoại tử (osteoarthropathy). Tuy nhiên, Seko và cộng sự (1988) đã chỉ ra rằng nồng độ selenite vô cơ quá cao phản ứng với glutathione ($\text{GSH}$) tạo ra các gốc tự do superoxide ($\text{O}_2^{\bullet-}$), gây độc tế bào.

Về con đường biến dưỡng selen ở nấm, Kieliszek và cộng sự (2015) xác định selenate ($\text{SeO}_4^{2-}$) và selenite ($\text{SeO}_3^{2-}$) được vận chuyển qua màng tế bào nhờ các kênh vận chuyển sulfate $\text{Sul1p/Sul2p}$, sau đó trải qua các phản ứng chuyển hóa xúc tác bởi ATP sulfurylase, APSe kinase, PAPSe reductase và sulfate reductase tạo thành hợp chất trung gian hydro selenide ($\text{H}_2\text{Se}$), trước khi tổng hợp thành selenocystathionine, selenocysteine ($\text{SeCys}$), selenomethionine ($\text{SeMet}$) và methylselenocysteine.

Tác giả (Năm) Đối tượng nghiên cứu Thành phần dinh dưỡng / Nguồn Se bổ sung Kết quả chính
Xiao và cs. (2004) Cordyceps jiangxiensis JXPJ 0109 Maltose 20 g/L, glycerol 8 g/L, tryptone 5 g/L, cao nấm men 10 g/L, $\text{KH}_2\text{PO}_4$ 1 g/L, $\text{CaCl}_2$ 0,5 g/L Tối ưu hóa môi trường tăng trưởng sinh khối lỏng.
Kim và cs. (2003) Cordyceps militaris C738 Saccharose 6%, polypeptone 1%, $\text{K}_2\text{HPO}_4$ 0,05% Tăng trưởng hệ sợi trong nuôi cấy lỏng.
Singh và cs. (2014) Cordyceps sinensis Saccharose 30 g/L, cao thịt bò 4 g/L, acid folic 10 mg/L, $\text{CaCl}_2$ 1 g/L, $\text{ZnCl}_2$ 500 g/L Đánh giá dinh dưỡng khoáng vi lượng.
Dong và cs. (2005) Cordyceps sinensis Saccharose 50 g/L, peptone 10 g/L, cao nấm men 3 g/L Phát triển sinh khối hệ sợi trong môi trường lỏng.
Lin và cs. (2010) Cordyceps guangdongensis Saccharose 20 g/L, bột đậu nành 4 g/L, cao thịt bò 5 g/L, $\text{KNO}_3$ 10 g/L Khảo sát nguồn dinh dưỡng carbon và nitơ.
Kang và cs. (2014) Cordyceps militaris Saccharose 24,7 g/L, peptone 20 g/L, $\text{K}_2\text{HPO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$ 0,90 g/L, vitamin B1 10 mg/L, hypoxanthine 5,45 g/L, L-alanine 12,23 g/L Tối ưu hóa hoạt chất cordycepin.
Ji và cs. (2014) Cordyceps sinensis Bổ sung 0,4% Se Tích lũy Se đạt 4789,26 $\mu\text{g/g}$, kháng u cổ tử cung trên chuột.
Zheng và cs. (2014) Cordyceps sinensis SU-1 Môi trường bổ sung 100 mg/L Zn, 200 mg/L Ge, 20 mg/L Se Tích lũy Se đạt 1260,16 $\mu\text{g/g}$, tăng hoạt tính SOD và GSH-Px.
Yang và cs. (2006) Cordyceps sinensis Bổ sung natri selenite 33,78 mg/L Thu nhận selenopolysaccharide nội bào 197,35 mg/g, giảm đường huyết chuột.
Zhang và cs. (2014) Cordyceps militaris Nuôi cấy thích nghi nồng độ Se tăng dần, 20 mg/L Se Đạt tỷ lệ chuyển hóa Se hữu cơ 18,44%.
Hu và cs. (2018a,b) Cordyceps militaris Khảo sát chuyển hóa Se vô cơ sang hữu cơ Dùng HPLC-ICP-MS xác định $\text{SeCys}_2$, $\text{SeMet}$.
Huỳnh Thị Diễm Phúc và cs. (2016) Cordyceps sinensis Môi trường lỏng bổ sung kẽm (Zn) Ứng dụng phần mềm BCPharSoft để tối ưu hóa.

