Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên B. anthracis

Luận văn thạc sĩ HUS nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử B. anthracis, góp phần vào y học.

• Tác giả: Nguyễn Thành Đạt
• Người hướng dẫn: GS. Đỗ Ngọc Liên
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử B. anthracis
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Đặc điểm vi khuẩn B. anthracis (vi khuẩn than) là vi khuẩn đầu tiên được xác định là vi khuẩn gây bệnh
• 1.2. Đặc điểm bào tử vi khuẩn B.
• 1.3. Một số protein trên vỏ bào tử của vi khuẩn than
• 1.4. BclA- kháng nguyên bề mặt vỏ bào tử để xác định sự có mặt của vi khuẩn than
• 1.5. Đại cương về kháng thể
• 1.6. Kháng thể
• 1.6.1. Các domain hằng định
• 1.6.2. Các domain biến thiên
• 1.6.3. Các lớp kháng thể
• 1.6.4. Phân loại kháng thể
• 1.7. Phương pháp tạo kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng
• 1.8. Kháng nguyên
• 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
• 2.1.1. Thiết bị nghiên cứu
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên chuột
• 2.2.2. Kỹ thuật ELISA
• 2.2.3. Phương pháp tinh sạch IgG từ huyết thanh Chuột
• 2.2.4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
• 2.2.5. Điện di protein trên gel polyacrylamid 12,5%
• 2.2.6. Kỹ thuật Western Blot
• 2.2.7. Phương pháp chế tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kiểm tra độ tinh sạch của protein BclA tái tổ hợp trước khi gây đáp ứng miễn dịch
• 3.2. Kiểm tra mẫu huyết thanh chuột trước khi gây đáp ứng miễn dịch
• 3.3. Gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng protein BclA tái tổ hợp trên chuột
• 3.4. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than bằng kỹ thuật tạo que thử dạng sắc ký miễn dịch
• 3.5. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với vỏ bào tử vi khuẩn than bằng phương pháp Western blot
• 3.6. Kiểm tra khả năng phản ứng của kháng thể đa dòng với dịch phá vỏ bào tử của các chủng vi khuẩn B. subtilis trên que thử dạng sắc ký miễn dịch
• KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
• HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng B

Nghiên cứu về kháng thể đa dòng kháng B. anthracis là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học và y học. Vi khuẩn B. anthracis, nguyên nhân gây ra bệnh than, có khả năng gây tử vong cao nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời. Việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả là cần thiết để bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Kháng thể đa dòng có thể được sử dụng để phát hiện và điều trị bệnh than, đồng thời giúp nâng cao khả năng miễn dịch cho con người.

1.1. Đặc điểm của vi khuẩn B. anthracis và bệnh than

B. anthracis là một loại vi khuẩn Gram dương, có khả năng hình thành bào tử và gây bệnh than. Bệnh than có thể xảy ra qua ba con đường: qua da, đường tiêu hóa và đường hô hấp. Vi khuẩn này có thể tồn tại trong môi trường khắc nghiệt và gây ra các đợt dịch lớn. Việc hiểu rõ về đặc điểm của vi khuẩn này là rất quan trọng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả.

1.2. Tầm quan trọng của kháng thể trong nghiên cứu

Kháng thể đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện và điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra. Chúng có khả năng nhận diện và trung hòa các tác nhân gây bệnh, từ đó giúp cơ thể chống lại nhiễm trùng. Nghiên cứu tạo ra kháng thể đa dòng kháng B. anthracis không chỉ giúp phát hiện vi khuẩn mà còn có thể được ứng dụng trong việc phát triển vaccine và các phương pháp điều trị mới.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu kháng thể đa dòng

Mặc dù nghiên cứu về kháng thể đa dòng kháng B. anthracis đã đạt được nhiều thành tựu, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần phải vượt qua. Một trong những vấn đề lớn nhất là việc sản xuất kháng thể với độ tinh khiết cao và khả năng phản ứng tốt với kháng nguyên. Ngoài ra, việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh và chính xác cũng là một thách thức lớn trong nghiên cứu này.

