Mở đầu. Tính cấp thiết của đề tài. Mục đích của đề tài. Tổng quan tài liệu.
Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài trong và ngoài nước. Tình hình nghiên cứu trên thế giới. Tình hình nghiên cứu trong nước. Quá trình hình thành và chức năng của progesterone.
Sự rụng trứng. Sự hình thành thể vàng. Động thái của thể progesterone trong một chu kỳ động dục. Thể vàng và sự chế tiết progesterone khi mang thai.
Vai trò, chức năng của progesterone. Một số hiểu biết về miễn dịch học. Miễn dịch và đáp ứng miễn dịch. Các cơ quan và tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch.
Kháng nguyên (Antigen). Kháng thể. Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể. Kháng thể đơn dòng.
Kỹ thuật ELISA. Đối tượng, nội dung, phương pháp nghiên cứu. 30 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Nguyên vật liệu.
Động vật thí nghiệm. Dòng tế bào ung thư tủy (Myeloma). Các thiết bị thí nghiệm. Các hóa chất thí nghiệm.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Gây miễn dịch cho chuột. Dung hợp tế bào Myeloma và tế bào lympho B. Sàng lọc các dòng tế bào dương tính với kháng nguyên bằng phương pháp ELISA.
Nhân giống các dòng tế bào đã chọn lọc. Gây báng cho chuột. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp gây miễn dịch cho chuột.
Phương pháp lấy tế bào LymphoB của chuột. Nuôi cấy tế bào Myeloma dòng Sp2/0. Phương pháp tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng. Phương pháp sàng lọc tế bào và tách dòng.
Nhân giống tế bào. Sản xuất dịch báng chuột chứa kháng thể đơn dòng. Phương pháp ELISA để sàng lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng. Kết quả, thảo luận.
Đánh giá kết quả gây đáp ứng miễn dịch bằng phương pháp elisa. Kết quả sàng lọc kháng thể đơn dòng. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể đơn dòng sau khi tách dòng. Nhân giống tế bào.
Gây báng cho chuột. Kết luận, kiến nghị .59 Tài liệu tham khảo. 60 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt BSA Albumin huyết thanh bò CS Cộng sự ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch FBS Huyết thanh bò cái KN Kháng nguyên KT Kháng thể KTĐD Kháng thể đơn dòng v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3. Sơ đồ thí nghiệm tách dòng tế bào lai.
Kết quả đáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm. Mẫu huyết thanh thu từ các chuột gây đáp ứng miễn dịch với Progesterone 3 - CMO. Kết quả lai (fusion) giữa tế bào Myeloma Sp2/0 và tế bào lympho B của chuột BAL b/c được gây miễn dịch với kháng nguyên progesterone 3 - CMO. Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên bằng phản ứng ELISA.
Kết quả kiểm tra bằng phương pháp ELISA các giếng dương tính (Sàng lọc lần 1 ở 22 giếng). Sơ đồ bố trí thí nghiệm để sàng lọc kháng thể đơn dòng. Kết quả sàng lọc lần 2 (Giá trị OD). Kết quả 5 dòng tế bào lai có hiệu giá tốt nhất và đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone 3 - CMO.
Tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng do 5 dòng tế bào tạo ra. 55 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2. Điều hoà tiết các hormone và vị trí tác động của chúng trong kỳ động dục của bò. Biến thiên nồng độ progesteron sau khi thụ tinh có kết quả và thời điểm lấy mẫu chẩn đoán có thai.
Công thức cấu tạo của kháng thể (Đỗ Ngọc Liên, 1999). Qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng. Gây miễn dịch cho chuột. Dung hợp tế bào ra đĩa nuôi cấy.
Tiêm tế bào lai vào xoang bụng chuột. Thu dịch báng xoang bụng chuột. Tế bào Myeloma được phục hồi ở các thời gian khác nhau. Tế bào lai hybridoma thu được ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau.
Tế bào lai được nhân giống qua các thời điểm khác nhau. 57 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nông Thu Hằng Tên Luận văn: “Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng Progesterone” Ngành: Chăn nuôi Mã số: 60 62 01 05 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Tạo được kháng thể đơn dòng kháng progesterone ứng dụng vào việc tạo kít hay que thử nhanh chẩn đoán có thai và các trường hợp bất thường về sinh sản ở bò. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - Thí nghiệm được tiến hành trên chuột trắng dòng BAL b/c thuần chủng 4 - 6 tuần tuổi, số lượng 30 con và tế bào Myeloma Sp2/0. - Kháng nguyên 4-pregnene-3 20-dione 3-O-Carboxymethyloxime (Progesterone 3 - CMO), Reference Code (Q2606-000) do hãng Steraloids - Mỹ cung cấp.
- Phương pháp được tiến hành bằng cách gây miễn dịch cho chuột bằng kháng nguyên đặc hiệu. Sau đó tế bào Lympho B được thu và dung hợp tế bào Myeloma. Sử dụng phương pháp ELISA để sàng lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng sau đó tách dòng, tiếp tục nhân lên với số lượng lớn để sản xuất kháng thể đơn dòng và tạo dịch báng trong xoang bụng chuột. Kết quả chính và kết luận - Sử dụng kháng nguyên Progesterone 3 - CMO gây miễn dịch cho chuột.