Khoảng trống luận án tập trung giải quyết: Thiết lập quy trình thích nghi cải tiến giúp nấm C. sinensis chống chịu được nồng độ Se cao; áp dụng đồng bộ các mô hình bề mặt đáp ứng RSM (Plackett–Burman, Box–Behnken, D-optimal) để tối ưu hóa đồng thời sinh khối và hàm lượng Se chuyển hóa; phân tích cụ thể các dạng Se liên kết trong polysaccharide (Se-EPS, Se-IPS) bằng FT-IR và HPLC-ICP-MS; đồng thời mở rộng khảo sát các hoạt tính sinh học in vitro (ức chế xanthine oxidase, bảo vệ DNA khỏi phản ứng Fenton, kháng viêm qua ức chế biến tính albumin, ức chế enzyme $\alpha\text{-glucosidase}$, độc tính tế bào ung thư vú MCF-7 và bạch cầu Jurkat) cùng thử nghiệm độc tính cấp in vivo.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án tiếp cận theo phương pháp thực nghiệm công nghệ sinh học và hóa sinh phân tích định lượng.

Quy trình chuẩn bị giống và nuôi cấy thích nghi cải tiến

  • Giống cấp 1: Nuôi cấy trên môi trường thạch PGA gồm khoai tây 200 g/L, glucose 20 g/L, agar 15 g/L ở nhiệt độ $22 \pm 2^\circ\text{C}$ trong 15 ngày.
  • Giống cấp 2: Nuôi trong môi trường lỏng PG (khoai tây 200 g/L, glucose 20 g/L) trong bình tam giác 200 mL ở $22 \pm 2^\circ\text{C}$.
  • Phương pháp thích nghi cải tiến: Dựa trên nguyên lý của Zhang và cộng sự (2014), sợi nấm được cấy chuyển qua các chu kỳ tăng dần nồng độ selenate ($\text{Na}_2\text{SeO}_4$) từ 5 mgSe/L, 10 mgSe/L, 15 mgSe/L đến 25 mgSe/L. Giữa các chu kỳ tăng nồng độ, sợi nấm được đưa vào môi trường lỏng PS có nồng độ selenate thấp hơn (7,5 mgSe/L và 15 mgSe/L) trong 10–15 ngày để phục hồi tăng sinh trước khi cấy sang nồng độ cao hơn. Chủng nấm thu được ở bước cuối cùng được giữ trên thạch nghiêng selenate-PGA ở $4^\circ\text{C}$.

Phương pháp tối ưu hóa môi trường bằng bề mặt đáp ứng (RSM)

  • Sàng lọc thành phần môi trường bằng mô hình Plackett–Burman: Đánh giá 7 biến độc lập ở 2 mức giá trị (-1 và +1) qua 12 nghiệm thức: khoai tây ($X_1$: 150–250 g/L), saccharose ($X_2$: 40–60 g/L), peptone ($X_3$: 5–15 g/L), cao nấm men ($X_4$: 5–15 g/L), $\text{KH}_2\text{PO}_4$ ($X_5$: 0,5–1,5 g/L), $\text{K}_2\text{HPO}_4$ ($X_6$: 0,5–1,5 g/L), $\text{MgCl}_2$ ($X_7$: 0,1–1 g/L).
  • Tối ưu hóa nồng độ môi trường bằng mô hình Box–Behnken: Khảo sát 3 yếu tố dinh dưỡng quan trọng nhất ở 3 mức (-1, 0, +1) qua 17 nghiệm thức. Mô hình hồi quy bậc 2 được thiết lập theo phương trình: $$A = B_0 + B_1X_1 + B_2X_2 + B_3X_3 + B_{12}X_1X_2 + B_{13}X_1X_3 + B_{23}X_2X_3 + B_{11}X_1^2 + B_{22}X_2^2 + B_{33}X_3^2$$
  • Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bằng mô hình D-optimal: Khảo sát 3 biến điều kiện gồm nhiệt độ ($Z_1$: 20, 25, $30^\circ\text{C}$), pH ($Z_2$: 6, 7, 8) và nguồn ánh sáng ($Z_3$: ánh sáng đỏ $6,617\ \mu\text{mol photon/m}^2/\text{s}$, ánh sáng trắng $8,618\ \mu\text{mol photon/m}^2/\text{s}$, ánh sáng xanh dương $13,872\ \mu\text{mol photon/m}^2/\text{s}$) qua 19 nghiệm thức. Dữ liệu RSM được phân tích bằng phần mềm Design Expert 7.0.

