Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên B. anthracis

Luận văn thạc sĩ HUS nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử B. anthracis, góp phần vào y học.

• Tác giả: Nguyễn Thành Đạt
• Người hướng dẫn: GS. Đỗ Ngọc Liên
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử B. anthracis
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Đặc điểm vi khuẩn B. anthracis (vi khuẩn than) là vi khuẩn đầu tiên được xác định là vi khuẩn gây bệnh
• 1.2. Đặc điểm bào tử vi khuẩn B.
• 1.3. Một số protein trên vỏ bào tử của vi khuẩn than
• 1.4. BclA- kháng nguyên bề mặt vỏ bào tử để xác định sự có mặt của vi khuẩn than
• 1.5. Đại cương về kháng thể
• 1.6. Kháng thể
• 1.6.1. Các domain hằng định
• 1.6.2. Các domain biến thiên
• 1.6.3. Các lớp kháng thể
• 1.6.4. Phân loại kháng thể
• 1.7. Phương pháp tạo kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng
• 1.8. Kháng nguyên
• 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
• 2.1.1. Thiết bị nghiên cứu
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên chuột
• 2.2.2. Kỹ thuật ELISA
• 2.2.3. Phương pháp tinh sạch IgG từ huyết thanh Chuột
• 2.2.4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
• 2.2.5. Điện di protein trên gel polyacrylamid 12,5%
• 2.2.6. Kỹ thuật Western Blot
• 2.2.7. Phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kiểm tra độ tinh sạch của protein BclA tái tổ hợp trước khi gây đáp ứng miễn dịch
• 3.2. Kiểm tra mẫu huyết thanh chuột trước khi gây đáp ứng miễn dịch
• 3.3. Gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột
• 3.4. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than bằng kỹ thuật tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch
• 3.5. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than bằng phương pháp Western blot
• 3.6. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử của các chủng vi khuẩn B. subtilis trên que thử dạng sắc ký miễn dịch
• KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
• HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng B

Nghiên cứu về kháng thể đa dòng kháng B. anthracis là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học và y học. Vi khuẩn B. anthracis, nguyên nhân gây ra bệnh than, có khả năng gây tử vong cao nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời. Việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả là cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Kháng thể đa dòng có thể được sử dụng để phát hiện và điều trị bệnh than, đồng thời giúp nâng cao khả năng miễn dịch cho con người.

1.1. Đặc điểm của vi khuẩn B. anthracis và bệnh than

B. anthracis là một loại vi khuẩn Gram dương, có khả năng hình thành bào tử và gây bệnh than. Bệnh than có thể xảy ra qua ba con đường: qua da, đường tiêu hóa và đường hô hấp. Vi khuẩn này có thể tồn tại trong môi trường khắc nghiệt và gây ra các đợt dịch lớn. Việc hiểu rõ về đặc điểm của vi khuẩn này là rất quan trọng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả.

1.2. Tầm quan trọng của kháng thể trong nghiên cứu

Kháng thể đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện và điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra. Chúng có khả năng nhận diện và trung hòa các tác nhân gây bệnh, từ đó giúp cơ thể chống lại nhiễm trùng. Nghiên cứu tạo ra kháng thể đa dòng kháng B. anthracis không chỉ giúp phát hiện vi khuẩn mà còn có thể được ứng dụng trong việc phát triển vaccine và các phương pháp điều trị mới.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu kháng thể đa dòng

Mặc dù nghiên cứu về kháng thể đa dòng kháng B. anthracis đã đạt được nhiều thành tựu, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần phải vượt qua. Một trong những vấn đề lớn nhất là việc sản xuất kháng thể với độ tinh khiết cao và khả năng phản ứng tốt với kháng nguyên. Ngoài ra, việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác cũng là một thách thức lớn trong nghiên cứu này.

2.1. Khó khăn trong việc sản xuất kháng thể

Việc sản xuất kháng thể đa dòng đòi hỏi quy trình phức tạp và tốn nhiều thời gian. Các yếu tố như điều kiện nuôi cấy, loại kháng nguyên sử dụng và phương pháp thu nhận kháng thể đều ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả của kháng thể. Do đó, cần có các nghiên cứu sâu hơn để tối ưu hóa quy trình sản xuất.

2.2. Thách thức trong việc phát hiện B. anthracis

Việc phát hiện B. anthracis trong môi trường tự nhiên và trong mẫu bệnh phẩm là một thách thức lớn. Các phương pháp hiện tại như PCR và ELISA có thể mất nhiều thời gian và không phải lúc nào cũng chính xác. Do đó, cần phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh hơn và hiệu quả hơn để phát hiện vi khuẩn này kịp thời.

III. Phương pháp nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng B

Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng B. anthracis thường sử dụng các phương pháp như gây đáp ứng miễn dịch trên chuột, kỹ thuật ELISA và Western Blot. Những phương pháp này giúp xác định khả năng phản ứng của kháng thể với kháng nguyên và đánh giá hiệu quả của kháng thể trong việc phát hiện vi khuẩn.

