MỞ ĐẦU Gout là một bệnh chuyển hóa thƣờng gặp ở nam giới, gây ra các cơn đau dữ dội ở vùng khớp, kèm theo đó các triệu chứng nhƣ sƣng đỏ ở các khớp ngón. Ở giai đoạn muộn, bệnh có thể dẫn đến nhiều biến chứng nguy hiểm đến sức khỏe nhƣ tiểu đƣờng, các bệnh về giác mạc, mất hoạt động chức năng khớp. Bệnh do sự bất thƣờng trong bài tiết uric acid dẫn đến sự tăng uric acid huyết và hình thành các tinh thể monosodium urate (MSU) tại các khớp. Các tinh thể này dẫn đến sự đáp ứng miễn dịch của các tế bào bạch cầu trung tính mà chủ yếu là sự tăng cƣờng biểu hiện của các cytokin nhƣ Interleukin-1beta (IL-1β), IL-18.
Các thuốc điều trị Gout hiện nay đa phần đều là những thuốc kháng viêm phổ rộng, không có tính đặc hiệu cao và thƣờng có những tác dụng phụ nhƣ suy giảm chức năng thận, gan và hệ miễn dịch. Do đó, chúng tôi thực hiện nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng chống oxi hóa, kháng viêm của cao chiết Thực vật lấy từ một số bài thuốc trị Gout của ngƣời Việt trên dòng tế bào RAW” nhằm: - Tạo cao, tách chiết và phân tích một số thành phần có trong dịch chiết của một số vị thuốc Nam đƣợc sử dụng trong điều trị gout; - Thử nghiệm đánh giá khả năng chống oxi hóa, ức chế cytokine IL-1β của cao chiết một số vị thuốc Nam trên dòng tế bào RAW và trên dòng chuột đực Swiss trắng. Nghiên cứu này đƣợc thực hiện tại các phòng Thí nghiệm thuộc Trung tâm Khoa học Sự sống, BM Tế bào học, BM Sinh lý học và Sinh học ngƣời – Khoa Sinh học và tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc, thuộc Hệ thống Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein (KLEPT), đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1- TỔNG QUAN 1.
Định nghĩa và dấu hiệu lâm sàng Gout là tính trạng rối loạn chuyển hóa gây ra các cơn đau bất chợt và gây đỏ ở các khớp, đặc biệt là các khớp ngón. Nguyên nhân chính gây ra bệnh là do nồng độ uric acid trong máu tăng cao, có thể hình thành các tinh thể monosodium urate (MSU), chính các tinh thể này tích tụ trong các khớp ngón, dẫn tới tính trạng viêm và đau nhức, trạng thái này đƣợc gọi là tăng uric acid huyết (hyperuricemia) [36]. Ở các động vật khác không thuộc bộ linh trƣởng, lƣợng uric acid (UA) trong máu đƣợc điều hòa thông qua enzyme uricase, giúp phân giải UA thành allantoin và có thể đƣợc bài tiết qua đƣờng nƣớc tiểu. Tuy nhiên, ở các động vật linh trƣởng, trong đó có con ngƣời thì gen mã hóa cho enzyme uricase bị bất hoạt, làm cho UA trong máu không thể chuyển hóa và dễ hình thành các tinh thể ở khớp [10].
Bên cạnh đó, tình trạng này còn do quá trình hoạt động chức năng quá mức của gan và sự mất khả năng bài tiết của thận. Tuy nhiên, cũng có các yếu tố khác tham gia vào quá trình hình thành bệnh. Rất nhiều bệnh nhân bị tăng uric acid huyết nhƣng không phát triển thành bệnh gout. Thống kê cho thấy chỉ có 5% số bệnh nhân có lƣợng uric acid huyết thanh SUA lớn hơn 9 mg/dL tiến triển thành bệnh [15].
Cơ chế phân tử của bệnh Nhƣ đã nói ở trên, bệnh gout là trạng thái bệnh lý do các tinh thể MSU tích tụ tại hoạt dịch khớp, gây sƣng đỏ ở khớp và đau cho bệnh nhân. Quá trình sƣng đau này là đáp ứng lại sự hình thành của tinh thể MSU của các tế bào bạch cầu trong hoạt dịch khớp, gây nên trạng thái viêm, sƣng, đỏ, đau cho bệnh nhân. - Tế bào gây viêm Loại tế bào gây viêm đƣợc nghiên cứu chủ yếu trên đối tƣợng bệnh nhân Gout là các dòng tế bào bạch cầu, cụ thể là bạch cầu trung tính, đại thực bào. Các tinh thế MSU có thể kích thích bạch cầu trung tính sản sinh ra các enzyme từ lysosome và bào tƣơng để gây chết tế bào.