Với nồng độ 200µg/ml Progesterone 3 - CMO sẽ cho kết quả đáp ứng miễn dịch tốt nhất. Đáp ứng miễn dịch của cơ thể không những phụ thuộc vào nồng độ kháng nguyên gây miễn dịch mà còn phụ thuộc vào cá thể động vật. - Sử dụng công nghệ hybridoma, chúng tôi đã tạo được 2 dòng tế bào là dòng 2E4 và dòng 2E7. Sau khi dung hợp và tách dòng đã lai tạo thành công 5 dòng tế bào (2E4C5, 2E4F6, 2E4G8, 2E7D2, 2E7H6) có khả năng sinh kháng thể đơn dòng kháng progesterone.
Các kết quả cho thấy các kháng thể đơn dòng (2E4 và 2E7) có thể được sử dụng trong quá trình lai tạo và nhận biết progesterone bằng hệ thống xét nghiệm chẩn đoán miễn dịch (tức là ELISA). viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com THESIS ABSTRACT Author: Nong Thu Hang Title: “Production of mono antibodies specific for Progesterone” Major: Animal science Code: 60 62 01 05 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture Aims of research To produce môn antibodies specific for progesterone. Applied to making kit or quick test strips for the diagnosis of pregnancy and abnormalities of reproduction in cows. Materials and Methods - The experiment was carried out on 30 female mouse BAL b/c from 4 - 6 weeks and Myeloma Sp2/0 cells.
- Antibody (4-pregnene-3 20-dione 3-O-Carboxymethyloxime (Progesterone 3 - CMO), Reference Code (Q2606-000), by Steraloids - from America company. - The mouses were injected by Progesterone 3 - CMO. Lympho B cells was sellected from the spleen donors and and hybrided with Myeloma Sp 2/c cells. Elisa reation is used to srceen the the cells producing mono antibody specific for progesterone hormone.
The cells produced mono antibodies was kept in freezer to use for further study. Results and discussion - Mouse immunizasion by injecting of Progesterone 3 - CMO antigen, dose 200µg/ml the optimal immune response. Body immune responseis depended on not only antigen doses but also individual. - Using hybridoma technology, we developed hybrid cells producing antibodies for progesterone (2E4 and 2E7).
5 progesterone-reactive clones (2E4C5, 2E4F6, 2E4G8, 2E7D2, 2E7H6) were obtained in two fusions, two of which proved to be progesterone specific. They exhibited moderate to negligible reactivity with the other steriods when tested with ELISA. The results show that the monoclonal antibodies (2E4 and 2E7) can be used efficiently in the early and sensitive digagnosis of progesterone by immune diagnostic test systems (i. ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi bò nói riêng đã và đang phát triển cả về qui mô và tính chuyên hóa góp phần quan trọng vào sự phát triển kinh tế của đất nước và đời sống người dân Việt Nam. Tuy nhiên, do đặc điểm điều kiện địa lý, hạn chế về đất đai, khí hậu và tập quán chăn nuôi, điều kiện kinh tế và nhu cầu tiêu thụ các sản phẩm động vật đặc thù nên sự phát triển chăn nuôi các loài vật nuôi có nhiều khác biệt. Trong khi chăn nuôi lợn và chăn nuôi gia cầm phát triển nhanh, đến nay về cơ bản đáp ứng, thậm chí có hiện tượng dư thừa so với nhu cầu trong nước thì nguồn cung cấp sữa và thịt bò từ sản xuất trong nước vẫn trong tình trạng thiếu hụt trầm trọng. Trước nhu cầu ngày càng tăng về sữa và thịt bò cho thị trường nội địa, Chính phủ đã có chủ trương đẩy mạnh phát triển ngành sữa, ngành hàng bò thịt thông qua việc ban hành quyết định các chương trình phát triển, như Sind hóa đàn bò hay Quyết định 167/2001/QĐ/TTg về “Một số biện pháp và chính sách phát triển chăn nuôi bò sữa ở Việt Nam thời kỳ 2001 - 2010”.
Tuy nhiên, đến nay chăn nuôi bò vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu của thị trường nội địa nên thị trường sữa và thịt bò ở nước ta vẫn rất tiềm năng. Với điều kiện hạn chế diện tích đất đai, hạn chế về điều kiện khí hậu việc chú trọng nghiên cứu và ứng dụng các giải pháp khoa học kỹ thuật tiên tiến nhằm khai thác tối đa tiềm năng di truyền là rất cần thiết. Nhóm các giải pháp khoa học kỹ thuật nhằm tăng khả năng sinh sản được coi là giải pháp quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả chăn nuôi nói chung và chăn nuôi bò nói riêng. Chính vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng nói chung và kháng thể đơn dòng kháng progesterone nói riêng để ứng dụng vào việc tạo kít hay que thử nhanh chẩn đoán có thai và các trường hợp bất thường về sinh sản ở bò là định hướng đúng trong bối cảnh phát triển chăn nuôi bò ở nước ta.
Trên thế giới và cả ở Việt Nam phần lớn các xét nghiệm và phân tích định lượng hormon sinh sản như progesterone, FSH, LH v. đều nhờ vào các kit - ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng. Việc nhập khẩu từ Mỹ, Anh, Thái Lan v. với giá thành rất cao nên chưa thể sử dụng rộng rãi và đặc biệt là chưa thấy có các loại que thử phát hiện nhanh trâu bò có chửa.
Việc tạo các dòng tế bào lai hybrid sản sinh kháng thể đơn dòng kháng hormone progesterone ngay tại Việt 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nam nhằm ứng dụng phân tích định tính và định lượng hormone này để phát hiện nhanh bò có chửa hoặc các rối loạn của buồng trứng.