Phương pháp thu nhận và phân đoạn cao chiết

  • Cao tổng (cao EtOH): Chiết ngấm kiệt từ bột sinh khối khô bằng ethanol 96% theo tỷ lệ 1:10 (w/v) trong 48 giờ ở tốc độ 1 mL/phút, cô quay chân không thu cao thô theo phương pháp của Nguyễn Kim Phi Phụng (2007).
  • Cao phân đoạn: Phân đoạn lỏng - lỏng liên tục cao EtOH thô với các dung môi có độ phân cực tăng dần: petroleum ether (PE), ethyl acetate (EtOAc), butanol (BuOH) và phân đoạn nước còn lại.
  • Polysaccharide thô (CPS): Bã nấm sau chiết ngấm kiệt được chiết với nước nóng ở $65^\circ\text{C}$, ly tâm loại cặn, cô đặc và tủa bằng ethanol 96% theo tỷ lệ thể tích 1:4.
  • Polysaccharide ngoại bào (EPS): Dịch lên men ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút, cô đặc chân không ở $60^\circ\text{C}$ còn 1/10 thể tích, tủa bằng ethanol lạnh 96% (1:4 v/v) trong 24 giờ ở $4^\circ\text{C}$ theo Lê Thị Thúy Hằng và cộng sự (2018).
  • Polysaccharide nội bào (IPS): Bột sinh khối chiết bằng dung dịch NaOH 0,4 M ở $60^\circ\text{C}$ (4–5 lần), ly tâm thu dịch, tủa bằng ethanol lạnh 96% (1:5 v/v), hòa cặn trong nước cất rồi thẩm tách qua màng 1–2 kDa trong 24 giờ theo Li và cộng sự (2013).

Phương pháp phân tích hóa học và hoạt tính sinh học

  • Định lượng Se tổng và Se nguyên dạng: Vô cơ hóa mẫu bằng hỗn hợp acid $\text{HNO}_3$, $\text{HClO}_4$, $\text{H}_2\text{SO}_4$, đo phổ khối plasma ghép cảm ứng (ICP-MS) trên hệ thống Agilent 7700x hoặc NexION 350X Perkin Elmer (sử dụng đồng vị $^{78}\text{Se}$, nội chuẩn $^{74}\text{Ge}$). Phân tích Se nguyên dạng thực hiện bằng cách thủy phân enzyme tuần tự qua Proteinase K và Proteinase XIV ở $50^\circ\text{C}$ trong 48 giờ, sau đó phân tích qua hệ thống HPLC-ICP-MS (Gergely và cs., 2006).
  • Phổ hồng ngoại FT-IR: Phân tích các liên kết hóa học và nhóm chức đặc trưng của Se-EPS và Se-IPS tại Viện Công nghệ Hóa học TP.HCM.
  • Kháng oxy hóa: Đo khả năng bắt gốc tự do $\text{ABTS}^{\bullet+}$ ở bước sóng 734 nm (Leung và cs., 2009); bắt gốc tự do $\text{DPPH}^{\bullet}$ ở 517 nm (Xiao và cs., 2014); xác định năng lực khử sắt qua phản ứng tạo phức $\text{Fe}^{3+}\rightarrow\text{Fe}^{2+}$ đo ở 700 nm (Huỳnh Thư và cs., 2012); đánh giá khả năng bảo vệ đoạn gen ITS của nấm Pleurotus pulmonarius khỏi gốc hydroxyl tạo bởi phản ứng Fenton ($\text{FeSO}_4\ 140\ \text{mM} + \text{H}_2\text{O}_2\ 1\ \text{M}$), điện di gel agarose 1,5% và phân tích bằng phần mềm UVITEC 1D.
  • Kháng viêm in vitro: Đánh giá ức chế sự biến tính nhiệt của protein albumin huyết thanh bê (BSA 0,2%) ở $67^\circ\text{C}$, đo quang ở 660 nm (Trần Quốc Tuấn và cs., 2014), đối chứng dương là Diclofenac.
  • Ức chế Xanthine Oxidase (XO): Thử nghiệm ức chế chuyển hóa xanthine thành acid uric ở bước sóng 290 nm (Nguyen và cs., 2004), đối chứng Allopurinol.
  • Ức chế $\alpha\text{-glucosidase}$: Đo sản phẩm $p\text{-nitrophenol}$ giải phóng từ chất nền pNPG ở 405 nm (Vũ Thị Bạch Phượng), đối chứng Acarbose.
  • Gây độc tế bào in vitro (Sulforhodamin B assay - SRB): Thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7, ung thư máu Jurkat và nguyên bào sợi thường fibroblast (Nguyen và cs., 2017) ở bước sóng 492 nm và 620 nm, đối chứng dương Camptothecin.
  • Thử nghiệm độc tính cấp đường uống: Khảo sát trên chuột nhắt trắng theo hướng dẫn của Bộ Y tế, cho uống liều tối đa qua kim (0,2 mL/10 g thể trọng), theo dõi triệu chứng và tỷ lệ tử vong trong 72 giờ để xác định $D_{\max}$, $\text{LD}0$ hoặc $\text{LD}{50}$ theo phương pháp Karber–Behrens.
  • Xử lý số liệu: Phần mềm IBM SPSS Statistics 20, kiểm định mức ý nghĩa thống kê $p < 0,05$.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Tác giả trình bày tổng quan về giá trị dược liệu của Cordyceps sinensis, sự suy giảm nghiêm trọng của nguồn nấm tự nhiên và vai trò sinh học của selen. Nêu rõ tính cấp thiết của việc áp dụng công nghệ lên men lỏng để sản xuất sinh khối nấm giàu Se hữu cơ, xác định mục tiêu tổng quát, 2 mục tiêu cụ thể cùng ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.

Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa 4 nội dung chính: (1) Đặc điểm sinh học, vị trí phân loại của C. sinensis và các nhóm dược chất chính (Bảng 1.1 tổng hợp cơ chế miễn dịch, kháng viêm, kháng oxy hóa, apoptosis, kháng u, bảo vệ tim mạch, bảo vệ thận, sinh sản và phòng loãng xương); (2) Các dạng tồn tại của Se, nhu cầu RNI (Bảng 1.2), triệu chứng bệnh lý thiếu Se (Keshan, thoái hóa khớp) và phản ứng tạo gốc oxy hóa khi dư thừa selenite; (3) Con đường hấp thu và chuyển hóa Se qua màng nấm men thông qua kênh Sul1p/Sul2p và hệ enzyme oxy hóa khử; (4) Tổng kết các công trình nuôi cấy chìm nấm Cordyceps (Bảng 1.3) và các nghiên cứu làm giàu Se của Ji (2014), Zheng (2014), Yang (2006), Zhang (2014), Hu (2018).

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết nguồn chủng giống C. sinensis CS-YK2007, hóa chất, thiết bị, quy trình chuẩn bị giống cấp 1, cấp 2 và quy trình thích nghi cải tiến 7 bước. Trình bày chi tiết ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett–Burman (Bảng 2.1, 2.2), thiết kế Box–Behnken (Bảng 2.3, 2.4) và D-optimal (Bảng 2.5, 2.6). Đồng thời quy định chi tiết quy trình chiết xuất cao tổng, cao phân đoạn, CPS, EPS, IPS; các kỹ thuật phân tích HPLC-ICP-MS, FT-IR; 7 phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro và phương pháp thử độc tính cấp đường uống trên chuột.

Kết quả và biện luận

3.1 Về ảnh hưởng của selen đến sự phát triển của nấm Cordyceps sinensis

  • Trên môi trường thạch PGA: Khảo sát 3 nguồn selen (selenite, selenate, selenourea) từ 0 đến 40 mgSe/L sau 15 ngày. Selenate ít ức chế nấm nhất: ở nồng độ 40 mgSe/L, đường kính lan tơ đạt $5,9 \pm 0,9\ \text{cm}$, không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng ($6,1 \pm 0,5\ \text{cm}$, $p > 0,05$), tơ nấm màu trắng tròn đều. Ngược lại, selenite ở nồng độ > 25 mgSe/L gây ức chế lan tơ, tơ nấm đổi màu đỏ sậm do hình thành selen nguyên tố dạng keo, đường kính ở 40 mgSe/L giảm còn $4,2 \pm 0,2\ \text{cm}$ ($p < 0,05$). Selenourea gây ức chế mạnh nhất, ở 40 mgSe/L đường kính chỉ đạt $2,2 \pm 0,03\ \text{cm}$.
  • Trên môi trường lỏng PS: Sau 40 ngày nuôi cấy, khi nồng độ Se vượt quá 35–40 mgSe/L, hệ sợi nấm bị ức chế hoàn toàn ở cả 3 nguồn Se. Trong khoảng nồng độ 10–25 mgSe/L, môi trường bổ sung selenate cho sản lượng sinh khối cao hơn selenite và selenourea; tại 25 mgSe/L, sinh khối đạt $14,52 \pm 0,82\ \text{g/L}$ (selenate) so với $11,85 \pm 1,52\ \text{g/L}$ (selenite) ($p < 0,05$).
  • Khả năng tích lũy selen: Hàm lượng Se tích lũy trong sinh khối tăng tỷ lệ thuận với nồng độ Se bổ sung. Ở mẫu đối chứng không bổ sung Se, hàm lượng Se chỉ đạt 0,424–0,479 $\mu\text{g/g}$. Khi bổ sung 30 mgSe/L, hàm lượng Se trong sinh khối đạt $3812 \pm 228\ \mu\text{g/g}$ (selenite), $2078 \pm 124\ \mu\text{g/g}$ (selenate) và $685,27 \pm 28,9\ \mu\text{g/g}$ (selenourea).
  • Hiệu quả của phương pháp thích nghi cải tiến: Sợi nấm sau khi trải qua quy trình thích nghi từng bước với selenate 25 mgSe/L sinh trưởng ổn định, cho sản lượng sinh khối và hàm lượng các hợp chất chứa Se cao hơn phương pháp nuôi cấy truyền thống.

