Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi aspergillus oryzae

Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae trong luận văn thạc sĩ HUS.

• Tác giả: Nguyễn Thị Khuyến
• Người hướng dẫn: TS. Trần Văn Tuấn
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỤC LỤC
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM SỢI Aspergillus oryzae
• 1.1. Đặc điểm sinh học của nấm sợi Aspergillus oryzae
• 1.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A.
• 1.3. Vai trò của nấm sợi A.
• 1.4. Phân biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin
• 2. Các phương pháp chuyển gen vào nấm sợi
• 2.1. Phương pháp chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast)
• 2.2. Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện (electroporation)
• 2.3. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A.
• 2.4. Marker sử dụng trong chọn lọc các chủng chuyển gen
• 2.5. Một số gen chỉ thị dùng trong chuyển gen ở vi nấm
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Chủng vi sinh vật
• 3.2. Thiết bị và hóa chất
• 3.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Thu nhận bào tử nấm
• 3.4.2. Tách chiết DNA, RNA và tổng hợp cDNA
• 3.4.3. Quan sát hình thái và kiểm tra một số đặc điểm sinh lý sinh hóa
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Phân biệt các chủng A. oryzae an toàn và chủng Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin
• 4.2. Lựa chọn chủng A. oryzae phục vụ cho chuyển gen
• 4.3. Lựa chọn marker chuyển gen vào A.
• 4.4. Xây dựng hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A.
• 4.5. Xóa gen pyrG để tạo chủng đột biến trợ dưỡng uridine/uracil
• 4.6. Tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gen vào A. oryzae trợ dưỡng uridine/uracil
• 4.7. Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen với gen huỳnh quang GFP và DsRed
• 4.8. Chuyển gen GFP và DsRed vào nấm sợi A. oryzae trợ dưỡng uridine/uracil
• 4.9. Xác nhận các thể chuyển gen
• 4.10. Ứng dụng hệ thống chuyển gen mới thiết lập để biểu hiện gen phyA mã hóa enzyme phytase từ nấm sợi Aspergillus fumigatus
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về hệ thống chuyển gen Agrobacterium tumefaciens cho Aspergillus oryzae

Hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho Aspergillus oryzae đã trở thành một trong những phương pháp tiên tiến trong nghiên cứu di truyền. Aspergillus oryzae là một loài nấm sợi quan trọng trong sản xuất thực phẩm và enzyme. Việc phát triển hệ thống chuyển gen này không chỉ giúp cải thiện khả năng sản xuất enzyme mà còn mở ra cơ hội cho việc nghiên cứu các gen mới. Hệ thống này sử dụng Agrobacterium tumefaciens như một vector để chuyển gen vào tế bào nấm, giúp đơn giản hóa quy trình và giảm chi phí so với các phương pháp truyền thống.

1.1. Đặc điểm sinh học của nấm Aspergillus oryzae

Nấm Aspergillus oryzae thuộc phân nhóm Flavi, có khả năng sinh trưởng nhanh và tiết ra nhiều enzyme có giá trị. Loài nấm này được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm truyền thống như tương và rượu. Đặc điểm sinh học của nó cho phép phát triển trong nhiều điều kiện khác nhau, từ đó tạo ra các sản phẩm enzyme chất lượng cao.

1.2. Vai trò của Agrobacterium tumefaciens trong chuyển gen

Agrobacterium tumefaciens là một vi khuẩn có khả năng chuyển gen tự nhiên vào thực vật. Việc sử dụng vi khuẩn này trong chuyển gen cho Aspergillus oryzae giúp tăng cường hiệu quả và độ chính xác của quá trình chuyển gen, đồng thời giảm thiểu các vấn đề liên quan đến kháng sinh.

II. Thách thức trong nghiên cứu chuyển gen cho Aspergillus oryzae

Mặc dù hệ thống chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens có nhiều ưu điểm, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong việc áp dụng cho Aspergillus oryzae. Một trong những vấn đề lớn nhất là khả năng kháng lại các hợp chất kháng sinh thường được sử dụng trong quá trình chuyển gen. Điều này đòi hỏi phải phát triển các chủng nấm mới có khả năng hỗ trợ cho quá trình chuyển gen.