3.1. Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên chuột

Phương pháp này bao gồm việc tiêm kháng nguyên vào cơ thể chuột để kích thích hệ miễn dịch sản xuất kháng thể. Sau khi tiêm, mẫu huyết thanh sẽ được thu thập và phân tích để xác định sự hiện diện của kháng thể. Đây là bước quan trọng trong việc tạo ra kháng thể đa dòng kháng B. anthracis.

3.2. Kỹ thuật ELISA và Western Blot

Kỹ thuật ELISA được sử dụng để định lượng kháng thể trong mẫu huyết thanh, trong khi Western Blot giúp xác định sự hiện diện của kháng thể đối với các protein cụ thể. Cả hai phương pháp này đều rất quan trọng trong việc đánh giá khả năng phản ứng của kháng thể và đảm bảo chất lượng của sản phẩm kháng thể.

IV. Ứng dụng thực tiễn của kháng thể đa dòng kháng B

Kháng thể đa dòng kháng B. anthracis có nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học và công nghệ sinh học. Chúng có thể được sử dụng để phát triển các bộ kit chẩn đoán nhanh, vaccine và các phương pháp điều trị mới cho bệnh than. Việc ứng dụng kháng thể đa dòng không chỉ giúp phát hiện bệnh mà còn nâng cao khả năng miễn dịch cho con người.

4.1. Phát triển bộ kit chẩn đoán nhanh

Bộ kit chẩn đoán nhanh sử dụng kháng thể đa dòng có thể giúp phát hiện B. anthracis trong thời gian ngắn, từ đó giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời. Các bộ kit này có thể được sử dụng trong các cơ sở y tế và phòng thí nghiệm để phát hiện nhanh chóng sự hiện diện của vi khuẩn.

4.2. Ứng dụng trong vaccine và điều trị

Kháng thể đa dòng cũng có thể được sử dụng để phát triển vaccine phòng ngừa bệnh than. Việc sử dụng kháng thể trong điều trị có thể giúp giảm thiểu triệu chứng và tăng cường khả năng miễn dịch cho bệnh nhân. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc phòng chống và điều trị bệnh than.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu kháng thể đa dòng kháng B

Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng B. anthracis là một lĩnh vực đầy tiềm năng và cần được tiếp tục phát triển. Các thách thức hiện tại trong việc sản xuất và phát hiện kháng thể cần được giải quyết để nâng cao hiệu quả của các phương pháp chẩn đoán và điều trị. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học và công nghệ sinh học.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất kháng thể và phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh hơn. Việc hợp tác giữa các nhà khoa học và các tổ chức y tế cũng rất quan trọng để thúc đẩy nghiên cứu và ứng dụng kháng thể đa dòng trong thực tiễn.

5.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về kháng thể đa dòng kháng B. anthracis không chỉ giúp phát hiện và điều trị bệnh than mà còn có thể áp dụng cho nhiều loại bệnh khác. Việc phát triển các phương pháp mới trong nghiên cứu này sẽ góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng và bảo vệ con người khỏi các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Vi khuẩn than (Bacillus anthracis) là tác nhân truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu, từng được xếp vào nhóm nguy cơ cao trong chiến tranh và khủng bố sinh học do khả năng sinh nha bào bền vững. Bào tử của trực khuẩn than có thể tồn tại nguyên vẹn ngoài môi trường tự nhiên trên 10 năm, đồng thời chịu được mức nhiệt độ 160°C trong 5 phút hoặc nước sôi 100°C trong 10 phút. Khi xâm nhập qua đường hô hấp, tỷ lệ tử vong ở người bệnh có thể vượt mức 80% nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời bằng kháng sinh đặc hiệu. Tại Việt Nam, việc xác định vi khuẩn than chủ yếu dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử như phản ứng chuỗi polymerase (PCR) hoặc xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA), đòi hỏi thời gian phân tích từ 2 đến 4 giờ tại phòng thí nghiệm tiêu chuẩn cùng hệ thống máy móc phức tạp.