3.2 Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy

  • Sàng lọc Plackett–Burman: Xác định được các biến thành phần môi trường có tác động ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$) đến sản lượng sinh khối khô và khả năng tích lũy Se tổng số.
  • Tối ưu hóa Box–Behnken: Thiết lập hàm đáp ứng bậc 2 mô tả tương tác giữa các nguồn dinh dưỡng chính (carbon, nitơ, khoáng), xác định nồng độ tối ưu của các thành phần trong môi trường lỏng để đạt sinh khối và hàm lượng Se cao nhất.
  • Tối ưu hóa D-optimal: Đánh giá tác động tương tác của nhiệt độ, pH và nguồn ánh sáng; xác định vùng điều kiện tối ưu giúp sợi nấm phát triển cực đại và nâng cao hiệu suất hấp thu selenate.

3.3 Xác định thành phần hoạt chất và dạng selen chuyển hóa trong nấm Cordyceps sinensis

  • Hiệu suất chiết và phân bố Se trong các cao chiết: Hàm lượng Se tập trung chủ yếu ở các phân đoạn có độ phân cực trung bình và cao.
  • Chiết xuất Se-EPS và Se-IPS: Phân lập thành công polysaccharide ngoại bào gắn selen (Se-EPS) từ dịch lọc nuôi cấy và polysaccharide nội bào gắn selen (Se-IPS) từ sinh khối.
  • Phân tích phổ FT-IR: Kết quả quang phổ hồng ngoại của Se-EPS và Se-IPS cho thấy sự xuất hiện của các dải dao động hấp thụ đặc trưng cho liên kết giữa nhóm chức polysaccharide/protein với selen ($\text{C–O–Se}$, $\text{Se=O}$), chứng minh Se đã được tích hợp vào khung cấu trúc phân tử hữu cơ của nấm.
  • Xác định dạng selen nguyên dạng: Phân tích HPLC-ICP-MS sau thủy phân enzyme proteinase K và proteinase XIV xác nhận sự hiện diện của các seleno-amino acid như selenomethionine ($\text{SeMet}$) và selenocystine ($\text{SeCys}_2$).

3.4 Hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps sinensis giàu selen

  • Kháng oxy hóa: Sinh khối và các cao chiết giàu Se thể hiện khả năng bắt gốc tự do ABTS, DPPH và năng lực khử ion sắt cao hơn mẫu đối chứng không bổ sung Se.
  • Bảo vệ DNA: Trong thử nghiệm phản ứng Fenton gây đứt gãy đoạn gen ITS của nấm Pleurotus pulmonarius, các mẫu cao chiết giàu Se ở dải nồng độ 500–1500 $\mu\text{g/mL}$ bảo vệ vạch DNA nguyên vẹn so với mẫu đối chứng bị phá hủy hoàn toàn.
  • Ức chế Xanthine Oxidase (XO): Cao chiết từ sinh khối nấm giàu Se ức chế enzyme XO phụ thuộc vào nồng độ, làm giảm sản sinh acid uric.
  • Kháng viêm in vitro: Cao chiết thể hiện hoạt tính bảo vệ albumin huyết thanh bê khỏi bị biến tính bởi nhiệt độ ($67^\circ\text{C}$), với hiệu quả tăng theo nồng độ thử nghiệm.
  • Ức chế $\alpha\text{-glucosidase}$: Khả năng ức chế enzyme phân giải đường $\alpha\text{-glucosidase}$ của cao nấm giàu Se cao hơn mẫu không giàu Se, thể hiện tiềm năng kiểm soát đường huyết.
  • Gây độc tế bào ung thư in vitro: Thử nghiệm SRB tại nồng độ $100\ \mu\text{g/mL}$ cho thấy các cao chiết giàu Se gây độc và ức chế tăng sinh rõ rệt trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và tế bào ung thư máu Jurkat, trong khi ít ảnh hưởng tiêu cực lên dòng nguyên bào sợi thường fibroblast.

