Nghiên cứu điều chế hydrogel gelatin ứng dụng trong dán và chữa lành vết thương

Hydrogel gelatin là một trong những vật liệu y sinh nổi bật, được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dán… 62 trang · Đại học Tôn Đức Thắng · 2015.

• Tác giả: Đặng Quang Dũng
• Người hướng dẫn: TS. Trần Ngọc Quyển
• Trường học: Đại học Tôn Đức Thắng
• Chuyên ngành: Khoa học ứng dụng
• Đề tài: Nghiên cứu điều chế in situ hydrogel trên cơ sở gelatin ứng dụng trong dán và chữa lành vết thương
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• MỤC LỤC
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH VẼ
• DANH MỤC BẢNG
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Giới thiệu về hydrogel
• 1.2. Tổng hợp hydrogel
• 1.3. Giới thiệu về gelatin
• 1.4. Định nghĩa và phân loại
• 1.5. Hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu
• 1.6. Phương pháp nghiên cứu
• 1.7. Tiến hành thí nghiệm
• 1.8. Tổng hợp gelatin tyramine
• 1.9. Tổng hợp gelatin 4-hydroxyphenylacetic acid
• 1.10. Xác định hàm lượng tyramine trong sản phẩm bằng phương pháp lập đường chuẩn để tính toán lượng H2O2 cần thiết cho quá trình tạo hydrogel
• 1.11. Khảo sát thời gian gel hóa
• 1.12. Khảo sát cường độ kết dính mô
• 1.13. Đánh giá khả năng kết dính mô và chữa lành vết thương của hydrogel trên vết thương thỏ
• 2. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 2.1. Kết quả tổng hợp GTA
• 2.2. Kết quả tổng hợp GHPA
• 2.3. Cơ chế phản ứng tổng hợp polymer
• 2.4. Tổng hợp hydrogel và đánh giá thời gian gel hóa từ GTA và GHPA
• 2.5. Đánh giá cường độ kết dính mô của hydrogel
• 2.6. Đánh giá khả năng chữa lành vết thương của hydrogel trên thỏ
• 3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu hydrogel gelatin trong chữa lành vết thương

Hydrogel gelatin là một trong những vật liệu y sinh nổi bật, được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dán và chữa lành vết thương. Với khả năng hấp thụ nước và tương hợp sinh học tốt, hydrogel gelatin không chỉ giúp bảo vệ vết thương mà còn thúc đẩy quá trình hồi phục mô. Nghiên cứu này tập trung vào việc điều chế hydrogel từ gelatin và ứng dụng của nó trong y học, đặc biệt là trong việc chữa lành vết thương.

1.1. Định nghĩa và tính chất của hydrogel gelatin

Hydrogel gelatin là một loại polymer có khả năng hấp thụ nước lớn, tạo thành mạng lưới 3 chiều. Tính chất này giúp hydrogel duy trì độ ẩm cho vết thương, từ đó thúc đẩy quá trình chữa lành. Ngoài ra, hydrogel còn có khả năng tương tác với các yếu tố sinh học, làm tăng hiệu quả điều trị.

1.2. Lịch sử và sự phát triển của hydrogel trong y học

Hydrogel đã được nghiên cứu từ những năm 1960 và ngày càng trở nên phổ biến trong y học. Sự phát triển của công nghệ chế tạo hydrogel đã mở ra nhiều ứng dụng mới, từ dán vết thương đến vận chuyển thuốc. Nghiên cứu hiện tại tập trung vào việc cải thiện tính chất và khả năng ứng dụng của hydrogel gelatin.

II. Vấn đề và thách thức trong việc sử dụng hydrogel gelatin

Mặc dù hydrogel gelatin có nhiều ưu điểm, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong việc ứng dụng thực tiễn. Các vấn đề như độ bền cơ học, khả năng kháng khuẩn và thời gian gel hóa cần được nghiên cứu và cải thiện. Việc tối ưu hóa các yếu tố này sẽ giúp nâng cao hiệu quả của hydrogel trong chữa lành vết thương.

2.1. Độ bền cơ học của hydrogel gelatin

Độ bền cơ học là một trong những yếu tố quan trọng quyết định khả năng ứng dụng của hydrogel gelatin. Nghiên cứu cho thấy, việc điều chỉnh nồng độ gelatin và các chất tạo liên kết ngang có thể cải thiện đáng kể độ bền của hydrogel.

2.2. Khả năng kháng khuẩn và an toàn sinh học

Khả năng kháng khuẩn của hydrogel gelatin là một yếu tố quan trọng trong việc ngăn ngừa nhiễm trùng vết thương. Nghiên cứu hiện tại đang tìm kiếm các phương pháp để tăng cường tính kháng khuẩn mà không làm giảm tính tương hợp sinh học của vật liệu.

III. Phương pháp nghiên cứu hydrogel gelatin hiệu quả

Để nghiên cứu hydrogel gelatin, nhiều phương pháp khác nhau đã được áp dụng. Các phương pháp này không chỉ giúp điều chế hydrogel mà còn đánh giá tính chất và khả năng ứng dụng của nó trong chữa lành vết thương. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp là rất quan trọng để đạt được kết quả tối ưu.

3.1. Phương pháp điều chế hydrogel gelatin

Phương pháp điều chế hydrogel gelatin thường bao gồm việc sử dụng các chất tạo liên kết ngang và điều chỉnh nồng độ gelatin. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc sử dụng enzyme hoặc bức xạ có thể tạo ra hydrogel với tính chất vượt trội.