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn về việc xây dựng công cụ giám định nhanh tại hiện trường, đề tài tập trung nghiên cứu quy trình tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên vỏ bào tử tái tổ hợp BclA (Bacillus collagen-like protein of anthracis). Mục tiêu cụ thể gồm: tinh sạch kháng nguyên BclA tái tổ hợp có trọng lượng phân tử 35 kDa; gây đáp ứng miễn dịch hiệu quả trên chuột dòng Swiss; tinh sạch kháng thể IgG đạt nồng độ trên 1,0 mg/ml; và kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên tự nhiên có trọng lượng 70 kDa từ dịch phá vỏ bào tử than. Nghiên cứu được triển khai tại Viện Kỹ thuật Hóa sinh và Tài liệu Nghiệp vụ thuộc Tổng cục Hậu cần Kỹ thuật - Bộ Công an phối hợp cùng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội vào năm 2012. Kết quả đề tài mở ra hướng tiếp cận chủ động, tạo tiền đề chế tạo que thử sắc ký miễn dịch phát hiện vi khuẩn than trong vòng 5 phút với chi phí ước tính thấp hơn nhiều so với sản phẩm ngoại nhập.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Cơ sở lý thuyết của nghiên cứu dựa trên nguyên lý tương tác miễn dịch học giữa kháng nguyên và kháng thể, kết hợp với các nghiên cứu chuyên sâu về cấu trúc siêu vi của vỏ bào tử vi khuẩn than. Vỏ ngoài (exosporium) chiếm khoảng 2% khối lượng toàn bộ bào tử, gồm 50% protein, 20% lipid và 20% polysaccharide trung tính. Lớp ngoài cùng của vỏ là các cấu trúc dạng sợi lông (hair-like nap) được cấu thành chủ yếu bởi glycoprotein BclA. Phân tử BclA tự nhiên chứa vùng lặp lại giàu các bộ ba axit amin Glycine - Proline - Threonine (GPT), đóng vai trò quan trọng trong tính kháng nhiệt và cơ chế bám dính của bào tử vào phế nang phổi vật chủ.

Nghiên cứu ứng dụng lý thuyết đáp ứng miễn dịch dịch thể trên động vật thực nghiệm, trong đó tế bào lympho B sau khi tiếp xúc với kháng nguyên tái tổ hợp sẽ biệt hóa thành tương bào sản sinh kháng thể lớp IgG. Các khái niệm khoa học cốt lõi bao gồm:

• Kháng nguyên tái tổ hợp (Recombinant Antigen): Đoạn protein BclA được biểu hiện nhân tạo trong hệ thống vi khuẩn nhằm đảm bảo độ an toàn sinh học và độ tinh sạch cao khi gây miễn dịch.
• Kháng thể đa dòng (Polyclonal Antibody): Hỗn hợp các phân tử immunoglobulin nhận diện nhiều epitope khác nhau trên cùng một cấu trúc kháng nguyên đích.
• Sắc ký ái lực Protein G (Protein G Affinity Chromatography): Kỹ thuật tách chiết dựa trên liên kết đặc hiệu giữa protein G của thành tế bào vi khuẩn Streptococcus với vùng Fc của kháng thể IgG.
• Sắc ký miễn dịch dòng bên (Lateral Flow Immunoassay): Kỹ thuật chẩn đoán nhanh dựa trên sự di chuyển mao dẫn của phức hợp kháng nguyên - kháng thể gắn hạt nano vàng trên màng nitrocellulose.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 12 cá thể chuột bạch chủng dòng Swiss (Mus musculus) khỏe mạnh do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp. Toàn bộ mẫu được chọn theo phương pháp phân nhóm ngẫu nhiên đồng đều về giới tính, tuần tuổi và thể trọng (khoảng 20 đến 25 gam/con), chia thành 2 lô nghiên cứu: lô thí nghiệm gồm 6 con được gây đáp ứng miễn dịch và lô đối chứng gồm 6 con không tiêm kháng nguyên. Việc lựa chọn cỡ mẫu 6 cá thể cho mỗi lô giúp đảm bảo tính đại diện thống kê sinh học trong các thử nghiệm miễn dịch học động vật nhỏ, giảm thiểu tối đa sai số do biến dị cá thể.

Phác đồ gây đáp ứng miễn dịch được thực hiện qua đường tiêm dưới da bụng với liều lượng từ 50 đến 100 µg protein BclA tái tổ hợp cho mỗi cá thể. Mũi tiêm khởi đầu sử dụng kháng nguyên phối trộn cùng tá dược hoàn toàn Freund (CFA) theo tỷ lệ thể tích 1:1 nhằm kéo dài thời gian phóng thích kháng nguyên và kích hoạt đại thực bào. Sau khoảng cách 2 tuần, chuột được tiêm nhắc lại bằng kháng nguyên phối trộn với tá dược không hoàn toàn Freund (IFA) theo tỷ lệ 1:1. Huyết thanh được thu nhận định kỳ qua tĩnh mạch đuôi và động mạch cổ (khoảng 1 đến 3 ml máu/con có bổ sung chất chống đông Na citrate 3,8% tỷ lệ 1:10) để theo dõi động học hiệu giá kháng thể bằng kỹ thuật ELISA ở bước sóng 450 nm.