3.5 Đề xuất quy trình nuôi cấy sản xuất nấm Cordyceps sinensis giàu selen

  • Quy trình công nghệ hoàn chỉnh: Tác giả tích hợp từ bước kích hoạt giống, nuôi cấy thích nghi cải tiến, lên men chìm trong môi trường tối ưu đến thu hoạch và chế biến sinh khối.
  • Độc tính cấp đường uống trên chuột: Ở liều uống tối đa qua kim ($D_{\max}$), không ghi nhận chuột tử vong hoặc biểu hiện bất thường trong 72 giờ theo dõi, xác định sinh khối nấm an toàn về mặt độc tính cấp.
  • Kiểm định chỉ tiêu an toàn thực phẩm: Các chỉ tiêu vi sinh vật và kim loại nặng trong sinh khối nấm giàu Se đều đạt tiêu chuẩn an toàn thực phẩm theo quy định hiện hành.

Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các kết quả đạt được về quy trình thích nghi nấm, thông số tối ưu hóa lên men, cấu trúc các hợp chất Se hữu cơ và phổ hoạt tính sinh học mở rộng. Kiến nghị tiếp tục nghiên cứu nâng quy mô lên men và thử nghiệm dược lý chuyên sâu.

Kết quả và những đóng góp mới

  1. Xây dựng phương pháp nuôi cấy thích nghi cải tiến: Đã thiết lập thành công quy trình nâng dần nồng độ selenate ($\text{Na}_2\text{SeO}_4$) qua từng chu kỳ tăng sinh - phục hồi, giúp hệ sợi nấm Cordyceps sinensis CS-YK2007 thích nghi và phát triển tốt ở nồng độ selenate lên đến 25 mgSe/L, khắc phục tình trạng ức chế sinh trưởng khi tiếp xúc trực tiếp với Se vô cơ.
  2. Tối ưu hóa đa biến quy trình lên men chìm: Đã ứng dụng phối hợp các mô hình toán học bề mặt đáp ứng RSM (Plackett–Burman, Box–Behnken, D-optimal) để xác định thành phần môi trường và các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, chế độ chiếu sáng) tối ưu, nâng cao đồng thời sản lượng sinh khối khô và hiệu suất tích lũy Se.
  3. Làm rõ các dạng selen hữu cơ trong sinh khối: Sử dụng kết hợp FT-IR và HPLC-ICP-MS chứng minh sợi nấm C. sinensis đã chuyển hóa selenate vô cơ thành các dạng Se hữu cơ có giá trị sinh học cao gắn trong polysaccharide ngoại bào (Se-EPS), polysaccharide nội bào (Se-IPS) và các acid amin chứa Se ($\text{SeMet}$, $\text{SeCys}_2$).
  4. Chứng minh sự gia tăng đa dạng hoạt tính sinh học: Các chế phẩm cao chiết từ sinh khối nấm giàu Se thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa vượt trội, bảo vệ DNA khỏi gốc tự do hydroxyl, kháng viêm qua ức chế biến tính albumin, ức chế enzyme xanthine oxidase, ức chế enzyme $\alpha\text{-glucosidase}$ và gây độc chọn lọc trên dòng tế bào ung thư MCF-7, Jurkat nhưng an toàn với nguyên bào sợi thường fibroblast.
  5. Xác lập quy trình công nghệ và dữ liệu an toàn: Đề xuất quy trình công nghệ lên men lỏng sản xuất sinh khối nấm C. sinensis giàu Se có tính ổn định, chứng minh tính an toàn qua thử nghiệm độc tính cấp đường uống trên chuột ($D_{\max}$) và kiểm định các chỉ tiêu an toàn thực phẩm, làm cơ sở chuyển giao sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe.