Các nghiên cứu in vitro cho thấy, tinh 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thể MSU có thể kích thích giải phóng enzyme ở lysosome bằng cách phá vỡ màng lysosome [18]. Bạch cầu trung tính không chỉ tấn công vị trí viêm bằng các yếu tố nhƣ cytokine, chemokine mà còn thông qua các yếu tố điều hòa quá trình viêm nhƣ IL-1β, IL-8, CXCL-1 và yếu tố kích thích ngƣng kết bạch cầu hạt [37]. - Chức năng của yếu tố gây viêm NLRP3 đối với bệnh Gout Martinon và cs đã chứng minh rằng yếu tố gây viêm NLRP3 có thể tham gia vào sự nhận biết tinh thế MSU và hoạt hóa các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh. Các thí nghiêm trên chuột đã cho thấy yếu tố gây viêm NLRP3 có thể có liên quan đến các cơn đau ở gout cấp tính.
Đối với các các tinh thể CPPD, yếu tố gây bệnh gout giả,cũng cho kết quả tƣơng tự. Mặc dù rất nhiều con đƣờng sinh học liên quan đến Gout đã đƣợc làm sáng tỏ, nhƣng cơ chế khiến tinh thể MSU có thể hoạt hóa yếu tố viêm NLRP3 vẫn chƣa đƣợc làm rõ và rất có thể, con đƣờng này còn đƣợc trung gian bởi nhiều loại protein [30]. Quá trình gây viêm bằng MSU cần thông qua NLRP3 imflammasome là một chuỗi các phản ứng. Đầu tiên, tinh thể MSU đƣợc các thụ thể đặc hiệu với nó phát hiện, ví dụ nhƣ họ thụ thể Toll-like (TLRs).
Khi đi vào trong tế bào, các tinh thể này sẽ kích thích yếu tố gây viêm NLRP3, đây là một phức hợp protein bao gồm domain cảm biến LRR ở đầu C, domain bám nucleotide ở giữa (NACHT), và PYD ở đầu N. Kết quả của phản ứng này là sự oligomer hóa NLRP3 và biến procaspase-1 thành caspase-1. Caspase-1, đến lƣợt mình biến đổi các proIL-1 thành IL-1β đƣợc hoạt hóa. Sau khi đƣợc giải phóng vào dịch khớp, IL-1β kích hoạt thụ thể IL-1 trên tế bào nội mô và thực bào, kích hoạt các con đƣờng tín hiệu, điều hòa biểu hiện gen và dẫn tới sự tiết ra các cytokine tiền viêm và chemokine.
Các chất này thu hút và kích hoạt bạch cầu tới khu vực khớp và dẫn tới sự viêm (Hình 1). - ROS và quá trình hoạt hóa NLRP3 inflammasome Trong nghiên cứu của Franz Bauernfeind và cs (2015) đã cho thấy, ROS cũng có thể ức chế bƣớc đầu của quá trình hoạt hóa NLRP3 inflammasome. Hiện tƣợng 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com này có thể là do bản thân NLRP3 là một phân tử rất nhạy với ROS, do đó, chỉ ở trong những giai đoạn nhất định, ROS mới cần thiết tham gia vào hoạt hóa còn ở những giai đoạn đầu, việc kích hoạt NLRP3 cần sự tƣơng tác chặt chẽ với các proinflammasome đặc hiệu mà cụ thể là LPS [8]. Tuy nhiên, sự giải phòng các ADN ti thể cũng đƣợc ghi nhận là yếu tố cản trở hoạt hóa NLRP3 [34].
Khả năng giải phóng ADN ty thể vào tế bào chất phụ thuộc vào sự hoạt động của NLRP3 inflammasome cũng nhƣ sự tƣơng tác của ROS ty thể, khi ra ngoài tế bào chất, ADN ty thể có thể gây ra sự tăng tiết IL-1β và IL-18 trong đáp ứng với LPS và ATP [32]. Hơn nữa, cardiolipin, một phân tử phospholipid nằm trên màng trong ti thể, có thể chuyển vị ra màng ngoài ti thể và liên kết với phân tử LRR của NLRP3. Phân tử này đóng vai trò nhƣ một vị trí cửa ngõ để tạo tín hiệu hoạt hóa [20]. Hình 1: Cơ chế gây viêm thông qua tinh thể MSU [14] 1.
Các hướng điều trị dựa trên cơ chế phân tử của bệnh Nhƣ đã đề cập ở trên, gout là tình trạng bệnh lý liên quan đến sự gia tăng lƣợng uric acid trong huyết thanh. Các cơn đau gout cấp thƣờng khởi đầu từ quá trình viêm do các tính thể uric acid. Do đó, thông thƣờng có 3 phƣơng pháp chính để 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com điều trị gout, một là giảm hiện tƣợng viêm trong cơn đau gout, hai là tăng khả năng bài tiết uric acid của thận, và cuối cùng là ức chế enzyme xanthine oxidase (XO) (Hình 2). - Các thuốc kháng viêm Do bản chất của những cơn đau do gout là sự tấn công của hệ thống miễn dịch, gây ra trạng thái viêm nên rất nhiều dòng thuốc kháng viêm đƣợc sử dụng trong điều trị gout.
Các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) ví dụ nhƣ indomethacin là một trong những dòng thuốc hiệu quả trong điều trị gout cấp tính. Các thuốc này có tác dụng làm giảm sự hình thành prostaglandin. Trong khi đó, colchicine cũng là loại thuốc thƣờng đƣợc sử dụng nhằm làm giảm sản xuất leukotriene B4 và giảm hình thành gốc tự do. NSAIDs và glucocorticoid đều có tác dụng làm giảm quá trình viêm ở hoạt dịch khớp do chúng phản ứng với tubulin và ức chế hình thành các sợi vi ống, trong khi đó, mặc dù cũng có tác dụng tƣơng tự nhƣng colchicine cũng đồng thời là một chất gây độc cho quá trình nguyên phân.
Về tác dụng phụ, NSAIDs có thể gây ra các thƣơng tổn cho thận, đặc biệt là indomethacin có thể phá hủy cấu trúc xƣơng. Đối với các glucocorticoid, trong liệu trình ngắn có thể gây mất cân bằng glucose trong máu. Riêng đối với colchicine, đây là một loại thuốc có nhiều tác dụng phụ nhất, đặc biệt là cho gan, thận, do đó, khi sử dụng cần rất chú ý về liều lƣợng sử dụng [6, 55]. - Các thuốc uricosuric – Thuốc lợi tiểu Thông thƣờng, 90% uric acid trong cơ thể sẽ đƣợc lọc ở thận và tái hấp thụ ở ống lƣợn gần.
Các thuốc thuộc dòng uricosuric (probenecid, sulfinpyrazone) là các axit yếu và cạnh tranh tái hấp thụ với uric acid ở ống lƣợn gần, nhờ đó, hỗ trợ bài tiết uric acid. So với các thuốc NSAIDs và colchicine, các thuốc lợi tiểu ít để lại tác dụng phụ cho cơ thể ngƣời bệnh hơn, nhƣng do chúng đều là các sulfonamide nên có thể gây ra trạng thái dị ứng thuốc [6, 55]. - Các chất ức chế Xanthine oxidase 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lƣợng uric acid trong có thể bị hạn chế thông qua việc ức chế enzyme xanthine oxidase, nhƣ đã đề cập ở trên, enzyme này sẽ chuyển hypoxanthine thành xanthine và cuối cùng thành uric acid. Bằng cơ chế này, các thuốc ức chế enzyme xanthine oxidase cũng đƣợc sử dụng trong điều trị gout.
Allopuriol sẽ bị chuyển hóa thành oxypurinol (alloxanthine) nhờ xanthine oxidase, sản phẩm của phản ứng này là một chất ức chế enzyme và khiến cho enzyme không thể phục hồi đƣợc. Bên cạnh đó, febuxostat cũng là một chất ức chế phi purine của xanthine oxidase và có tính chọn lọc cao hơn allopurinol và alloxanthine.