2.1. Khó khăn trong việc sản xuất kháng thể

Việc sản xuất kháng thể đa dòng đòi hỏi quy trình phức tạp và tốn nhiều thời gian. Các yếu tố như điều kiện nuôi cấy, loại kháng nguyên sử dụng và phương pháp thu nhận kháng thể đều ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả của kháng thể. Do đó, cần có các nghiên cứu sâu hơn để tối ưu hóa quy trình sản xuất.

2.2. Thách thức trong việc phát hiện B. anthracis

Việc phát hiện B. anthracis trong môi trường tự nhiên và trong mẫu bệnh phẩm là một thách thức lớn. Các phương pháp hiện tại như PCR và ELISA có thể mất nhiều thời gian và không phải lúc nào cũng chính xác. Do đó, cần phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh hơn và hiệu quả hơn để phát hiện vi khuẩn này kịp thời.

III. Phương pháp nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng B

Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng B. anthracis thường sử dụng các phương pháp như gây đáp ứng miễn dịch trên chuột, kỹ thuật ELISA và Western Blot. Những phương pháp này giúp xác định khả năng phản ứng của kháng thể với kháng nguyên và đánh giá hiệu quả của kháng thể trong việc phát hiện vi khuẩn.

3.1. Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên chuột

Phương pháp này bao gồm việc tiêm kháng nguyên vào cơ thể chuột để kích thích hệ miễn dịch sản xuất kháng thể. Sau khi tiêm, mẫu huyết thanh sẽ được thu thập và phân tích để xác định sự hiện diện của kháng thể. Đây là bước quan trọng trong việc tạo ra kháng thể đa dòng kháng B. anthracis.

3.2. Kỹ thuật ELISA và Western Blot

Kỹ thuật ELISA được sử dụng để định lượng kháng thể trong mẫu huyết thanh, trong khi Western Blot giúp xác định sự hiện diện của kháng thể đối với các protein cụ thể. Cả hai phương pháp này đều rất quan trọng trong việc đánh giá khả năng phản ứng của kháng thể và đảm bảo chất lượng của sản phẩm kháng thể.

IV. Ứng dụng thực tiễn của kháng thể đa dòng kháng B

Kháng thể đa dòng kháng B. anthracis có nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học và công nghệ sinh học. Chúng có thể được sử dụng để phát triển các bộ kit chẩn đoán nhanh, vaccine và các phương pháp điều trị mới cho bệnh than. Việc ứng dụng kháng thể đa dòng không chỉ giúp phát hiện bệnh mà còn nâng cao khả năng miễn dịch cho con người.

4.1. Phát triển bộ kit chẩn đoán nhanh

Bộ kit chẩn đoán nhanh sử dụng kháng thể đa dòng có thể giúp phát hiện B. anthracis trong thời gian ngắn, từ đó giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời. Các bộ kit này có thể được sử dụng trong các cơ sở y tế và phòng thí nghiệm để phát hiện nhanh chóng sự hiện diện của vi khuẩn.

4.2. Ứng dụng trong vaccine và điều trị

Kháng thể đa dòng cũng có thể được sử dụng để phát triển vaccine phòng ngừa bệnh than. Việc sử dụng kháng thể trong điều trị có thể giúp giảm thiểu triệu chứng và tăng cường khả năng miễn dịch cho bệnh nhân. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc phòng chống và điều trị bệnh than.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu kháng thể đa dòng kháng B

Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng B. anthracis là một lĩnh vực đầy tiềm năng và cần được tiếp tục phát triển. Các thách thức hiện tại trong việc sản xuất và phát hiện kháng thể cần được giải quyết để nâng cao hiệu quả của các phương pháp chẩn đoán và điều trị. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học và công nghệ sinh học.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất kháng thể và phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh hơn. Việc hợp tác giữa các nhà khoa học và các tổ chức y tế cũng rất quan trọng để thúc đẩy nghiên cứu và ứng dụng kháng thể đa dòng trong thực tiễn.

5.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về kháng thể đa dòng kháng B. anthracis không chỉ giúp phát hiện và điều trị bệnh than mà còn có thể áp dụng cho nhiều loại bệnh khác. Việc phát triển các phương pháp mới trong nghiên cứu này sẽ góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng và bảo vệ con người khỏi các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đặc điểm vi khuẩn B. anthracis (vi khuẩn than) là vi khuẩn đầu tiên được xác định là vi khuẩn gây bệnh.

Koch đã nuôi vi khuẩn này dưới dạng chủng thuần khiết, chứng minh được khả năng hình thành bào tử của nó và gây được bệnh than thực nghiệm bằng cách cấy nó vào cơ thể động vật. Vi khuẩn than thuộc loài Bacillus, họ Bacillaceae. Chi Bacillus là các trực khuẩn Gram dương, có bào tử, kỵ khí tuỳ tiện. Các vi khuẩn này gồm nhiều loài, đa số không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (B.

cereus), một số có lợi cho con người (B. anthracis có đặc điểm khác biệt với 3 loài trực khuẩn hiếu khí có bào tử trên là ở tính có độc lực của nó. anthracis có plasmids pXO1; pXO2 và plasmid mã hoá capsule, vỏ chỉ hình thành trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, hoặc được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng 0,7% Natri bicarbonat, ở nhiệt độ 37C trong điều kiện giàu CO2 (20%). Ở điều kiện ngoại cảnh hoặc trong môi trường nuôi cấy nghèo dinh dưỡng, vi khuẩn hình thành bào tử, nằm giữa thân và không làm thay đổi hình thể vi khuẩn.

Trên động vật bị bệnh hoặc môi trường nuôi cấy đặc biệt vi khuẩn có vỏ. Trong môi trường lỏng vi khuẩn không di động. anthracis Bào tử vi khuẩn B. anthracis 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Khuẩn lạc có kích thước lớn, đường kính 0,3 - 0,5 cm.

Màu khuẩn lạc trắng đến trắng ghi. Bề mặt khuẩn lạc ướt, hơi dính, không gây tan huyết trên thạch máu cừu (nhưng trên thạch máu thỏ có thể gây tan huyết). Trong các chương trình về vũ khí sinh học (VKSH) vi khuẩn gây bệnh than B. anthracis được coi là tác nhân sinh học thường đựơc chú ý quan tâm nhiều nhất vì trực khuẩn than có thể tồn tại trong thiên nhiên dưới dạng nha bào (bào tử) trong thời gian hơn 10 năm, có khả năng chịu nhiệt 160 độ C trong vòng 5 phút, chịu nước sôi đến 10 phút.

Người bị nhiễm bệnh than qua 3 con đường: qua da, đường tiêu hoá và đường thở. Bào tử than khi bị hít thở qua mũi chúng có khả năng vào tới các phế nang để gây bệnh than thể hô hấp và cư trú ở các phế bào của phế nang, qua hệ thống mạch bạch huyết chuyển tới hạch lympho của trung thất. Tại đó các vi khuẩn gây bệnh than này sinh trưởng và xâm nhập theo đường máu gây nhiễm khuẩn huyết và nhiễm khuẩn nhiều nơi trong cơ thể, gây tỷ lệ tử vong rất cao [3]. Độc tố của vi khuẩn than có sự tham gia của 3 yếu tố cấu thành: kháng nguyên bảo vệ (Protective Antigen-PA), giúp hai cấu tử khác là yếu tố gây phù nề (Edema Factor -EF) và yếu tố gây chết (Lethal Factor -LF) xâm nhập được vào tế bào của vật chủ và gây độc.

Về bản chất đây là 3 peptid do bản thân vi khuẩn sinh ra. Yếu tố gây phù nề làm bất hoạt tế bào bạch cầu trung tính của vật chủ làm cho các tế bào này không có khả năng thực bào để tiêu diệt vi khuẩn. Các nhà nghiên cứu cho rằng yếu tố gây chết của vi khuẩn than kích thích các đại thực bào sản sinh TNF-alpha và interleukin-1-beta (cả hai yếu tố này là thành phần của hệ miễn dịch có tác dụng trong phản ứng viêm và sốc phản vệ) và yếu tố này có thể gây chết vật chủ. Đây cũng là yếu tố khác biệt chủ yếu của B.

anthracis so với các chủng tương tự như B. cereus…[9,10] 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Hình 1: Nguyên lý gây bệnh than của vi khuẩn B. anthracis [3 ] Trước đây việc chẩn đoán xác định B. anthracis trong phòng thí nghiệm chủ yếu dựa vào việc phát hiện hình thái học và đặc điểm sinh học.

Các kỹ thuật DNA gần đây đáp ứng được yêu cầu phát hiện chính xác, cho phép phân biệt B. anthracis với các loại trực khuẩn khác trong “nhóm B.Đó là dựa vào sự có mặt của hai plasmids lớn (pXO1; pXO2) của trực khuẩn than chứa gen độc lực. Đặc điểm bào tử vi khuẩn B. Bào tử vi khuẩn B.

anthracis được hình thành trong môi trường thiếu các chất dinh dưỡng thiết yếu. Trong quá trình hình thành này sẽ có một sự phân chia không đối xứng của tế bào sinh dưỡng tạo ra một phần lớn và một phần nhỏ tương ứng là tế bào mẹ (mother cell) và tiền bào tử (forespore). Các tế bào mẹ sau đó bao lấy phần tiền bào tử, các lớp của bào tử dần được hình thành. Do đó bào tử của B.

anthracis bao gồm các lớp chính sau: lõi (spore core), vỏ lõi (cortex), vỏ bào tử (exosporium). Cuối cùng tế bào mẹ phân giải tạo nên các bào tử trưởng thành, các bào tử này không hoạt động nhưng có khả năng sống sót trong môi trường khắc nghiệt qua nhiều năm [10]. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Hình 2: Quá trình hình thành bào tử vi khuẩn than B. subtilis , lớp áo (coat) là lớp ngoài cùng của bào tử thì ở vi khuẩn B.

cereus có vỏ bào tử là lớp ngoài cùng. Cả áo bào tử và vỏ bào tử đều có cấu trúc linh hoạt, khả năng đàn hồi tốt. Mặt khác trên áo và vỏ bào tử tập trung một số enzyme có tác dụng bảo vệ. Hình 3: Cấu tạo bào tử quan sát dưới kính hiển vi điện tử [3,5 ] 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Ở hình 3a, là cấu tạo bào tử của vi khuẩn B.

subtilis , có lớp ngoài cùng là áo bào tử (Oc: outer coat layer). Ở lớp này tập trung chủ yếu các protein (chiếm khoảng 30% protein bào tử). Ước tính có khoảng 70 protein trên lớp áo bào tử, phần lớn các protein này là đặc hiệu cho chủng B. subtilis , người ta thường dựa vào các protein đó để kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn này.

Khác với vi khuẩn B. subtilis có lớp áo bào tử dày với lớp bên trong sáng và lớp bên ngoài tối, vi khuẩn than có áo bào tử mỏng. Lớp này được phân cách với lớp ngoài cùng bởi khoảng giữa (Is: interspace). Đối với các chủng B.

mycoides và một số thuộc nhóm Clostridia thì lớp ngoài cùng là vỏ bào tử. Hình 3b và hình 4 mô tả cấu tạo bào tử của vi khuẩn than. Hình 4: Cấu tạo các lớp của bào tử vi khuẩn than [3,5] Cấu tạo lớp ngoài cùng của bào tử gồm 2 lớp sau: lớp cơ bản (Bl: basal layer) và một phần bên ngoài giống như các sợi lông (Hn: hair-like nap). Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử và dùng nhiễu xạ X-quang, người ta thấy lớp cơ bản dày khoảng 190A0 được hình thành từ các lớp mỏng hơn.

Lớp cơ bản gồm 4 tấm kết tinh, mỗi tấm có cấu trúc lỗ có hình lục giác. anthracis thì lớp cơ bản dày khoảng 20- 30nm. Phần lông bao quanh bên ngoài là một glycoprotein gọi là BclA (Bacillus collagen-like protein of anthracis). Phần cấu trúc của BclA sẽ được mô tả cụ thể ở phần 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học sau.

Vỏ bào tử chiếm khoảng 2% khối lượng của bào tử và có khoảng 50% protein, 20% lipid , 20% polysaccharides trung tính, và 10% là các thành phần khác. Chức năng chính của vỏ bào tử là chống lại các tác nhân môi trường, do bề mặt kỵ nước nên làm tăng khả năng kết dính của bào tử. Mặt khác trên vỏ bào tử chứa một số enzyme có chức năng hoạt hoá sự hoạt động của bào tử. Vỏ bào tử cũng chính là điểm đầu tiên để bào tử tương tác với tế bào vật chủ của hệ thống miễn dịch [8].

Một số protein trên vỏ bào tử của vi khuẩn than Các protein trên vỏ bào tử B. anthracis là đối tượng thường được sử dụng để phát hiện sự có của vi khuẩn than. Theo thống kê của một số tài liệu [14] thì có khoảng gần 20 protein có mặt trên vỏ bào tử của vi khuẩn này. Có thể kể đến một số protein sau: BclA, Alanine racemase (Alr), Inosine hydrolase (InH), Protein ExsF, Protein CotY, Protein Cot E, Protein Cot H, Protein ExsY, Protein CotB, Protein giả thuyết ExsK, Protein BxpB, Protein BclA, Protein BxpA.

Các protein nhóm D là các enzyme. Các enzyme này có vai trò trong việc bảo vệ bào tử khỏi phản ứng ôxy hoá đồng thời ngăn chặn sự nảy mầm sớm. Người ta đã chứng minh được rằng những enzyme kể trên xuất hiện ở giai đoạn trưởng thành của vỏ bào tử vi khuẩn. Alr chuyển hoá L-alanine thành D-alanine (một chất ức chế sự nảy mầm), InH sẽ phân huỷ inosine ngăn cản quá trình nảy mầm bằng cách giảm tối thiểu lượng inosine [14].

Các protein nhóm E như ExsY, CotY, CotB. Những protein này có thể được đính ở lớp cơ bản hoặc lớp ngoài của áo bào tử. Chúng tham gia trong quá trình lắp ráp của vỏ bào tử. Nhóm các protein bào tử bao gồm các protein có cùng nguồn gốc với các protein của các protein của B.

subtilis có vai trò gắn với lớp áo (coat) hoặc các thành phần phía ngoài áo. 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Hình 5: Các protein trên vỏ bào tử của một vài loại vi khuẩn [ 14 ] 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sỹ Nguyễn Thành Đạt-K18 Sinh học Protein nhóm F như BclA, ExsB, ExsC, ExsD,BxpB,. là các protein có trọng lượng phân tử cao. Có thể kể đến những đặc điểm cơ bản của một số protein thuộc nhóm này.

BxpB được tìm thấy ở lớp cơ bản nhờ đánh dấu miễn dịch huỳnh quang bằng vàng. Protein này tạo phức liên kết hoá trị mạnh với BclA, các protein khác ở lớp cơ bản và lớp lông bên ngoài gồm ExsY và CotY. Khi BxpB được tách chiết từ bào tử bằng SDS, nó được tách ở cả dạng đơn phân và dạng phức hệ khối lượng phân tử lớn với BclA. BxpB bị đột biến không có khả năng bám với lông bên ngoài, mặc dù BclA vẫn được tổng hợp bình thường.

Thiếu BxpB dẫn đến bào tử nảy mầm nhanh hơn. Một nhóm các protein, như BxpA, BxpB (còn gọi ExsFA), BxpC, ExsC. chỉ được tìm thấy ở các vi sinh vật thuộc B. Điều này cho thấy vỏ bào tử ở các sinh vật khác được gắn với lớp cơ bản bằng một nhóm các protein khác.