Kiến nghị của luận án:

  • Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy trên hệ thống thiết bị lên men sinh học (bioreactor) ở quy mô pilot và công nghiệp.
  • Khảo sát thử nghiệm độc tính bán trường diễn, trường diễn và đánh giá sâu hơn các cơ chế phân tử của sinh khối giàu Se trên các mô hình động vật in vivo bị đái tháo đường, suy giảm miễn dịch hoặc mang khối u.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Quy mô thực nghiệm: Nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm trong bình tam giác và hộp nuôi cấy thể tích 650 mL (dung tích môi trường 200 mL/hộp, tổng mẻ 2 L), chưa khảo sát các thông số động học quá trình lên men trong các bồn lên men tự động kiểm soát oxy hòa tan (DO) và pH liên tục.
  • Mức độ đánh giá dược lý: Phần lớn các hoạt tính sinh học nâng cao (kháng oxy hóa, kháng viêm, ức chế XO, ức chế $\alpha\text{-glucosidase}$, độc tính tế bào ung thư) được thực hiện bằng các mô hình in vitro; thử nghiệm in vivo mới dừng ở mức khảo sát độc tính cấp tính đường uống trên chuột nhắt trắng trong 72 giờ, chưa tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng dài hạn.
  • Cơ chế chuyển hóa phân tử: Con đường chuyển hóa các hợp chất Se trong nấm C. sinensis chủ yếu được biện luận đối chiếu dựa trên mô hình nấm men Saccharomyces cerevisiae, chưa đi sâu phân tích hệ gen (genomics) hoặc hệ protein (proteomics) các kênh vận chuyển và enzyme trực tiếp của chủng C. sinensis CS-YK2007.

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học / Vi sinh học: Luận án là tài liệu tham khảo về phương pháp thiết kế thí nghiệm bề mặt đáp ứng đa biến (Plackett–Burman, Box–Behnken, D-optimal) trong tối ưu hóa lên men nấm dược liệu và quy trình nuôi cấy thích nghi vi sinh vật với khoáng vi lượng.
  • Đối với các nhà nghiên cứu Hóa thực vật và Dược học: Cung cấp phương pháp luận chi tiết trong việc chiết xuất phân đoạn, tách chiết polysaccharide ngoại bào/nội bào (EPS, IPS), kỹ thuật phân tích dạng vết Se bằng HPLC-ICP-MS, phổ FT-IR và hệ thống các phép thử hoạt tính sinh học in vitro chuẩn mực (ABTS, DPPH, năng lực khử, bảo vệ DNA, biến tính protein, ức chế enzyme XO và $\alpha\text{-glucosidase}$, thử nghiệm SRB).
  • Đối với các đơn vị sản xuất nấm dược liệu và thực phẩm chức năng: Cung cấp quy trình công nghệ lên men lỏng nấm C. sinensis giàu Se có tính khả thi kỹ thuật, nguồn cơ chất rõ ràng, kiểm soát được chỉ tiêu an toàn thực phẩm, định hướng phát triển các sản phẩm bổ sung vi chất Se hữu cơ bảo vệ sức khỏe.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả lựa chọn muối selenate ($\text{Na}_2\text{SeO}_4$) làm nguồn selen chính cho quá trình lên men thay vì selenite ($\text{Na}_2\text{SeO}_3$) hay selenourea? Trong các thử nghiệm trên cả môi trường thạch PGA và môi trường lỏng PS, selenate thể hiện độc tính thấp nhất đối với nấm Cordyceps sinensis. Ở nồng độ 40 mgSe/L trên thạch PGA, đường kính lan tơ của nấm trên môi trường bổ sung selenate đạt $5,9 \pm 0,9\ \text{cm}$ (tương đương đối chứng $6,1 \pm 0,5\ \text{cm}$), trong khi selenite bị ức chế ($4,2 \pm 0,2\ \text{cm}$) và tơ nấm bị biến đỏ, còn selenourea ức chế mạnh ($2,2 \pm 0,03\ \text{cm}$). Trong môi trường lỏng ở nồng độ 25 mgSe/L, selenate cho sản lượng sinh khối khô đạt $14,52 \pm 0,82\ \text{g/L}$, cao hơn có ý nghĩa thống kê so với selenite ($11,85 \pm 1,52\ \text{g/L}$).