Kháng thể IgG được tinh sạch qua cột ái lực HiTrap Protein G HP (thể tích 5 ml, hãng GE Healthcare) với tốc độ dòng 1 ml/phút, cân bằng bằng đệm sodium phosphate 20 mM ở pH 7,4 và rửa chiết bằng đệm Glycine-HCl 0,1 M ở pH 2,7, sau đó trung hòa ngay bằng dung dịch Tris-HCl 1 M ở pH 9,0 theo tỷ lệ 200 µl cho mỗi 1 ml dịch chiết. Phương pháp Bradford đo ở bước sóng 595 nm được chọn để định lượng nồng độ protein nhờ độ nhạy cao và thời gian phản ứng nhanh dưới 5 phút. Độ tinh sạch của chế phẩm kháng thể được thẩm định qua kỹ thuật điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 12,5%, lai chuyển thấm Western blot sử dụng cơ chất NBT/BCIP ở độ pha loãng 1:1000, và chế tạo que thử sắc ký miễn dịch tích hợp hạt nano vàng kích thước 40 nm với mật độ quang OD 15.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình triển khai thực nghiệm đã đem lại các kết quả định lượng rõ nét qua từng giai đoạn phân tích:

• Kiểm tra độ tinh sạch của kháng nguyên BclA tái tổ hợp: Kết quả điện di SDS-PAGE 12,5% cho thấy phân đoạn protein sau khi qua cột tinh sạch ái lực Niken xuất hiện một băng duy nhất tại vị trí có trọng lượng phân tử 35 kDa, chứng minh kháng nguyên đạt độ tinh khiết cao và loại bỏ hoàn toàn các tạp chất protein từ tế bào chủ.
• Động học đáp ứng miễn dịch trên chuột: Nồng độ kháng thể IgG trong huyết thanh lô chuột thí nghiệm tăng trưởng theo thời gian gây miễn dịch. Hiệu giá kháng thể tăng vọt sau mũi tiêm nhắc lại ở tuần thứ 2, đạt mức đỉnh cao và duy trì trạng thái ổn định trong khoảng từ tuần thứ 4 đến tuần thứ 5, với giá trị mật độ quang OD 450 nm trên ELISA tăng hơn 300% so với tuần đầu tiên.
• Hiệu suất tinh sạch kháng thể đa dòng: Quá trình tinh chế qua cột ái lực Protein G HP cho phép thu hồi phân đoạn IgG tinh khiết với nồng độ xác định qua phương pháp Bradford đạt 1,3 mg/ml. Kết quả điện di biến tính SDS-PAGE 12,5% xác nhận sản phẩm tinh sạch chỉ gồm 2 băng protein đặc trưng tương ứng với chuỗi nặng có trọng lượng 53 kDa và chuỗi nhẹ có trọng lượng 25 kDa.
• Khả năng nhận diện kháng nguyên tự nhiên và độ đặc hiệu: Phân tích lai Western blot ở độ pha loãng 1:1000 xác nhận kháng thể đa dòng không chỉ nhận biết vạch BclA tái tổ hợp 35 kDa mà còn liên kết mạnh mẽ với vạch kháng nguyên BclA tự nhiên có kích thước 70 kDa từ dịch phá vỏ bào tử vi khuẩn than. Trên que thử sắc ký miễn dịch gắn hạt nano vàng 40 nm, phản ứng hiện vạch đỏ hồng rõ rệt tại vùng thử nghiệm chỉ sau 5 phút và không xuất hiện phản ứng chéo với protein huyết thanh bò (BSA) cũng như các hợp chất như Morphine hay THC.

Thảo luận kết quả

Các phát hiện thu được khẳng định tính khả thi của việc sử dụng protein tái tổ hợp để tạo kháng thể nhận diện kháng nguyên tự nhiên của vi khuẩn than. Sự khác biệt về khối lượng phân tử giữa kháng nguyên BclA tái tổ hợp (35 kDa) và BclA tự nhiên trong dịch phá vỏ bào tử (70 kDa) được giải thích là do protein BclA tự nhiên trên vỏ bào tử chứa đầy đủ các chuỗi lặp lại giàu proline và trải qua quá trình glycosyl hóa phức tạp gắn thêm các chuỗi tetrasaccharide và disaccharide chứa đường anthrose. Mặc dù protein tái tổ hợp biểu hiện trong hệ thống nhân sơ không có các gốc đường này, các domain kháng nguyên cốt lõi (như vùng đầu C hình cầu CTD) vẫn giữ nguyên cấu trúc không gian ba chiều, cho phép kháng thể đa dòng nhận biết chính xác cấu trúc tương ứng trên vỏ bào tử tự nhiên.

Dữ liệu nghiên cứu được biểu diễn trực quan thông qua đồ thị rửa giải sắc ký A280, cho thấy một đỉnh hấp phụ đơn sắc nét khi sử dụng đệm giải hấp Glycine-HCl pH 2,7, đối lập hoàn toàn với đường nền phẳng của dịch rửa cột trước đó. Đồng thời, biểu đồ đường cong hiệu giá kháng thể ELISA qua 5 tuần thể hiện rõ sự chuyển đổi từ đáp ứng sơ cấp sang đáp ứng thứ cấp mạnh mẽ. Khi thử nghiệm chéo trên màng que thử với các chủng vi khuẩn cùng chi như Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis và Bacillus subtilis, kháng thể đa dòng cho thấy mức độ phản ứng mạnh nhất với dịch phá vỏ của B. anthracis, trong khi hoàn toàn không có phản ứng tại vạch đối chứng của B. subtilis (loài vi khuẩn không chứa protein BclA). Điều này chứng minh kháng thể thu được sở hữu độ nhạy và tính đặc hiệu cao, đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn khoa học để phát triển các kit chẩn đoán nhanh.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, nghiên cứu đưa ra 4 giải pháp trọng tâm nhằm ứng dụng và hoàn thiện công nghệ trong tương lai:

• Phát triển công nghệ kháng thể đơn dòng: Chuyển tiếp quy trình gây miễn dịch sang kỹ thuật tạo dòng tế bào lai (hybridoma) nhằm sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu tuyệt đối với các epitope đường anthrose trên BclA, hướng tới mục tiêu đạt ái lực liên kết cao với hằng số Ka lớn hơn 10^8 M^-1 trong khung thời gian 12 tháng, do các phòng thí nghiệm chuyên ngành thuộc Bộ Công an và Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ chủ trì.
• Tối ưu hóa và chuẩn hóa quy trình sản xuất que thử nhanh: Thiết lập dây chuyền lắp ráp bán tự động màng sắc ký miễn dịch kết hợp hạt nano vàng 40 nm, nâng cao ngưỡng phát hiện đạt độ nhạy dưới 10^3 bào tử/ml trong vòng 6 đến 12 tháng tới, do các doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm y tế trong nước phối hợp thực hiện.
• Ban hành quy trình giám định hiện trường cho lực lượng tác chiến: Xây dựng tài liệu hướng dẫn kỹ thuật chuẩn (SOP) ứng dụng que thử phát hiện nhanh vi khuẩn than với thời gian trả kết quả dưới 5 phút, phục vụ công tác giám định kỹ thuật hình sự và phòng chống khủng bố sinh học, do Tổng cục Hậu cần Kỹ thuật - Bộ Công an ban hành trong vòng 18 tháng.
• Mở rộng đánh giá độ đặc hiệu trên thực địa: Thực hiện thử nghiệm kiểm chứng chéo trên diện rộng với hơn 30 chủng vi sinh vật đất và vi khuẩn gây nhiễm trùng cơ hội nhằm loại trừ tuyệt đối nguy cơ dương tính giả, hoàn thiện báo cáo thẩm định an toàn sinh học trong vòng 24 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang giá trị thực tiễn và lý luận cao, phù hợp với các nhóm độc giả sau:

• Chuyên gia công nghệ sinh học và miễn dịch học: Cung cấp quy trình chi tiết từ khâu tinh sạch kháng nguyên protein tái tổ hợp, thiết lập phác đồ gây đáp ứng miễn dịch tối ưu trên chuột đến tinh chế kháng thể IgG bằng sắc ký Protein G.
• Cán bộ giám định kỹ thuật hình sự và an ninh quốc phòng: Cung cấp giải pháp kỹ thuật nền tảng để chế tạo các bộ kít thử nghiệm thực địa phục vụ công tác trinh sát, cảnh báo sớm và xử lý các tình huống đe dọa vũ khí sinh học.
• Kỹ sư nghiên cứu và phát triển sản phẩm chẩn đoán y sinh (IVD): Tham khảo phương pháp cộng hợp hạt nano vàng 40 nm với kháng thể và kỹ thuật tối ưu hóa màng nitrocellulose trong chế tạo que thử sắc ký dòng bên.
• Giảng viên, học viên cao học và sinh viên ngành Sinh học, Y dược: Nguồn tài liệu học thuật giá trị trong học phần Miễn dịch học thực nghiệm, Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao protein BclA lại được lựa chọn làm kháng nguyên đích để phát hiện vi khuẩn than? Protein BclA là thành phần cấu trúc chính của lớp lông ngoài cùng trên vỏ bào tử vi khuẩn than. Phân tử này lộ hoàn toàn ra môi trường bên ngoài, tạo điều kiện thuận lợi nhất để các phân tử kháng thể tiếp cận và liên kết trực tiếp mà không cần qua các bước xử lý mẫu phức tạp.

Nguyên nhân nào dẫn đến sự sai lệch khối lượng giữa BclA tái tổ hợp (35 kDa) và BclA tự nhiên (70 kDa)? BclA tái tổ hợp được biểu hiện trong tế bào vi khuẩn không trải qua quá trình biến đổi sau dịch mã, trong khi BclA tự nhiên trên vỏ bào tử trải qua quá trình glycosyl hóa mạnh mẽ với các chuỗi oligosaccharide phức tạp và chứa các đoạn lặp GPT, khiến tốc độ di chuyển trên gel điện di chậm hơn tương ứng với kích thước 70 kDa.

Phác đồ tiêm miễn dịch trên chuột Swiss được tối ưu hóa theo quy trình nào? Quy trình gồm mũi tiêm khởi đầu với 50 đến 100 µg kháng nguyên BclA phối trộn cùng tá dược hoàn toàn Freund tỷ lệ 1:1, sau đó tiêm nhắc lại sau 2 tuần với tá dược không hoàn toàn Freund tỷ lệ 1:1. Phác đồ này kích thích hệ miễn dịch sản sinh lượng kháng thể IgG đạt đỉnh ổn định từ tuần thứ 4 đến tuần thứ 5.

Cơ chế tinh sạch kháng thể bằng cột HiTrap Protein G HP diễn ra như thế nào? Phương pháp dựa trên liên kết ái lực cao giữa Protein G trên chất mang sepharose với phần Fc của kháng thể IgG chuột. Các protein tạp chất được rửa trôi bằng đệm phosphate pH 7,4, sau đó kháng thể tinh khiết được giải hấp bằng đệm acid Glycine-HCl pH 2,7 và trung hòa ngay về pH 7,0 để bảo toàn hoạt tính sinh học.

Que thử sắc ký miễn dịch chế tạo từ kháng thể đa dòng có ưu thế gì so với phương pháp PCR? Que thử sắc ký miễn dịch cho kết quả trực quan bằng mắt thường trong thời gian 5 phút, không yêu cầu thiết bị luân nhiệt đắt tiền hay kỹ thuật viên chuyên sâu, rất thích hợp cho việc sàng lọc nhanh tại hiện trường, trong khi phương pháp PCR đòi hỏi từ 2 đến 4 giờ trong phòng thí nghiệm.

Kết luận

• Đã thiết lập thành công quy trình tinh sạch kháng nguyên BclA tái tổ hợp kích thước 35 kDa qua hệ thống cột ái lực Niken đạt độ tinh khiết cao.
• Xây dựng phác đồ gây đáp ứng miễn dịch hiệu quả trên chuột Swiss, kích thích sản sinh kháng thể IgG với nồng độ đạt khoảng 1,3 mg/ml sau tinh sạch qua cột Protein G HP.
• Khẳng định kháng thể đa dòng kháng BclA tái tổ hợp có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên BclA tự nhiên kích thước 70 kDa trên vỏ bào tử vi khuẩn than qua kỹ thuật Western blot và que thử nhanh.
• Chế tạo thành công nguyên mẫu que thử sắc ký miễn dịch tích hợp hạt nano vàng 40 nm, cho phép phát hiện sự có mặt của dịch vỏ bào tử vi khuẩn than trong vòng 5 phút mà không xảy ra phản ứng chéo.
• Đóng góp cơ sở thực nghiệm vững chắc cho định hướng sản xuất kháng thể đơn dòng và thương mại hóa các bộ kít chẩn đoán nhanh phục vụ an ninh quốc phòng trong lộ trình 1 đến 2 năm tới.

Công trình là bước đột phá kỹ thuật quan trọng trong việc tự chủ công nghệ chế tạo sinh phẩm chẩn đoán tác nhân sinh học nguy hiểm tại Việt Nam. Các đơn vị nghiên cứu và phát triển sản phẩm y sinh có thể liên hệ hợp tác chuyển giao công nghệ để sớm đưa sản phẩm vào ứng dụng thực tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đặc điểm vi khuẩn B. anthracis (vi khuẩn than) là vi khuẩn đầu tiên được xác định là vi khuẩn gây bệnh.

Koch đã nuôi vi khuẩn này dưới dạng chủng thuần khiết, chứng minh được khả năng hình thành bào tử của nó và gây được bệnh than thực nghiệm bằng cách cấy nó vào cơ thể động vật. Vi khuẩn than thuộc loài Bacillus, họ Bacillaceae. Chi Bacillus là các trực khuẩn Gram dương, có bào tử, kỵ khí tuỳ tiện. Các vi khuẩn này gồm nhiều loài, đa số không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (B.

cereus), một số có lợi cho con người (B. anthracis có đặc điểm khác biệt với 3 loài trực khuẩn hiếu khí có bào tử trên là ở tính có độc lực của nó. anthracis có plasmids pXO1; pXO2 và plasmid mã hoá capsule, vỏ chỉ hình thành trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, hoặc được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng 0,7% Natri bicarbonat, ở nhiệt độ 37C trong điều kiện giàu CO2 (20%). Ở điều kiện ngoại cảnh hoặc trong môi trường nuôi cấy nghèo dinh dưỡng, vi khuẩn hình thành bào tử, nằm giữa thân và không làm thay đổi hình thể vi khuẩn.

Trên động vật bị bệnh hoặc môi trường nuôi cấy đặc biệt vi khuẩn có vỏ. Trong môi trường lỏng vi khuẩn không di động. anthracis Bào tử vi khuẩn B. anthracis 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Khuẩn lạc có kích thước lớn, đường kính 0,3 - 0,5 cm.

Màu khuẩn lạc trắng đến trắng ghi. Bề mặt khuẩn lạc ướt, hơi dính, không gây tan huyết trên thạch máu cừu (nhưng trên thạch máu thỏ có thể gây tan huyết). Trong các chương trình về vũ khí sinh học (VKSH) vi khuẩn gây bệnh than B. anthracis được coi là tác nhân sinh học thường đựơc chú ý quan tâm nhiều nhất vì trực khuẩn than có thể tồn tại trong thiên nhiên dưới dạng nha bào (bào tử) trong thời gian hơn 10 năm, có khả năng chịu nhiệt 160 độ C trong vòng 5 phút, chịu nước sôi đến 10 phút.

Người bị nhiễm bệnh than qua 3 con đường: qua da, đường tiêu hoá và đường thở. Bào tử than khi bị hít thở qua mũi chúng có khả năng vào tới các phế nang để gây bệnh than thể hô hấp và cư trú ở các phế bào của phế nang, qua hệ thống mạch bạch huyết chuyển tới hạch lympho của trung thất. Tại đó các vi khuẩn gây bệnh than này sinh trưởng và xâm nhập theo đường máu gây nhiễm khuẩn huyết và nhiễm khuẩn nhiều nơi trong cơ thể, gây tỷ lệ tử vong rất cao [3]. Độc tố của vi khuẩn than có sự tham gia của 3 yếu tố cấu thành: kháng nguyên bảo vệ (Protective Antigen-PA), giúp hai cấu tử khác là yếu tố gây phù nề (Edema Factor -EF) và yếu tố gây chết (Lethal Factor -LF) xâm nhập được vào tế bào của vật chủ và gây độc.

Về bản chất đây là 3 peptid do bản thân vi khuẩn sinh ra. Yếu tố gây phù nề làm bất hoạt tế bào bạch cầu trung tính của vật chủ làm cho các tế bào này không có khả năng thực bào để tiêu diệt vi khuẩn. Các nhà nghiên cứu cho rằng yếu tố gây chết của vi khuẩn than kích thích các đại thực bào sản sinh TNF-alpha và interleukin-1-beta (cả hai yếu tố này là thành phần của hệ miễn dịch có tác dụng trong phản ứng viêm và sốc phản vệ) và yếu tố này có thể gây chết vật chủ. Đây cũng là yếu tố khác biệt chủ yếu của B.

anthracis so với các chủng tương tự như B. cereus…[9,10] 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Hình 1: Nguyên lý gây bệnh than của vi khuẩn B. anthracis [3 ] Trước đây việc chẩn đoán xác định B. anthracis trong phòng thí nghiệm chủ yếu dựa vào việc phát hiện hình thái học và đặc điểm sinh học.

Các kỹ thuật DNA gần đây đáp ứng được yêu cầu phát hiện chính xác, cho phép phân biệt B. anthracis với các loại trực khuẩn khác trong “nhóm B.Đó là dựa vào sự có mặt của hai plasmids lớn (pXO1; pXO2) của trực khuẩn than chứa gen độc lực. Đặc điểm bào tử vi khuẩn B. Bào tử vi khuẩn B.

anthracis được hình thành trong môi trường thiếu các chất dinh dưỡng thiết yếu. Trong quá trình hình thành này sẽ có một sự phân chia không đối xứng của tế bào sinh dưỡng tạo ra một phần lớn và một phần nhỏ tương ứng là tế bào mẹ (mother cell) và tiền bào tử (forespore). Các tế bào mẹ sau đó bao lấy phần tiền bào tử, các lớp của bào tử dần được hình thành. Do đó bào tử của B.

anthracis bao gồm các lớp chính sau: lõi (spore core), vỏ lõi (cortex), vỏ bào tử (exosporium). Cuối cùng tế bào mẹ phân giải tạo nên các bào tử trưởng thành, các bào tử này không hoạt động nhưng có khả năng sống sót trong môi trường khắc nghiệt qua nhiều năm [10]. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Hình 2: Quá trình hình thành bào tử vi khuẩn than B. subtilis , lớp áo (coat) là lớp ngoài cùng của bào tử thì ở vi khuẩn B.

cereus có vỏ bào tử là lớp ngoài cùng. Cả áo bào tử và vỏ bào tử đều có cấu trúc linh hoạt, khả năng đàn hồi tốt. Mặt khác trên áo và vỏ bào tử tập trung một số enzyme có tác dụng bảo vệ. Hình 3: Cấu tạo bào tử quan sát dưới kính hiển vi điện tử [3,5 ] 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Ở hình 3a, là cấu tạo bào tử của vi khuẩn B.

subtilis , có lớp ngoài cùng là áo bào tử (Oc: outer coat layer). Ở lớp này tập trung chủ yếu các protein (chiếm khoảng 30% protein bào tử). Ước tính có khoảng 70 protein trên lớp áo bào tử, phần lớn các protein này là đặc hiệu cho chủng B. subtilis , người ta thường dựa vào các protein đó để kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn này.

Khác với vi khuẩn B. subtilis có lớp áo bào tử dày với lớp bên trong sáng và lớp bên ngoài tối, vi khuẩn than có áo bào tử mỏng. Lớp này được phân cách với lớp ngoài cùng bởi khoảng giữa (Is: interspace). Đối với các chủng B.

mycoides và một số thuộc nhóm Clostridia thì lớp ngoài cùng là vỏ bào tử. Hình 3b và hình 4 mô tả cấu tạo bào tử của vi khuẩn than. Hình 4: Cấu tạo các lớp của bào tử vi khuẩn than [3,5] Cấu tạo lớp ngoài cùng của bào tử gồm 2 lớp sau: lớp cơ bản (Bl: basal layer) và một phần bên ngoài giống như các sợi lông (Hn: hair-like nap). Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử và dùng nhiễu xạ X-quang, người ta thấy lớp cơ bản dày khoảng 190A0 được hình thành từ các lớp mỏng hơn.

Lớp cơ bản gồm 4 tấm kết tinh, mỗi tấm có cấu trúc lỗ có hình lục giác. anthracis thì lớp cơ bản dày khoảng 20- 30nm. Phần lông bao quanh bên ngoài là một glycoprotein gọi là BclA (Bacillus collagen-like protein of anthracis). Phần cấu trúc của BclA sẽ được mô tả cụ thể ở phần 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học sau.

Vỏ bào tử chiếm khoảng 2% khối lượng của bào tử và có khoảng 50% protein, 20% lipid , 20% polysaccharides trung tính, và 10% là các thành phần khác. Chức năng chính của vỏ bào tử là chống lại các tác nhân môi trường, do bề mặt kỵ nước nên làm tăng khả năng kết dính của bào tử. Mặt khác trên vỏ bào tử chứa một số enzyme có chức năng hoạt hoá sự hoạt động của bào tử. Vỏ bào tử cũng chính là điểm đầu tiên để bào tử tương tác với tế bào vật chủ của hệ thống miễn dịch [8].

Một số protein trên vỏ bào tử của vi khuẩn than Các protein trên vỏ bào tử B. anthracis là đối tượng thường được sử dụng để phát hiện sự có của vi khuẩn than. Theo thống kê của một số tài liệu [14] thì có khoảng gần 20 protein có mặt trên vỏ bào tử của vi khuẩn này. Có thể kể đến một số protein sau: BclA, Alanine racemase (Alr), Inosine hydrolase (InH), Protein ExsF, Protein CotY, Protein Cot E, Protein Cot H, Protein ExsY, Protein CotB, Protein giả thuyết ExsK, Protein BxpB, Protein BclA, Protein BxpA.

Các protein nhóm D là các enzyme. Các enzyme này có vai trò trong việc bảo vệ bào tử khỏi phản ứng ôxy hoá đồng thời ngăn chặn sự nảy mầm sớm. Người ta đã chứng minh được rằng những enzyme kể trên xuất hiện ở giai đoạn trưởng thành của vỏ bào tử vi khuẩn. Alr chuyển hoá L-alanine thành D-alanine (một chất ức chế sự nảy mầm), InH sẽ phân huỷ inosine ngăn cản quá trình nảy mầm bằng cách giảm tối thiểu lượng inosine [14].

Các protein nhóm E như ExsY, CotY, CotB. Những protein này có thể được đính ở lớp cơ bản hoặc lớp ngoài của áo bào tử. Chúng tham gia trong quá trình lắp ráp của vỏ bào tử. Nhóm các protein bào tử bao gồm các protein có cùng nguồn gốc với các protein của các protein của B.

subtilis có vai trò gắn với lớp áo (coat) hoặc các thành phần phía ngoài áo. 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Hình 5: Các protein trên vỏ bào tử của một vài loại vi khuẩn [ 14 ] 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Protein nhóm F như BclA, ExsB, ExsC, ExsD,BxpB,. là các protein có trọng lượng phân tử cao. Có thể kể đến những đặc điểm cơ bản của một số protein thuộc nhóm này.

BxpB được tìm thấy ở lớp cơ bản nhờ đánh dấu miễn dịch huỳnh quang bằng vàng. Protein này tạo phức liên kết hoá trị mạnh với BclA, các protein khác ở lớp cơ bản và lớp lông bên ngoài gồm ExsY và CotY. Khi BxpB được tách chiết từ bào tử bằng SDS, nó được tách ở cả dạng đơn phân và dạng phức hệ khối lượng phân tử lớn với BclA. BxpB bị đột biến không có khả năng bám với lông bên ngoài, mặc dù BclA vẫn được tổng hợp bình thường.

Thiếu BxpB dẫn đến bào tử nảy mầm nhanh hơn. Một nhóm các protein, như BxpA, BxpB (còn gọi ExsFA), BxpC, ExsC. chỉ được tìm thấy ở các vi sinh vật thuộc B. Điều này cho thấy vỏ bào tử ở các sinh vật khác được gắn với lớp cơ bản bằng một nhóm các protein khác.