3.2. Đánh giá tính chất của hydrogel sau khi điều chế

Sau khi điều chế, hydrogel gelatin cần được đánh giá về độ gel hóa, độ bền cơ học và khả năng hấp thụ nước. Các phương pháp như phân tích quang phổ và kiểm tra độ dính mô thường được sử dụng để đánh giá tính chất của hydrogel.

IV. Ứng dụng thực tiễn của hydrogel gelatin trong chữa lành vết thương

Hydrogel gelatin đã được ứng dụng rộng rãi trong việc chữa lành vết thương nhờ vào khả năng giữ ẩm và thúc đẩy tái tạo mô. Nghiên cứu cho thấy, hydrogel không chỉ giúp bảo vệ vết thương mà còn cải thiện quá trình hồi phục mô. Các ứng dụng này đang được mở rộng trong lĩnh vực y học.

4.1. Ứng dụng trong dán vết thương

Hydrogel gelatin được sử dụng làm băng dán vết thương nhờ vào khả năng giữ ẩm và tạo môi trường thuận lợi cho quá trình hồi phục. Nghiên cứu cho thấy, việc sử dụng hydrogel giúp giảm thiểu đau đớn và thời gian hồi phục cho bệnh nhân.

4.2. Ứng dụng trong tái tạo mô

Hydrogel gelatin còn được nghiên cứu như một vật liệu hỗ trợ trong tái tạo mô. Với khả năng tương hợp sinh học tốt, hydrogel có thể được sử dụng để tạo ra các cấu trúc mô mới, giúp cải thiện hiệu quả điều trị trong y học tái tạo.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của hydrogel gelatin

Hydrogel gelatin đang mở ra nhiều triển vọng trong lĩnh vực y học, đặc biệt là trong chữa lành vết thương. Nghiên cứu hiện tại đang tập trung vào việc cải thiện tính chất và khả năng ứng dụng của hydrogel. Với những tiến bộ trong công nghệ, hydrogel gelatin hứa hẹn sẽ trở thành một trong những vật liệu quan trọng trong y sinh trong tương lai.

5.1. Triển vọng nghiên cứu và phát triển

Nghiên cứu về hydrogel gelatin sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu cải thiện tính chất và khả năng ứng dụng. Các nghiên cứu mới sẽ tập trung vào việc phát triển các công thức hydrogel mới với tính năng vượt trội.

5.2. Ứng dụng trong các lĩnh vực khác

Ngoài y học, hydrogel gelatin còn có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như nông nghiệp và công nghệ thực phẩm. Việc nghiên cứu và phát triển hydrogel sẽ mở ra nhiều cơ hội mới cho các ứng dụng đa dạng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong kỹ thuật y sinh và phẫu thuật hiện đại, nhu cầu sử dụng các vật liệu đóng vết thương mô mềm có tính tương hợp sinh học cao, khả năng bám dính tốt và thúc đẩy tái tạo mô đang gia tăng nhanh chóng. Các phương pháp đóng vết thương truyền thống như dùng chỉ khâu hay kim bấm kim loại thường gây xâm lấn cơ học, tăng nguy cơ rò rỉ dịch/khí và để lại sẹo mô. Trong khi đó, các dòng keo dán tổng hợp thương mại (như dẫn xuất cyanoacrylate) tuy có độ bám dính cao nhưng lại tồn tại nhược điểm lớn về độc tính tế bào, gây phản ứng viêm cục bộ và không có khả năng tự phân hủy sinh học tương thích với tốc độ liền mô tự nhiên.

Hydrogel là hệ vật liệu polymer ưa nước có cấu trúc mạng lưới không gian ba chiều, sở hữu hàm lượng nước cao tương đương mô sống và có độ mềm dẻo đặc trưng. Xuất phát từ thực tiễn trên, khóa luận tốt nghiệp "Nghiên cứu điều chế in situ hydrogel trên cơ sở gelatin ứng dụng trong dán và chữa lành vết thương" của tác giả Đặng Quang Dũng (thực hiện tại Phòng Vật liệu Hóa dược – Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã tập trung phát triển hệ hydrogel có khả năng đông kết tại chỗ (in situ forming) dựa trên nền polymer tự nhiên gelatin.

Mục tiêu và các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể của đề tài bao gồm:

1. Tổng hợp thành công hai dẫn xuất polymer chức năng hóa từ gelatin: gelatin tyramine (GTA) và gelatin 4-hydroxyphenylacetic acid (GHPA) thông qua phản ứng ghép nối nhóm phenol bằng liên kết amide trong pha nước.
2. Xác định đặc trưng cấu trúc hóa học của các polymer GTA và GHPA bằng quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H NMR}$), đồng thời định lượng hàm lượng nhóm phenol (tyramine và HPA) gắn trên khung polypeptide bằng quang phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) ở bước sóng 270 nm.
3. Tổng hợp hydrogel tạo gel tại chỗ thông qua phản ứng oxy hóa ghép đôi nhân phenol dưới sự xúc tác của enzyme Horseradish Peroxidase (HRP) và chất oxy hóa hydrogen peroxide ($\text{H}_2\text{O}_2$).
4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ đến động học gel hóa (thời gian đông gel) và khảo sát cường độ kết dính mô trên mẫu da heo thực nghiệm bằng thiết bị đo kéo nén vạn năng Universal.
5. Đánh giá hiệu quả dán dính và khả năng chữa lành vết thương mô sống trên thỏ thực nghiệm tại các mốc thời gian 3 ngày và 14 ngày bằng kỹ thuật nhuộm hóa mô Hematoxylin & Eosin (H&E).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Gelatin (Sigma-Aldrich), Tyramine (Sigma-Aldrich), 4-hydroxyphenylacetic acid (Acros), tác nhân tạo liên kết amide 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC), enzyme Horseradish Peroxidase (HRP, Sigma-Aldrich), dung dịch hydrogen peroxide ($\text{H}_2\text{O}_2$), mẫu mô da heo và thỏ sống.
• Phạm vi nghiên cứu: Toàn bộ quy trình tổng hợp hóa học, kiểm tra hóa lý in vitro và thử nghiệm mô học in vivo trên động vật được thực hiện tại Phòng Vật liệu Hóa dược, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng (Quận 1, TP. Hồ Chí Minh), hoàn thành vào tháng 1 năm 2015.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng hệ thống cơ sở lý luận dựa trên các nguyên lý hóa lý polymer, hóa sinh protein và kỹ thuật vật liệu y sinh:

• Lý thuyết về cấu trúc và sự tạo gel của gelatin: Gelatin là protein không đồng nhất thu được từ quá trình thủy phân collagen trong da và xương động vật. Cấu trúc bậc 1 của gelatin gồm chuỗi polypeptide khoảng 1000 amino acid với trình tự lặp lại đặc trưng Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro, trong đó Glycine chiếm khoảng 21%, Proline chiếm 22%, Hydroxyproline chiếm 12% và thiếu vắng Tryptophan, Cysteine. Gelatin thương mại có độ Bloom từ 150 đến 300 Bloom, độ nhớt 2–7 cP và điểm đẳng điện ($\text{pI}$) biến thiên từ 4,8 đến 9,4 tùy thuộc vào phương pháp xử lý acid (Gelatin loại A) hay xử lý kiềm (Gelatin loại B).
• Cơ chế hoạt hóa và tạo liên kết amide bằng carbodiimide trong môi trường nước: EDC phản ứng với nhóm carboxyl để tạo thành chất trung gian carbocation và tiếp tục chuyển hóa thành dẫn xuất carboxylic anhydride trước khi bị nhóm amine tấn công ái nhân để hình thành liên kết amide bền vững $(-\text{CO}-\text{NH}-)$. Phản ứng diễn ra êm dịu ở nhiệt độ phòng, trong môi trường nước và $\text{pH}$ acid yếu ($\text{pH} = 6$), loại bỏ hoàn toàn việc sử dụng dung môi hữu cơ độc hại.
• Cơ chế tạo liên kết ngang bằng enzyme HRP/$\text{H}_2\text{O}_2$: Enzyme peroxidase xúc tác phản ứng oxy hóa các gốc phenol gắn trên mạch gelatin (nhóm tyramine hoặc HPA), tạo ra các gốc tự do phenoxy trung gian. Các gốc này nhanh chóng kết hợp với nhau thông qua liên kết cộng hóa trị $\text{C}-\text{C}$ (dạng ortho-ortho) và $\text{C}-\text{O}$ (dạng ortho-para), hình thành mạng lưới không gian ba chiều giữ nước mà không sinh nhiệt hay giải phóng sản phẩm phụ gây độc.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai theo các bước chuẩn hóa:

• Phương pháp tổng hợp và tinh chế: Hòa tan 2 g gelatin trong 30 mL nước cất ở 60 °C, hạ nhiệt độ về 40 °C rồi bổ sung 1 g tyramine (đối với GTA) hoặc 1 g HPA (đối với GHPA), chỉnh $\text{pH} = 6$. Tiếp tục thêm 250 mg EDC và khuấy từ liên tục trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp phản ứng được thẩm tách bằng màng Spectra/Por Cellulose Ester Membrane (ngưỡng cắt khối lượng phân tử MWCO 10.000–12.000 Da) trong môi trường nước suốt 3 ngày (thay nước 3–5 lần), sau đó tiến hành đông khô từ 1 đến 2 ngày để thu nhận polymer xốp khô.
• Phương pháp phổ quang học ($^1\text{H NMR}$ và UV-Vis): Cấu trúc phân tử được xác nhận bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^1\text{H NMR}$ với chất chuẩn nội Tetramethylsilane (TMS, 0 ppm). Hàm lượng nhóm phenol tiếp hợp được xác định bằng quang phổ UV-Vis ở bước sóng 270 nm thông qua phương pháp lập đường chuẩn nồng độ $A = f(C)$ theo định luật Lambert-Beer.
• Phương pháp đo động học gel hóa: Cố định nồng độ polymer ở mức 8% w/v và nồng độ HRP ở 0,1 mg/mL; khảo sát nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ biến thiên từ 0,01% đến 0,12% w/w. Thời gian gel hóa được ghi nhận bằng phương pháp úp ngược ống nghiệm (vial-tilting method) kể từ khi hòa trộn hai cấu phần dung dịch cho đến khi khối hydrogel ngừng chảy hoàn toàn.
• Phương pháp đo cường độ bám dính mô: Sử dụng thiết bị kéo nén vạn năng Universal (Hounsfield model H5KT, Tinius Olsen, Anh) trên mẫu da heo tươi đã bóc tách lớp mỡ dưới da. Hai lớp da ghép hydrogel được giữ tiếp xúc 60 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó kéo trượt với vận tốc 10 mm/phút dưới cảm biến tải 100 N để đo ứng suất tách rời cực đại.
• Phương pháp thử nghiệm in vivo và phân tích mô bệnh học: Tạo vết thương rạch da dài 2 cm trên lưng thỏ gây mê; tiêm hydrogel gelatin đã tiệt trùng bằng tia UV qua hệ thống xylanh đôi, so sánh đối chứng song song với keo dán cyanoacrylate và chỉ khâu phẫu thuật. Sau 3 và 14 ngày, mẫu mô tổn thương được thu hồi, cố định trong formalin, đúc khối parafin, cắt lát mỏng 4 µm ở -20 °C bằng máy cắt vi thể và nhuộm kép Hematoxylin – Eosin (H&E) để quan sát hình thái phục hồi biểu mô dưới kính hiển vi quang học.

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Chương này tổng thuật toàn diện cơ sở lý thuyết về vật liệu hydrogel và protein gelatin. Tác giả phân tích các phương pháp tạo liên kết ngang vật lý (làm lạnh/gia nhiệt, tương tác ion đa hóa trị, giọt tụ phức chất đa ion, liên kết hydro) và liên kết ngang hóa học (chất tạo liên kết ngang dialdehyde/carbodiimide, phương pháp ghép monomer, chiếu xạ UV/gamma). Ưu thế vượt trội của phương pháp khơi mào bằng enzyme HRP được nhấn mạnh nhờ tốc độ tạo gel nhanh, điều kiện phản ứng sinh lý êm dịu và loại trừ hoàn toàn độc tính tế bào. Về phần gelatin, chương nêu rõ thành phần 18 amino acid, chuỗi polypeptide lặp lại, các tính chất vật lý cốt lõi (độ nhớt, điểm đẳng điện $\text{pI}$, độ Bloom) và các ứng dụng trong thực phẩm, vỏ nang thuốc, dung dịch bù thể tích huyết tương (plasma expander chứa 3,5–5,5% gelatin) và bọt xốp cầm máu.

Hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu

Chương trình bày chi tiết thông số hóa chất nguyên liệu, hệ thống thiết bị phân tích (Universal Hounsfield H5KT, tủ đông khô, máy đo phổ UV-Vis, phổ NMR) và các quy trình tổng hợp:

• Quy trình tổng hợp GTA và GHPA: 2 g gelatin kết hợp với 1 g tyramine hoặc 1 g HPA, hoạt hóa bằng 250 mg EDC trong 30 mL nước ($\text{pH} = 6, 24\text{ giờ}$), tinh chế qua màng thẩm tách MWCO 10.000–12.000 Da trong 3 ngày và đông khô 1–2 ngày.
• Quy trình lập đường chuẩn UV-Vis tại 270 nm: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn nồng độ tyramine và HPA để dựng phương trình tương quan tuyến tính giữa mật độ quang $A$ và nồng độ chất $C$. Từ đó, tính toán số mol phenol gắn trên khung polymer và xác định lượng $\text{H}_2\text{O}_2$ tối ưu cần dùng (tương đương 60% số mol nhóm phenol).
• Quy trình thử nghiệm gel hóa, cơ lý và mô học: Trình bày chi tiết kỹ thuật đo thời gian tạo gel ở nồng độ polymer 8% w/v; phương pháp đo độ dính trượt trên da heo; quy trình gây mê, tạo vết thương 2 cm trên lưng thỏ và các bước xử lý mẫu mô học H&E (cắt lát 4 µm, nhúng hematoxylin 30 giây, eosin 1% từ 10–30 giây, khử nước qua ethanol 95%–100% trong 30 giây và làm trong bằng xylene).

Kết quả và bàn luận

Chương tập trung phân tích và chứng minh các kết quả thực nghiệm đạt được:

• Xác nhận cấu trúc bằng $^1\text{H NMR}$:
  • Phổ của GTA xuất hiện mũi đôi tại độ dịch chuyển hóa học 6,105 ppm ứng với proton nhân thơm $(\text{H}_a, \text{H}_b)$ và mũi đôi tại 2,883 ppm ứng với proton alkyl $(-\text{CH}_2-\text{CH}_2-)$ của tyramine, bên cạnh các pic amino acid của gelatin (Val 0,862 ppm; Ala 1,339 ppm; Arg 1,607 ppm; Lys 1,959 ppm; Glu 2,229 ppm; Asp 2,931 ppm; Phe 3,140 ppm; Gly 3,571 ppm; Ala 3,884 ppm; Hyp 4,274 ppm; Pro 4,687 ppm; vòng thơm 7,217 ppm).
  • Phổ của GHPA xuất hiện mũi đôi tại 6,107 ppm của nhân thơm và mũi đơn tại 2,657 ppm ứng với proton nhóm $-\text{CH}_2-$ của HPA, đi kèm đầy đủ các pic đặc trưng của chuỗi gelatin (Val 0,867 ppm; Lys 1,966 ppm; Glu 2,274 ppm; Asp 2,938 ppm; Phe 3,148 ppm; Gly 3,579 ppm; Pro 4,661 ppm; vòng thơm 7,228 ppm).
• Cơ chế phản ứng tạo liên kết amide trong pha nước: Giải thích chi tiết vai trò của EDC trong việc hoạt hóa carboxyl thành chất trung gian carbocation và anhydride carboxylic, tạo điều kiện cho amine tấn công tạo liên kết amide bền mà không cần xúc tác nhiệt hay dung môi hữu cơ.
• Khảo sát thời gian tạo gel: Đồ thị thực nghiệm chỉ ra mối quan hệ phi tuyến tính giữa nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ và thời gian gel hóa. Thời gian tạo gel giảm dần về giá trị cực tiểu khi nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ tăng tới ngưỡng tối ưu (khoảng 0,05%–0,1% w/w), nhưng sẽ tăng ngược trở lại khi nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ vượt quá mức tối ưu do hiện tượng thừa chất oxy hóa làm ức chế hoạt tính xúc tác của enzyme HRP. GHPA có tốc độ tạo gel nhanh hơn đáng kể so với GTA do hàm lượng nhóm HPA gắn kết trên gelatin cao hơn tyramine (0,155 mmol tyramine/1 mg GTA).
• Đánh giá kết dính mô và chữa lành vết thương trên thỏ: Hydrogel gelatin bám dính chắc chắn trên bề mặt mô ẩm, ngăn ngừa chảy máu. Kết quả quan sát sau 3 ngày và phân tích lát cắt vi thể nhuộm H&E sau 14 ngày cho thấy: mẫu xử lý bằng hydrogel gelatin có biểu mô tái tạo liên tục, hình thành tổ chức mô hạt lành tính, không gây phản ứng viêm hay hoại tử mô như keo dán tổng hợp cyanoacrylate và không để lại vết sẹo co kéo như phương pháp khâu chỉ truyền thống.

Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các thông số tối ưu trong điều chế hydrogel GTA/GHPA; khẳng định tiềm năng ứng dụng thực tiễn của hệ keo dán sinh học in situ trong y học phục hồi. Kiến nghị tiếp tục mở rộng đánh giá khả năng nạp và giải phóng thuốc kháng sinh/kháng viêm cục bộ từ mạng hydrogel trên các mô hình tổn thương mô phức tạp.

---

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã tổng hợp và lượng hóa chi tiết các thông số kỹ thuật của hệ hydrogel gelatin chức năng hóa:

Thông số / Đặc tính	Gelatin Tyramine (GTA)	Gelatin 4-hydroxyphenylacetic acid (GHPA)
Phản ứng ghép nối	Amine của Tyramine + Carboxyl của Gelatin	Carboxyl của HPA + Amine của Gelatin
Pic $^1\text{H NMR}$ nhân thơm	Mũi đôi tại $\delta = 6,105\text{ ppm}$	Mũi đôi tại $\delta = 6,107\text{ ppm}$
Pic $^1\text{H NMR}$ mạch nhánh	Mũi đôi tại $\delta = 2,883\text{ ppm}$ $(-\text{CH}_2-\text{CH}_2-)$	Mũi đơn tại $\delta = 2,657\text{ ppm}$ $(-\text{CH}_2-)$
Hàm lượng nhóm phenol tiếp hợp	0,155 mmol tyramine/1 mg mẫu GTA	Hàm lượng mmol HPA cao hơn GTA
Tỷ lệ mol $\text{H}_2\text{O}_2$ tối ưu tạo gel	60% tổng số mol phenol trong dung dịch	60% tổng số mol phenol trong dung dịch
Điểm cực tiểu thời gian gel hóa	Đạt được tại nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2 \approx 0,08% - 0,10%$	Đạt được tại nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2 \approx 0,08% - 0,10%$
Tốc độ tạo gel tương đối	Chậm hơn GHPA	Nhanh hơn GTA (do mật độ phenol cao hơn)
Khả năng tương thích mô sống (14 ngày)	Tái tạo biểu bì hoàn chỉnh, không gây viêm	Tái tạo biểu bì hoàn chỉnh, không gây viêm

Các kết quả và đóng góp chính của đề tài bao gồm:

1. Quy trình tổng hợp thân thiện với môi trường: Thiết lập thành công quy trình chức năng hóa gelatin bằng tyramine và HPA hoàn toàn trong môi trường nước có kiểm soát $\text{pH} = 6$, sử dụng EDC làm chất hoạt hóa, loại bỏ triệt để nguy cơ tồn dư dung môi hữu cơ độc hại trong vật liệu cấy ghép y sinh.
2. Khảo sát định lượng động học gel hóa enzyme: Làm sáng tỏ cơ chế ảnh hưởng của nồng độ chất oxy hóa $\text{H}_2\text{O}_2$ đến hoạt tính enzyme HRP trong phản ứng tạo gel in situ, xác định chính xác tỷ lệ mol $\text{H}_2\text{O}_2$ tối ưu (60% mol nhóm phenol) để đạt thời gian đông gel nhanh nhất mà không gây bất hoạt enzyme.
3. Chứng minh hiệu quả chữa lành vết thương in vivo: Cung cấp dữ liệu mô bệnh học H&E thực nghiệm trên thỏ sau 14 ngày, chứng minh hydrogel gelatin vượt trội hơn keo cyanoacrylate ở tính tương hợp sinh học (không gây độc mô, không hoại tử) và vượt trội hơn chỉ khâu ở khả năng làm kín mép vết thương đồng đều, hỗ trợ biểu mô hóa tự nhiên.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu theo phạm vi đề tài:

• Thử nghiệm in vivo mới được tiến hành trên mô hình vết thương rạch da ngoài thân thỏ với cỡ mẫu nhỏ (3 cá thể thực nghiệm), chưa thực hiện trên các vết thương nội tạng hoặc vết thương mất da diện rộng.
• Nghiên cứu chưa định lượng chi tiết tốc độ suy giảm cơ tính và thời gian tự tiêu (biodegradation rate) của khối hydrogel in vivo theo nhiều mốc thời gian dài hạn hơn (> 14 ngày).
• Chưa tiến hành thử nghiệm tải và đánh giá động học giải phóng các hoạt chất hóa dược (như kháng sinh, thuốc giảm đau hoặc yếu tố tăng trưởng) tích hợp trong mạng hydrogel.

Hướng nghiên cứu tiếp được tác giả đề xuất:

• Khảo sát mở rộng khả năng mang và phóng thích thuốc kiểm soát của hydrogel GTA/GHPA nhằm kết hợp đồng thời khả năng dán dính vết thương và điều trị chống nhiễm khuẩn tại chỗ.
• Tiếp tục đánh giá độc tính tế bào in vitro chuyên sâu trên các dòng tế bào nguyên bào sợi và tế bào nội mô.
• Tối ưu hóa độ bền cơ học và tính linh hoạt của hydrogel khi ứng dụng dán nối trên các mô cơ quan có áp lực cao như mạch máu, phổi hoặc đường tiêu hóa.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên môn hữu ích cho:

• Đối tượng bạn đọc: Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các chuyên ngành Khoa học Vật liệu, Kỹ thuật Hóa học, Công nghệ Sinh học, Hóa dược và Kỹ thuật Y sinh (Biomedical Engineering).
• Phần nội dung đáng tham khảo:
  • Quy trình chi tiết tổng hợp và tinh chế dẫn xuất gelatin gắn nhóm phenol bằng kỹ thuật thẩm tách và đông khô.
  • Phương pháp phân tích, gán pic phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^1\text{H NMR}$ cho các cấu trúc biopolymer biến tính phức tạp.
  • Kỹ thuật xây dựng đường chuẩn UV-Vis ở bước sóng 270 nm để định lượng nhóm phenol và phương pháp tính toán tỷ lệ tác nhân oxy hóa cho phản ứng enzyme.
  • Quy trình thực nghiệm in vivo tạo vết thương trên động vật và kỹ thuật nhuộm mô học H&E (cắt lát 4 µm) đánh giá quá trình tái tạo biểu mô.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tác nhân nào được sử dụng để gắn kết tyramine và HPA vào chuỗi gelatin, và phản ứng diễn ra trong điều kiện dung môi nào?
Tác nhân được sử dụng là carbodiimide (EDC, khối lượng 250 mg cho 2 g gelatin). Phản ứng ghép nối amide được tiến hành hoàn toàn trong môi trường nước cất ở nhiệt độ phòng, duy trì $\text{pH} = 6$ trong thời gian 24 giờ, không sử dụng bất kỳ dung môi hữu cơ nào.

2. Tín hiệu phổ $^1\text{H NMR}$ đặc trưng nào chứng minh tyramine và HPA đã tiếp hợp thành công vào gelatin?
Đối với GTA, xuất hiện mũi đôi tại 6,105 ppm (proton nhân thơm) và mũi đôi tại 2,883 ppm (proton nhóm $-\text{CH}_2-\text{CH}_2-$ của tyramine). Đối với GHPA, xuất hiện mũi đôi tại 6,107 ppm (proton nhân thơm) và mũi đơn tại 2,657 ppm (proton nhóm $-\text{CH}_2-$ của HPA).

3. Vì sao nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ quá thấp hoặc quá cao đều làm kéo dài thời gian gel hóa của hydrogel?
Khi nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ quá thấp, lượng chất oxy hóa không đủ để tạo ra lượng gốc tự do phenoxy cần thiết cho phản ứng ghép đôi phenol, khiến mạng lưới liên kết ngang hình thành chậm. Ngược lại, khi nồng độ $\text{H}_2\text{O}_2$ quá cao vượt ngưỡng tối ưu, sự oxy hóa dư thừa sẽ làm bất hoạt và ức chế enzyme HRP, dẫn đến tốc độ phản ứng tạo gel bị suy giảm.

4. Số mol $\text{H}_2\text{O}_2$ cần thiết để tạo hydrogel tối ưu được xác định bằng bao nhiêu so với hàm lượng phenol?
Dựa trên phép định lượng quang phổ UV-Vis ở 270 nm, lượng $\text{H}_2\text{O}_2$ cần thiết để tạo hydrogel tối ưu được xác định chiếm đúng 60% tổng số mol nhóm phenol (tyramine hoặc HPA) hiện diện trong dung dịch polymer.

5. Kết quả phân tích mô học H&E sau 14 ngày trên vết thương thỏ cho thấy sự khác biệt gì giữa hydrogel gelatin so với keo cyanoacrylate và chỉ khâu?
Vết thương được xử lý bằng hydrogel gelatin đạt khả năng biểu mô hóa hoàn chỉnh, mô hạt phát triển đồng đều và không gây phản ứng viêm/hoại tử mô như keo tổng hợp cyanoacrylate, đồng thời không để lại sẹo co kéo hay tổn thương mô xung quanh như phương pháp khâu vết thương bằng chỉ.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Đặng Quang Dũng đã hoàn thành trọn vẹn quy trình điều chế và đánh giá hệ hydrogel tạo gel tại chỗ trên cơ sở gelatin tyramine (GTA) và gelatin 4-hydroxyphenylacetic acid (GHPA) xúc tác bởi hệ enzyme HRP/$\text{H}_2\text{O}_2$. Các đặc trưng cấu trúc hóa học, động học gel hóa và cường độ kết dính mô da heo đã được xác lập định lượng rõ ràng qua phổ $^1\text{H NMR}$, phổ UV-Vis và thiết bị kéo nén Universal. Kết quả thử nghiệm in vivo và mô bệnh học H&E sau 14 ngày trên thỏ khẳng định vật liệu hydrogel gelatin có tính tương hợp sinh học cao, dán dính mép vết thương tốt và thúc đẩy tái tạo mô hiệu quả, mở ra triển vọng ứng dụng khả thi trong lĩnh vực keo dán sinh học và kỹ thuật y sinh phục hồi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trong những thập kỉ gần đây, nhiều ngành khoa học – kĩ thuật đã có những bước phát triển vượt bậc, khoa học vật liệu cũng không phải là ngoại lệ. Vật liệu y sinh cũng đang từng bước phát triển với sự kết hợp của những phát triển đi trước như các định luật vật lý, hóa học, sinh học nhằm nâng cao chất lượng và đáp ứng nhu cầu, cũng như mở rộng hơn với mục đích hướng đến sức khỏe con người. Hydrogel được nhắc đến như 1 vật liệu mang những đặc tính vượt trội được áp dụng cho các ngành dược phẩm và y học với những ứng dụng trong kỹ thuật mô, vận chuyển thuốc, băng bó và chữa lành vết thương. Trong bài này, hydrogel dựa trên nền gelatin được gắn với tyramine và 4-hydroxyphenylacetic acid bằng phương pháp điều chế đơn giản không sử dụng dung môi hữu cơ.

Vật liệu hydrogel này được kỳ vọng sẽ mang lại những hiệu quả trong lĩnh vực vật liệu y sinh như mang nhả thuốc và khả năng chữa lành vết thương trong tái tạo mô. Tổng quan về hydrogel 1. Định nghĩa Hydrogel là 1 loại polymer có chứa các liên kết ngang. Do đặc tính hút nước tự nhiên, hydrogel có thể hấp thu 1 lượng nước lớn hơn rất nhiều lần so với khối lượng.

Những vật liệu này mang lại tính ổn định vật lý, hóa học và cơ học khá cao khi đang tồn tại ở trạng thái trương nở [3]. Ngoài ra, hydrogel còn được coi là 1 dạng của vật liệu thông minh, nó có thể thay đổi cấu trúc khi thay đổi các thông số như nồng độ muối, pH và nhiệt độ. Cấu tạo Hydrogel là một loại vật liệu ưa nước có cấu trúc cao phân tử, có mạng lưới 3 chiều và khả năng hấp thu nước đến khi đạt cấu trúc ổn định. Hydrogel có tính trương nở đẳng hướng và có thể được điều chế từ polymer tự nhiên hay polymer tổng hợp có khả năng tan trong nước.

Vì tính chất cơ học và tính chất hóa lý của hydrogel có thể rất tương đồng với mô sinh học nên hydrogel được xem như là 1 loại vật liệu sinh học, ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y sinh. Hydrogel gồm nhiều nhóm ưa nước như nhóm amino, carboxyl và hydroxyl … nên các nhóm này mang lại khả năng hấp thu nước của hydrogel. Trạng thái cơ bản của hydrogel là sự dãn nở thể tích để đáp ứng lại các liên kết hydro với nước và sự solvat hóa của các nhóm ưa nước. Vì thế hydrogel có thể giữ lại hình dáng và tránh được sự solvat nhờ vào các thành phần đã tạo liên kết ngang.

Các thành phần này được tạo thành nhờ vào tương tác tĩnh điện, tương tác Van der Waals và tương tác kị nước. Hydrogel poly(natri propenoate) và phân tử nước liên kết nhau bằng liên kết hydro 1. Đặc tính Khả năng chứa nước và tính thấm là hai đặc tính quan trọng nhất của hydrogel. Mạng lưới polymer có xu hướng hấp thu thêm nước do lực thẩm thấu.

Điều này làm hydrogel trương nở thêm và bị chống lại bởi các liên kết ngang vật lý, dẫn đến hydrogel có thể bị co rút. Vì vậy, hydrogel sẽ đạt tới trạng thái trương nở cân bằng. Sau khi đã trương nở, tùy thuộc vào bản chất và thành phần của hydrogel, nó sẽ hướng đến sự phân hủy hoặc tan rã nếu mạng lưới polymer hoặc các liên kết ngang có khả năng đó. Hydrogel phân hủy sinh học là hydrogel có chứa các liên kết không bền, có khả năng bị phân hủy, do ưu điểm này mà hydrogel phân hủy sinh học được ứng dụng trong công nghệ mô, chữa lành vết thương và vận chuyển thuốc.

Các liên kết không bền này có thể bị phá hủy trong điều kiện sinh lý, có hoặc không có hiện diện của enzyme hay các tác nhân phân hủy hóa học nhưng nhìn chung là do sự thủy phân. [4] Tương hợp sinh học là đặc tính quan trọng tiếp theo của hydrogel. Tương hợp sinh học là tương hợp với hệ miễn dịch của cơ thể, ngoài ra các sản phẩm sau khi hydrogel 4 phân hủy không được chứa độc tính. Trong các trường hợp lý tưởng, các sản phẩm này sẽ vô hại sau khi trao đổi chất với cơ thể hoặc có thể được bài tiết thông qua các quá trình lọc bằng thận.

Nói chung, hydrogel sở hữu sự tương hợp sinh học tốt vì bề mặt thấm ướt có năng lượng tự do thấp khi tương tác với dịch cơ thể. Hơn nữa, bản chất mềm và dẻo của hydrogel giảm tối đa sự kích thích với mô xung quanh. [4] Các liên kết ngang giữa các chuỗi polymer khác nhau đưa đến đặc tính đàn nhớt và đôi khi là đặc tính đàn hồi thuần túy. Hydrogel sỡ hữu một mức độ linh hoạt tương tự như mô tự nhiên do khả năng chứa nước rất đáng kể.

Ngoài ra, tính chất hóa học của hydrogel vẫn có thể thay đổi bằng cách điều chỉnh mức độ phân cực, tính chất bề mặt, tính chất cơ học và trạng thái trương nở. [4] Hydrogel gọi là hydrogel lý tưởng khi mang các tính chất như khả năng hấp thu cực đại, giá thành thấp, ít tan, ít sản phẩm phụ, bền và ổn định trong môi trường trương nở và suốt thời gian bảo quản, pH trung tính sau khi trương nở trong nước, mức đô phân hủy sinh học cao mà không tạo ra bất kỳ sản phẩm nào có hại khi phân hủy, không màu, không mùi, bền ánh sáng và tuyệt đối không độc hại. [5] Hydrogel không thể nào có được toàn bộ những ưu điểm trên. Thực tế, khi thành phần tổng hợp để đạt được tối đa ưu điểm này thì lại dẫn đến làm giảm hiệu quả của các ưu điểm khác.

Vì vậy trong thực nghiệm, các thông số đặc điểm cần được tối ưu hóa để thu được kết quả cân bằng giữa các đặc điểm cho từng mục đích sử dụng xác định. Ví dụ như hydrogel sử dụng trong vận chuyển thuốc phải có nhiều lỗ xốp trong cấu trúc, nhạy cảm với cả pH và nhiệt độ. Tổng hợp hydrogel Nhìn chung, để tổng hợp nên 1 hydrogel bao gồm 3 phần: monomer, chất khơi mào và chất tạo liên kết ngang. Để điều chỉnh sự tỏa nhiệt của quá trình trùng hợp và tính chất cuối cùng của hydrogel, người ta sử dụng chất pha loãng như nước hoặc các dung dịch khác.

Sau khi tổng hợp, khối hydrogel cần được làm sạch tạp chất trong quá trình 5 tổng hợp như các monomer dư chưa phản ứng, chất khơi màu, chất tạo liên kết ngang và cả các sản phẩm sinh ra từ phản ứng phụ. [6] Tính chất của hydrogel có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi các yếu tố tổng hợp như thiết bị phản ứng, thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng, loại monomer, loại chất tạo liên kết ngang, tỉ lệ chất tạo liên kết ngang: monomer, nồng độ monomer và nồng độ chất khơi mào. Quá trình tổng hợp hydrogel [6] Hydrogel được chia thành 2 loại chủ yếu: hydrogel hình thành từ liên kết ngang vật lý và liên kết ngang hóa học. Nhiều phương pháp tạo liên kết ngang khác nhau sẽ dẫn đến sự khác nhau về tính chất của hydrogel.

Phương pháp vật lý Liên kết ngang vật lý trong chuỗi polymer có thể hình thành nhờ các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, lực ion. Ưu điểm của phương pháp là không sử dụng các tác nhân tạo liên kết ngang hóa học, điều này hạn chế độc tính của hydrogel nếu được dùng trong dược phẩm hay vật liệu y sinh. 6 - Tạo liên kết ngang vật lý bằng cách gia nhiệt hoặc làm lạnh dung dịch polymer: [4] Hydrogel với liên kết ngang vật lý được hình thành khi làm lạnh dung dịch nóng của gelatin hay carrageenan. Sự hình thành gel xảy ra do bởi sự hình thành các chuỗi xoắn ốc hay sự liên hợp giữa các chuỗi xoắn ốc.

Sự hình thành hydrogel do sự kết tụ các chuỗi xoắn ốc khi làm lạnh dung dịch carrageenan nóng Carrageenan trong dung dịch có nhiệt độ lớn hơn nhiệt độ nóng chảy sẽ tồn tại ở dạng cuộn ngẫu nhiên. Khi có mặt của muối (K+, Na+ …), các ion này làm xuất hiện màn chắn lực đẩy của nhóm sulphonic (SO3–), các chuỗi xoắn ốc này sẽ kết tụ lại tạo gel bền. Trong một số trường hợp, hydrogel có thể thu được bằng cách đơn giản hơn là làm ấm dung dịch polymer như polyethylene oxide-polypropylene oxide hydrogel và polyethylene glycol-polylactic acid hydrogel. - Tạo liên kết ngang vật lý bằng tương tác ion: [4] Dung dịch polymer có thể tạo liên kết ngang bằng cách thêm vào các ion đối hóa trị hai hoặc ba.

Phương pháp này làm cơ sở cho lý thuyết gel hóa dung dịch của chất đa điện phân (như Na+ alginate-) với ion đa hóa trị có điện tích đối nghịch (như Ca2+ và 2Cl-). Một số ví dụ khác như chitosan-polylysine hydrogel, chitosan-glycerol phosphate hydrogel và chitosan-dextran hydrogel. Sự hình thành hydrogel thông qua tương tác ion giữa ion âm trên alginate (COO-) và ion kim loại hóa trị hai (Ca2+). Ngoài ra theo phương pháp này, sự phân hủy sinh học hydrogel có thể xảy ra như sự phân ly ion trong ngoại bào, phá vỡ mạng lưới liên kết ngang.

- Tạo liên kết ngang vật lý bằng giọt tụ phức chất [4] Phương pháp giọt tụ phức chất hình thành nên hydrogel khi có sự kết hợp giữa polymer đa ion âm và polymer đa ion dương. Cơ sở của phương pháp này là những polymer với điện tích trái dấu sẽ có xu hướng dính vào nhau, tạo nên phức tan hoặc không tan phụ thuộc nào nồng độ hay pH của dung dịch. Ví dụ cho trường hợp này là sự giọt tụ giữa xanthan như một polymer đa ion âm và chitosan như một polymer đa ion dương. Những protein có điểm đẳng điện thấp thường tích điện dương và có thể liên hợp với những chất keo ưa nước tích điện âm, tạo nên phức hydrogel đa ion.

Sự giọt tụ giữa polymer đa ion âm và polymer đa ion dương tạo phức hydrogel 8 - Tạo liên kết ngang vật lý bằng liên kết hydro [4] Sự hình thành hydrogel bằng liên kết hydro có thể thu được bằng các hạ thấp pH của dung dịch polymer có chứa nhóm carboxyl. Ví dụ như CMC hydrogel (carboxymethyl cellulose) thu được bằng cách phân tán CMC vào dung dịch HCl 0. Cơ chế được mô tả khi đưa CMC vào dung dịch, natri trong CMC được thay thế bằng hydro trong dung dịch acid để xúc tiến hình thành liên kết hydro. Liên kết hydro hình thành càng nhiều trong dung dịch dẫn đến sự giảm độ tan của CMC trong nước.

Từ đó, CMC hydrogel mang đặc tính dẻo được hình thành.