2. Bản chất của phương pháp nuôi cấy thích nghi cải tiến được thực hiện như thế nào? Phương pháp cải tiến đưa hệ sợi nấm tiếp xúc với nồng độ selenate tăng dần theo từng bậc: 5 mgSe/L (7 ngày thạch PGA, 10 ngày lỏng PS) $\rightarrow$ 10 mgSe/L (10 ngày lỏng PS) $\rightarrow$ đưa về 7,5 mgSe/L (10 ngày lỏng PS) để phục hồi tăng sinh $\rightarrow$ 15 mgSe/L (10 ngày PGA, 15 ngày lỏng PS) $\rightarrow$ lặp lại chu kỳ tăng sinh và nâng dần nồng độ cho đến khi đạt 25 mgSe/L. Quá trình này giúp hệ sợi thích ứng dần với áp lực thẩm thấu và độc tính của Se, hạn chế suy thoái giống và tăng khả năng tích lũy Se hữu cơ.

3. Luận án đã sử dụng những mô hình toán học nào trong phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) và vai trò của từng mô hình? Luận án kết hợp 3 mô hình: (1) Mô hình Plackett–Burman để sàng lọc nhanh 7 yếu tố dinh dưỡng môi trường (khoai tây, saccharose, peptone, cao nấm men, $\text{KH}_2\text{PO}_4$, $\text{K}_2\text{HPO}_4$, $\text{MgCl}_2$) ở 2 mức qua 12 nghiệm thức nhằm tìm ra các yếu tố ảnh hưởng trọng yếu; (2) Mô hình Box–Behnken gồm 17 nghiệm thức ở 3 mức để tối ưu hóa nồng độ các yếu tố dinh dưỡng chính thông qua phương trình hồi quy bậc 2; (3) Mô hình D-optimal gồm 19 nghiệm thức để tối ưu hóa đồng thời 3 thông số điều kiện nuôi cấy gồm nhiệt độ (20–$30^\circ\text{C}$), pH (6–8) và nguồn ánh sáng (đỏ, trắng, xanh).

4. Những bằng chứng nào chứng minh Se vô cơ đã được nấm chuyển hóa thành Se hữu cơ? Tác giả đã cung cấp hai bằng chứng hóa sinh: Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) trên các mẫu polysaccharide ngoại bào (Se-EPS) và nội bào (Se-IPS) chỉ ra các dải hấp thụ đặc trưng của liên kết Se với khung hữu cơ ($\text{C–O–Se}$, $\text{Se=O}$); đồng thời phân tích sắc ký lỏng ghép khối phổ plasma cảm ứng (HPLC-ICP-MS) sau quá trình cắt mẫu bằng enzyme proteinase K và proteinase XIV đã phát hiện và định lượng được các dạng seleno-amino acid như selenomethionine ($\text{SeMet}$) và selenocystine ($\text{SeCys}_2$).

5. Hoạt tính sinh học của sinh khối nấm giàu Se khác biệt thế nào so với nấm đối chứng không bổ sung Se? Cao chiết sinh khối nấm giàu Se thể hiện khả năng quét gốc tự do ABTS, DPPH và năng lực khử sắt cao hơn mẫu đối chứng; bảo vệ toàn vẹn đoạn gen ITS của nấm Pleurotus pulmonarius trước phản ứng Fenton tạo gốc $\text{HO}^\bullet$; ức chế mạnh hơn sự biến tính nhiệt của albumin (kháng viêm); tăng cường ức chế enzyme xanthine oxidase và $\alpha\text{-glucosidase}$; đồng thời ức chế tăng sinh tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat tại nồng độ $100\ \mu\text{g/mL}$ nhưng không gây độc đáng kể lên tế bào nguyên bào sợi thường fibroblast.

Kết luận

Luận án của tác giả Lê Quốc Phong đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu xây dựng quy trình công nghệ lên men lỏng nấm Cordyceps sinensis CS-YK2007 tạo sinh khối giàu selen hữu cơ và khảo sát hoạt tính sinh học. Bằng việc kết hợp phương pháp nuôi cấy thích nghi cải tiến với hệ thống mô hình tối ưu hóa bề mặt đáp ứng đa biến, nghiên cứu đã tạo ra sinh khối nấm có khả năng tích lũy Se cao ở các dạng Se-EPS, Se-IPS và seleno-amino acid. Các kết quả thực nghiệm in vitro và in vivo đã xác nhận sinh khối nấm giàu Se có hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ DNA, kháng viêm, ức chế enzyme và kháng tế bào ung thư vượt trội, đồng thời đảm bảo an toàn thực phẩm và độc tính cấp, mở ra tiềm năng ứng dụng trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe.