Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng progesterone ở bò

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu vnua nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng progesterone ở bò, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất giải pháp cải thiện thực tiễn.

• Tác giả: Dương Văn Cường
• Người hướng dẫn: TS. Cù Thị Thiên Thu
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Chăn nuôi
• Đề tài: Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng progesterone ở bò
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 2. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 3. DANH MỤC BẢNG
• 4. DANH MỤC HÌNH
• 5. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• 6. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 7. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
• 8. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
• 9. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 9.1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA ĐỀ TÀI TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
• 9.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 9.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 9.2. QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH VÀ CHỨC NĂNG CỦA HORMONE PROGESTERONE
• 9.2.1. Tổng quan về Hormone

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu kháng thể đơn dòng kháng progesterone ở bò

Nghiên cứu kháng thể đơn dòng kháng progesterone ở bò là một lĩnh vực quan trọng trong ngành chăn nuôi. Hormone progesterone đóng vai trò thiết yếu trong việc điều hòa sinh sản của bò. Việc phát hiện sớm thai kỳ thông qua kháng thể đơn dòng có thể cải thiện hiệu quả chăn nuôi và sản xuất sữa. Nghiên cứu này không chỉ giúp nâng cao năng suất mà còn giảm thiểu chi phí cho người chăn nuôi.

1.1. Kháng thể đơn dòng và ứng dụng trong chăn nuôi

Kháng thể đơn dòng là sản phẩm của tế bào lai, có khả năng nhận diện và liên kết với một kháng nguyên cụ thể. Trong chăn nuôi, kháng thể đơn dòng kháng progesterone có thể được sử dụng để phát hiện sớm thai kỳ ở bò, từ đó giúp nâng cao hiệu quả sản xuất.

1.2. Hormone progesterone và vai trò trong sinh sản

Hormone progesterone được sản xuất chủ yếu từ thể vàng, có vai trò quan trọng trong việc duy trì thai kỳ. Nồng độ progesterone trong máu có thể phản ánh tình trạng sinh lý của bò, giúp chẩn đoán có thai sớm và chính xác.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu kháng thể đơn dòng

Mặc dù nghiên cứu kháng thể đơn dòng kháng progesterone mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức. Việc sản xuất kháng thể đơn dòng đòi hỏi quy trình phức tạp và chi phí cao. Ngoài ra, việc đảm bảo tính đặc hiệu và độ nhạy của kháng thể cũng là một vấn đề cần được giải quyết.

2.1. Chi phí và quy trình sản xuất kháng thể

Quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng bao gồm nhiều bước như gây miễn dịch, thu tế bào lympho B, và dung hợp tế bào. Mỗi bước đều yêu cầu kỹ thuật cao và trang thiết bị hiện đại, dẫn đến chi phí sản xuất cao.

2.2. Đảm bảo tính đặc hiệu và độ nhạy của kháng thể

Tính đặc hiệu và độ nhạy của kháng thể đơn dòng là yếu tố quyết định đến hiệu quả chẩn đoán. Cần thực hiện các thử nghiệm để xác định khả năng nhận diện kháng nguyên của kháng thể, nhằm đảm bảo kết quả chính xác trong chẩn đoán thai kỳ.

III. Phương pháp nghiên cứu kháng thể đơn dòng kháng progesterone

Nghiên cứu kháng thể đơn dòng kháng progesterone được thực hiện thông qua các phương pháp khoa học hiện đại. Các bước chính bao gồm gây miễn dịch cho chuột, thu tế bào lympho B, và sàng lọc tế bào lai. Phương pháp ELISA được sử dụng để xác định khả năng sản xuất kháng thể.

3.1. Gây miễn dịch cho chuột BALB c

Chuột BALB/c được gây miễn dịch bằng các kháng nguyên progesterone khác nhau. Quá trình này giúp kích thích hệ miễn dịch của chuột sản xuất kháng thể đặc hiệu.

3.2. Sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể

Sau khi thu tế bào lympho B, các tế bào này được dung hợp với tế bào myeloma để tạo ra tế bào lai. Các tế bào lai này sẽ được sàng lọc bằng phương pháp ELISA để xác định khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy đã tạo ra nhiều dòng tế bào lai có khả năng tiết kháng thể đơn dòng kháng progesterone. Những kháng thể này có thể được ứng dụng trong việc sản xuất các bộ kit chẩn đoán thai kỳ nhanh cho bò, giúp nâng cao hiệu quả chăn nuôi.

4.1. Các dòng tế bào lai và khả năng sản xuất kháng thể

Nghiên cứu đã tạo ra nhiều dòng tế bào lai khác nhau, mỗi dòng có khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu với progesterone. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm chẩn đoán mới.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất que thử thai nhanh

Kháng thể đơn dòng kháng progesterone có thể được sử dụng để sản xuất que thử thai nhanh cho bò. Phương pháp này giúp phát hiện thai kỳ sớm, từ đó nâng cao hiệu quả chăn nuôi và giảm chi phí cho người chăn nuôi.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu kháng thể đơn dòng kháng progesterone ở bò không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn mang lại giá trị thực tiễn cao. Việc phát triển các sản phẩm chẩn đoán thai kỳ nhanh sẽ góp phần nâng cao năng suất và hiệu quả trong ngành chăn nuôi bò sữa tại Việt Nam.

5.1. Ý nghĩa khoa học của nghiên cứu

Nghiên cứu này đóng góp vào kho tàng kiến thức về miễn dịch học và sinh sản động vật. Các kết quả đạt được sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này.

5.2. Triển vọng phát triển sản phẩm chẩn đoán

Với những kết quả đạt được, việc phát triển các sản phẩm chẩn đoán thai kỳ nhanh cho bò sẽ trở thành hiện thực. Điều này không chỉ giúp nâng cao năng suất chăn nuôi mà còn đáp ứng nhu cầu thực phẩm ngày càng tăng của thị trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong giai đoạn 2008 – 2018, ngành chăn nuôi bò sữa tại Việt Nam ghi nhận bước phát triển vượt bậc khi tổng đàn tăng từ 108.000 con lên 294.400 con, đạt tốc độ tăng trưởng bình quân 10,5%/năm theo số liệu của Cục Chăn nuôi. Tuy nhiên, điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm cùng kỹ thuật quản lý sinh sản chưa đồng bộ khiến tỷ lệ thụ thai và năng suất đàn bò còn nhiều hạn chế. Việc chậm phát hiện gia súc không mang thai sau phối giống làm gia tăng khoảng cách lứa đẻ vượt mức 420 ngày, gây lãng phí thức ăn và suy giảm sản lượng sữa nghiêm trọng. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như khám qua trực tràng hay siêu âm chỉ cho kết quả chính xác sau 42 – 60 ngày phối giống.

Để giải quyết nút thắt này, việc định lượng hormone Progesterone (P4) – chỉ thị nội tiết quan trọng do thể vàng tiết ra – mở ra giải pháp chẩn đoán có thai sớm ở ngày thứ 21 – 25 sau phối giống. Bò mang thai duy trì nồng độ P4 huyết thanh từ 3 ng/ml trở lên hoặc nồng độ P4 trong sữa từ 11 ng/ml trở lên, trong khi bò không mang thai giảm xuống dưới 0,38 ng/ml ở ngày thứ 21. Luận văn thạc sĩ của tác giả Dương Văn Cường tập trung vào mục tiêu tạo các dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng (mAb) đặc hiệu kháng progesterone, xây dựng nền tảng sinh học phục vụ sản xuất bộ sinh phẩm ELISA và que thử thai nhanh (Quick Stick) nội địa. Nghiên cứu được triển khai từ tháng 11/2018 đến tháng 9/2019 tại Bệnh viện Thú y và Phòng thí nghiệm Khoa Thú y thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, mở ra tiềm năng giảm hơn 50% giá thành xét nghiệm so với sinh phẩm nhập ngoại.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu vận dụng hệ thống lý thuyết nội tiết học sinh sản động vật, trọng tâm là trục điều hòa Thần kinh – Thể dịch (Vùng dưới đồi – Tuyến yên – Buồng trứng). Hoạt động sinh dục của bò chịu sự chi phối chặt chẽ bởi GnRH kích thích tiết FSH và LH theo tỷ lệ tối ưu 3/1, từ đó điều hòa sự phát triển nang trứng và hình thành thể vàng tiết progesterone. Progesterone là một steroid hormone gồm 21 nguyên tử carbon có cấu trúc nhân pregnan, đóng vai trò ức chế tiết gonadotropin và duy trì trạng thái mang thai.

Bên cạnh đó, đề tài ứng dụng lý thuyết miễn dịch học hiện đại và công nghệ Hybridoma do Georges Köhler và César Milstein phát minh năm 1975. Kháng thể dịch thể bản chất là glycoprotein immunoglobulin có trọng lượng phân tử khoảng 160.000 Da, cấu tạo từ 2 chuỗi nặng (mỗi chuỗi khoảng 50.000 Da với 450 axit amin) và 2 chuỗi nhẹ (mỗi chuỗi khoảng 25.000 Da với 211 – 221 axit amin). Do progesterone là một bán kháng nguyên (hapten) có trọng lượng phân tử nhỏ không tự sinh miễn dịch, mô hình nghiên cứu phải sử dụng phức hợp kháng nguyên gắn protein mang (BSA hoặc CMO:BSA) để kích hoạt tế bào lympho B mẫn cảm trước khi tiến hành dung hợp với tế bào u tủy Myeloma Sp2/0 bất tử thiếu enzyme HPRT.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thiết kế quy mô thực nghiệm trên cỡ mẫu gồm 135 chuột thuần chủng BALB/c 6 tuần tuổi khỏe mạnh, được phân nhóm ngẫu nhiên vào các lô thí nghiệm đánh giá 3 loại kháng nguyên chuẩn: Progesterone Antigen (mã MBS238011), Progesterone-3-BSA (mã LA330) và Progesterone-3-CMO:BSA (mã ND-R0752). Chuột được gây miễn dịch ở 4 mức liều 50 µg, 100 µg, 200 µg và 300 µg/lần/con kết hợp chất bổ trợ Freund (FCA và FIA), lặp lại 3 đợt cách nhau 3 ngày, cùng lô đối chứng 0 µg. Phương pháp chọn mẫu tập trung vào việc thu nhận tế bào lympho B từ hạch bẹn và lách của 5 cá thể có đáp ứng sinh kháng thể cao nhất mỗi nhóm (mật độ 10^8 tế bào/ml).

Quá trình dung hợp tế bào lympho B với dòng tế bào u tủy Myeloma Sp2/0 (mật độ 10^6 – 10^7 tế bào/ml) được xúc tác bằng chất kích thích Polyethylene Glycol (PEG 1500) ở dải pH 8,2 – 8,4 trong thời gian tiếp xúc 1 – 2 phút. Tế bào lai được chọn lọc trên môi trường HAT (chứa Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine) trong 5 – 7 ngày nhằm loại bỏ hoàn toàn các tế bào u tủy chưa dung hợp. Để sàng lọc và xác định tính đặc hiệu, phương pháp ELISA gián tiếp được lựa chọn ưu tiên thay thế cho phương pháp miễn dịch phóng xạ RIA nhờ độ nhạy vượt trội đạt ngưỡng 0,1 ng/ml, thời gian phản ứng nhanh, an toàn phóng xạ và cho phép xử lý đồng loạt hàng trăm mẫu tại bước sóng đo quang học 630 nm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận những kết quả thực nghiệm nổi bật với hệ thống số liệu rõ ràng:

• Đáp ứng miễn dịch tối ưu theo liều lượng: Chuột BALB/c thể hiện khả năng đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể mạnh nhất ở nồng độ kháng nguyên 200 µg/lần/con. Giá trị mật độ quang OD450/OD630 ở mức liều này cao hơn 45% so với mức liều 50 µg/lần/con và vượt trội so với liều 300 µg/lần/con, số lượng tế bào lympho B thu nhận đạt từ 10^8 đến 10^9 tế bào/ml dịch huyền phù.
• Phân lập thành công 11 dòng hybridoma đặc hiệu: Quá trình sàng lọc bằng ELISA sau 10 ngày dung hợp đã tuyển chọn được 11 dòng tế bào lai sinh trưởng ổn định, bao gồm: 5 dòng tế bào lai đặc hiệu với Progesterone Antigen (ký hiệu: E4, E3, C6, H3, F10); 3 dòng tế bào lai đặc hiệu với Progesterone-3-BSA (ký hiệu: C12, D7, F11); và 3 dòng tế bào lai đặc hiệu với Progesterone-3-CMO:BSA (ký hiệu: G5, H3, A7).
• Hiệu suất sinh kháng thể in vivo vượt trội: Khi nuôi cấy in vitro trong bình nuôi tế bào với môi trường DMEM bổ sung 5 – 10% FBS, hàm lượng kháng thể chỉ đạt 10 – 60 µg/ml. Ngược lại, phương pháp nhân dòng in vivo qua dịch báng phúc mạc chuột BALB/c (sau khi xử lý bằng 0,5 ml pristane) cho nồng độ kháng thể đơn dòng đạt 1 – 10 mg/ml (tương đương 1.000 – 10.000 µg/ml), tăng hiệu suất sinh khối gấp hơn 100 lần.
• Tính đặc hiệu và bắt cặp chéo: Thử nghiệm ELISA kiểm tra độ tinh sạch và tính liên kết cho thấy các kháng thể IgG thu được sau tinh chế có khả năng nhận diện chính xác epitope của progesterone, tỷ lệ phản ứng chéo với các hormone steroid tương đồng khác như testosterone hay estrogen luôn duy trì ở mức dưới 5%.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả đáp ứng miễn dịch cao nhất ở liều 200 µg/lần/con được giải thích bởi cơ chế kích hoạt cân bằng của hệ thống đại thực bào và tế bào trình diện kháng nguyên, tránh được hiện tượng dung nạp miễn dịch do quá tải liều (immunological tolerance) thường thấy ở mức liều 300 µg. Dữ liệu thực nghiệm phân tích hiệu giá kháng thể qua các bước pha loãng huyết thanh (từ 1/100 đến 1/12.800) được thể hiện trực quan qua biểu đồ đường động học chuẩn độ OD, cho thấy đường cong tăng trưởng tuyến tính rõ rệt ở các phân đoạn tinh chế từ số 2 đến số 9.

Khi đối chiếu với các công bố khoa học quốc tế, kết quả này hoàn toàn tương thích với mô hình chẩn đoán mang thai sớm ở lợn của Wu (1997) với độ chính xác đạt 92,2%, đồng thời củng cố nghiên cứu của Phan Văn Kiểm và Nguyễn Bá Mùi (2005) về quy luật biến thiên progesterone trong chu kỳ động dục 21 ngày của bò. Việc tinh sạch thành công kháng thể đơn dòng IgG qua cột sắc ký ái lực và điện di SDS-PAGE xác nhận độ thuần khiết cao, khẳng định tiềm năng ứng dụng trực tiếp vào việc gắn kết hạt keo vàng hoặc enzyme peroxidase để chế tạo que thử sắc ký miễn dịch nhanh.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đưa ra 4 khuyến nghị then chốt nhằm thúc đẩy chuyển giao công nghệ vào thực tiễn:

• Chuẩn hóa quy trình sản xuất sinh khối in vivo: Nhóm nghiên cứu tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam cần tiến hành tối ưu hóa quy trình nuôi cấy dòng tế bào lai E4, C12 và G5 trong dịch báng chuột BALB/c, đặt mục tiêu thu nhận tối thiểu 500 ml dịch báng có nồng độ kháng thể 5 – 8 mg/ml trong vòng 6 tháng tới.
• Thiết kế và thử nghiệm que thử thai nhanh dạng que (Quick Stick): Doanh nghiệp công nghệ sinh học thú y cần phối hợp với các viện nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn dòng thu được để sản xuất que thử nhanh sắc ký mao dẫn với ngưỡng phát hiện 8 – 11 ng/ml progesterone trong sữa, hoàn thành thử nghiệm pilot trong thời gian 12 tháng.
• Xây dựng quy chuẩn chẩn đoán bệnh lý sinh sản: Cục Thú y và các hiệp hội chuyên ngành cần ban hành hướng dẫn sử dụng bộ kit ELISA định lượng progesterone nhằm phát hiện sớm các bệnh lý buồng trứng gây chậm sinh (như thể vàng tồn lưu có P4 > 1,4 ng/ml hoặc u nang buồng trứng có P4 < 0,6 ng/ml) trong vòng 9 tháng.
• Thử nghiệm lâm sàng diện rộng tại trang trại: Triển khai thử nghiệm ứng dụng que thử thai nhanh trên quy mô tối thiểu 20 trang trại chăn nuôi bò sữa tại Hà Nội và Lâm Đồng giai đoạn 2020 – 2022, hướng tới mục tiêu rút ngắn khoảng cách lứa đẻ trung bình từ 420 ngày xuống 380 ngày.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang giá trị học thuật và thực tiễn cao, đặc biệt hữu ích cho các nhóm đối tượng sau:

• Các nhà khoa học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Thú y, Chăn nuôi, Công nghệ Sinh học: Sử dụng luận văn như tài liệu tham khảo chuẩn mực về quy trình tạo dòng tế bào lai Hybridoma, kỹ thuật dung hợp bằng PEG và phương pháp tinh chế kháng thể đơn dòng.
• Bác sĩ thú y và kỹ sư quản lý trang trại bò sữa: Nắm vững động thái thay đổi nồng độ progesterone theo chu kỳ 21 ngày để thiết lập lịch phối giống chính xác, kiểm tra thai sớm ở ngày 21 – 22 và can thiệp kịp thời các ca rối loạn nội tiết.
• Các đơn vị sản xuất sinh phẩm y tế và kit chẩn đoán thú y: Tiếp cận giải pháp kỹ thuật để nội địa hóa sản phẩm que thử nhanh Quick Stick và kit ELISA, giảm chi phí nhập khẩu nguyên liệu và hạ giá thành thương mại.
• Giảng viên và sinh viên các trường đại học nông lâm: Ứng dụng số liệu và quy trình thực nghiệm của luận văn vào bài giảng môn Miễn dịch học chuyên sâu, Sinh lý sinh sản gia súc và Công nghệ tế bào động vật.

Câu hỏi thường gặp

• Tại sao nghiên cứu phải dùng kháng nguyên liên kết BSA hoặc CMO:BSA thay vì progesterone nguyên bản? Progesterone là một steroid có trọng lượng phân tử nhỏ (bán kháng nguyên/hapten) nên không có khả năng tự kích thích hệ miễn dịch sinh kháng thể. Do đó, bắt buộc phải gắn phân tử progesterone với protein mang như Bovine Serum Albumin (BSA) để tạo phức hợp kháng nguyên hoàn chỉnh, kích thích chuột BALB/c sản sinh lympho B đặc hiệu.

• Phương pháp ELISA xác định progesterone có ưu điểm gì so với phương pháp miễn dịch phóng xạ RIA? Kỹ thuật ELISA có độ nhạy rất cao (đạt ngưỡng 0,1 ng/ml), thao tác đơn giản, không yêu cầu thiết bị đếm phóng xạ đắt tiền và hoàn toàn an toàn cho kỹ thuật viên. Thời gian phản ứng tạo màu chỉ mất khoảng 15 phút với dung dịch dừng phản ứng HCl 1M và đọc kết quả tự động ở bước sóng 630 nm.

• Việc nuôi cấy tế bào lai in vivo mang lại hiệu quả kinh tế và sản lượng như thế nào so với in vitro? Nuôi cấy tế bào lai in vitro trong bình chứa chỉ cho sản lượng từ 10 – 60 µg/ml dịch nuôi cấy. Trong khi đó, nuôi cấy in vivo qua dịch báng chuột tạo ra nồng độ kháng thể đạt từ 1 – 10 mg/ml (tức 1.000 – 10.000 µg/ml), giúp tăng sản lượng kháng thể lên gấp 100 đến 160 lần.

• Thời điểm nào là tối ưu nhất để lấy mẫu chẩn đoán thai sớm ở bò thông qua nồng độ progesterone? Thời điểm vàng để lấy mẫu sữa hoặc huyết thanh là ngày thứ 21 đến 22 sau khi phối giống. Nếu bò mang thai, nồng độ progesterone huyết thanh duy trì từ 3 ng/ml trở lên hoặc nồng độ trong sữa đạt từ 11 ng/ml trở lên; nếu nồng độ trong sữa dưới 8 ng/ml thì xác định bò không mang thai.

• Môi trường chọn lọc HAT hoạt động theo nguyên lý nào trong kỹ thuật Hybridoma? Môi trường HAT chứa aminopterin có tác dụng ức chế con đường tổng hợp de novo của ADN. Các tế bào u tủy Myeloma Sp2/0 chưa dung hợp bị đột biến thiếu enzyme HPRT sẽ bị tiêu diệt hoàn toàn sau 5 – 7 ngày, chỉ có các tế bào lai mang enzyme HPRT từ lympho B mới có thể sống sót qua con đường tận dụng hypoxanthine và thymidine.

Kết luận

• Hoàn thiện thành công phác đồ gây miễn dịch trên 135 chuột thuần chủng BALB/c với liều kháng nguyên tối ưu 200 µg/lần/con, thu được mật độ tế bào lympho B mẫn cảm đạt 10^8 – 10^9 tế bào/ml.
• Thiết lập và bảo tồn thành công 11 dòng tế bào lai Hybridoma sinh trưởng ổn định (gồm 5 dòng đặc hiệu Progesterone Antigen, 3 dòng đặc hiệu Progesterone-3-BSA và 3 dòng đặc hiệu Progesterone-3-CMO:BSA).
• Chứng minh hiệu suất thu nhận kháng thể đơn dòng in vivo qua dịch báng đạt nồng độ vượt trội 1 – 10 mg/ml, cao gấp hơn 100 lần so với phương pháp in vitro truyền thống.
• Đặt nền móng khoa học then chốt để chủ động sản xuất các bộ kit ELISA và que thử thai nhanh Quick Stick trên bò tại Việt Nam với giá thành dự kiến giảm trên 50%.
• Kế hoạch tiếp theo cần tập trung chuẩn hóa quy trình sản xuất quy mô công nghiệp và thử nghiệm lâm sàng trên 500 cá thể bò sữa trong vòng 18 – 24 tháng tới nhằm thương mại hóa sản phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƯƠNG VĂN CƯỜNG NGHİÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG PROGESTERONE Ở BÒ Ngành: Chăn nuôi Mã số: 8620105 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS Cù Thị Thiên Thu 2.TS Nguyễn Bá Mùi NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn Dương Văn Cường i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Cù Thị Thiên Thu và PGS-TS Nguyễn Bá Mùi đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Sinh lý - Tập tính động vật, Khoa Chăn Nuôi - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Khoa Thú y, Bệnh viện Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày. tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn Dương Văn Cường ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt.

vi Danh mục bảng. vii Danh mục hình. viii Trích yếu luận văn. ix Thesis abstract.

Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Tổng quan tài liệu.

Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài trong và ngoài nước. Tình hình nghiên cứu trên thế giới. Tình hình nghiên cứu trong nước. Quá trình hình thành và chức năng của Hormone Progesterone.

Tổng quan về Hormone. Sự điều hoà hoạt động sinh dục tuyến nội tiết. Một số hiểu biết về miễn dịch học. Miễn dịch và đáp ứng miễn dịch.

Các cơ quan và tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch. Kháng nguyên (Antigen). Kháng thể. Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể.

Kháng thể đơn dòng và ứng dụng. Kỹ thuật ELISA. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 33 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Nội dung nghiên cứu. Gây miễn dịch cho chuột thuần chủng BALB/c bằng các kháng nguyên khác nhau.

Thu số lượng tế bào lympho B ở chuột gây miễn dịch. Đánh thức và nuôi cấy tế bào Myeloma Sp2/0 dùng để dung hợp với tế bào Lympho B. Sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng bằng phản ứng ELISA. Nuôi cấy tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu progesterone.

Xác định nồng độ kháng thể đơn dòng được tạo ra trong dịch báng của chuột BALB/c. Kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu, bắt cặp chéo giữa kháng thể đơn dòng với các kháng nguyên. Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp gây miễn dịch cho chuột thuần chủng BALB/c bằng các kháng nguyên khác nhau.

Phương pháp thu số lượng tế bào lympho B ở chuột gây miễn dịch. Phương pháp đánh thức và nuôi cấy tế bào Myeloma Sp2/0 dùng để dung hợp với tế bào Lympho B. Sàng lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng bằng phương pháp ELISA. Phương pháp nuôi cấy tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu progesterone.

Phương pháp xác định nồng độ kháng thể đơn dòng được tạo ra trong dịch báng của chuột BALB/c. Kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu, bắt cặp chéo giữa kháng thể đơn dòng với các kháng nguyên. Kết quả và thảo luận. Kết quả đáp ứng miễn dịch của chuột với các kháng nguyên.

Kết quả thu số lượng tế bào Lympho B ở chuột gây miễn dịch. Kết quả dung hợp tế bào Myeloma SP2/0 với tế bào Lympho B. Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng bằng phản ứng ELISA. 47 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Kết quả nuôi cấy tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng. Xác định nồng độ kháng thể đơn dòng được tạo ra trong dịch báng của chuột BALB/c. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể bằng phương pháp ELISA. Kết quả tinh chế kháng thể từ dịch nước báng.

Kết quả chạy điện di kháng thể IgG thu được trên gel SDS-PAGE. Kết qủa kiểm tra khẳ năng bắt cặp đặc hiệu, bắt cặp chéo giữa kháng thể đơn dòng với các kháng nguyên. Kết luận và kiến nghị. 58 Tài liệu tham khảo.

59 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BSA Bovine Serum Albumin Cs Cộng sự DMEM Dulbeco Modified Eagl Medium ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch EIA Enzyme Immuno Assay ELISA Enzyme Linkied Imumuno Sorbent Assay FBS Fetal Bovine Serum FCA Freund complete Adjuvant FIA Freund’s Incomplete Adjuvant FSH Follicle Stimulating Hormone GnRH Gonadotropin Realising Hormone HAT HypoxanthineAminopterinThimidine HPRT Hypoxathin Phospho Ribosyl Transferase HT Hypoxanthine Thimidine KN Kháng nguyên KT Kháng thể KTĐD Kháng thể đơn dòng LH Luteinizing Hormone PBS FetalBovineSerum PEG Polyethylene glycol PGF2α Progesterone F2α RIA Radio Immuno Assay vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 4. Giá trị OD450 mẫu huyết thanh chuột ở các nồng độ gây miễn dịch khác nhau đối với từng loại kháng nguyên. Số lượng tế bào Lympho B ở chuột có khả năng đáp ứng miễn dịch tốt nhất với 3 kháng nguyên khác nhau. Kết quả lai giữa tế bào Myeloma Sp2/0 và tế bào lymphoB của chuột BALB/c được gây miễn dịch với các kháng nguyên khác nhau.

Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesteron Antigen bằng phản ứng ELISA. Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-BSA Antigen bằng phản ứng ELISA. Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone -3- CMO:BSA Antigen bằng phản ứng ELISA. Số lượng tế bào sau khi phục hồi.

Hàm lượng kháng thể đặc hiệu progesterone sau tinh chế. Tính đặc hiệu của các kháng thể đơn dòng tạo ra với các kháng nguyên tương ứng. Khả năng bắt cặp chéo giữa các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các kháng nguyên khác bằng phản ứng ELISA. 57 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 2.

Cơ chế tác dụng của hormone. Điều hoà tiết các hormone và vị trí tác động của chúng trong kỳ động dục của bò. Công thức cấu tạo progesterone. Biến thiên nồng độ progesteron sau khi thụ tinh có kết quả và thời điểm lấy mẫu chẩn đoán có thai.

Công thức cấu tạo của kháng thể (Đỗ Ngọc Liên, 1999). Kháng thể đơn dòng liên kết với một epitope đặc hiệu. Qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng. Kỹ thuật ELISA.

Gây miễn dịch cho chuột BALB/c. Thu hạch bẹn chuột. Thu lách chuột. Nghiền nhỏ hạch bẹn và lách chuột.

Chuột BALB/c trước khi tiêm. Tiêm tế bào lai vào xoang phúc mạc chuột. Thu dịch báng trong xoang phúc mạc chuột. Dịch báng thu được sau khi ly tâm loại bỏ cặn.

Tế bào lai sau 24h phục hồi. Tế bào lai sau 72h phục hồi. Kết quả ELISA dịch nước báng ở các độ pha loãng khác nhau. Đồ thị biểu diễn các phân đoạn thu được khi tinh chế kháng thể đơn dòng từ dịch nước báng.

Dịch thu được ở các phân đoạn 2-9. 55 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Dương Văn Cường Tên luận văn: Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng progesterone ở bò Ngành : Chăn nuôi Mã số: 8620105 Cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu Tạo được các dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng kháng progesterone, làm cơ sở cho việc ứng dụng sản xuất que thử thai nhanh trên bò tại Việt Nam. Phương pháp nghiên cứu - Gây miễn dịch trên chuột BALB/c bằng ba kháng nguyên chuẩn: Progesterone Antigen (Mã code MBS238011, hãng Mybiosource, Mỹ); Progesterone-3-BSA Antigen (Mã code LA330, hãng EastCoast Bio, Mỹ); Proesterone-3-CMO:BSA Antigen (Mã code ND-R0752, hãng Novateinbio, Mỹ). - Tế bào lympho B mẫn cảm với kháng nguyên được thu từ lách và hạch của chuột BALB/c - Đánh thức và nuôi cấy tế bào Myeloma dùng để dung hợp với tế bào Lympho B để tạo dòng tế bào lai hybrydoma có khả năng tiết kháng thể đơn dòng.

- Bằng phản ứng ELISA sàng lọc được các dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với Progesterone. - Kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu và khả năng bắt cặp chéo giữa kháng thể đơn dòng với các kháng nguyên bằng phương pháp ELISA. Kết quả chính và kết luận - Chuột có khả năng đáp ứng miễn dịch tốt nhất đối với các kháng nguyên progesterone ở nồng độ 200 µg/lần/con. - Đã tạo được 5 dòng tế bào lai (đặt tên là: E4, E3, C6, H3, F10) có khả năng tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone Antigen.

- Đã tạo được 3 dòng tế bào lai (đặt tên là: C12, D7, F11) có khả năng tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-BSA antigen. - Đã tạo được 3 dòng tế bào lai (đặt tên là: G5, H3, A7) có khả năng tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-CMO:BSA Antigen. ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.