2.1. Khó khăn trong việc chọn lọc chủng nấm

Việc chọn lọc các chủng Aspergillus oryzae an toàn và hiệu quả cho quá trình chuyển gen là một thách thức lớn. Các chủng này cần phải có khả năng kháng lại các hợp chất kháng sinh mà không làm giảm hiệu suất sản xuất enzyme.

2.2. Vấn đề về chi phí và quy trình

Quy trình chuyển gen hiện tại vẫn còn phức tạp và tốn kém. Việc phát triển một quy trình đơn giản và tiết kiệm chi phí là cần thiết để áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu và sản xuất.

III. Phương pháp chuyển gen hiệu quả cho Aspergillus oryzae

Để phát triển hệ thống chuyển gen hiệu quả cho Aspergillus oryzae, một số phương pháp đã được nghiên cứu và áp dụng. Phương pháp sử dụng Agrobacterium tumefaciens là một trong những lựa chọn hàng đầu nhờ vào tính hiệu quả và độ chính xác cao trong việc chuyển gen.

3.1. Phương pháp chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium

Phương pháp này sử dụng Agrobacterium tumefaciens để chuyển gen vào tế bào nấm. Quá trình này diễn ra thông qua việc vi khuẩn xâm nhập vào tế bào nấm và chuyển gen vào hệ gen của nó, giúp tạo ra các chủng nấm biến đổi gen.

3.2. Tạo vector nhị thể cho chuyển gen

Việc tạo ra các vector nhị thể là một bước quan trọng trong quá trình chuyển gen. Các vector này giúp mang gen cần chuyển vào tế bào nấm một cách hiệu quả, đồng thời cho phép theo dõi sự biểu hiện của gen sau khi chuyển vào.

IV. Ứng dụng thực tiễn của hệ thống chuyển gen cho Aspergillus oryzae

Hệ thống chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens cho Aspergillus oryzae không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn trong sản xuất thực phẩm và enzyme. Việc ứng dụng thành công hệ thống này có thể giúp cải thiện năng suất và chất lượng sản phẩm, đồng thời mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm mới.

4.1. Sản xuất enzyme và protein tái tổ hợp

Hệ thống chuyển gen này cho phép sản xuất các enzyme và protein tái tổ hợp với hiệu suất cao. Điều này có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm và công nghiệp sinh học.

4.2. Nghiên cứu chức năng gen mới

Hệ thống chuyển gen cũng hỗ trợ trong việc nghiên cứu chức năng của các gen mới, từ đó giúp hiểu rõ hơn về cơ chế sinh học và ứng dụng trong cải biến di truyền.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu chuyển gen

Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens cho Aspergillus oryzae đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực di truyền học và công nghệ sinh học. Với những tiến bộ trong công nghệ, việc ứng dụng hệ thống này trong sản xuất và nghiên cứu sẽ ngày càng trở nên phổ biến.

5.1. Triển vọng trong nghiên cứu di truyền

Hệ thống chuyển gen này có thể được mở rộng để nghiên cứu các loài nấm khác, từ đó giúp phát triển các sản phẩm mới và cải thiện quy trình sản xuất.

5.2. Tương lai của công nghệ sinh học

Công nghệ sinh học sẽ tiếp tục phát triển, và hệ thống chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc cải tiến các sản phẩm sinh học và thực phẩm an toàn cho con người.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nấm sợi Aspergillus oryzae sở hữu hệ gen hoàn chỉnh gồm 8 nhiễm sắc thể với kích thước khoảng 37 Mb và chứa 12.074 gen mã hóa protein, lớn hơn 25% đến 30% so với các loài nấm sợi mô hình khác như Aspergillus nidulans hay Aspergillus fumigatus. Trải qua hơn 2.000 năm lịch sử thuần hóa và ứng dụng trong công nghiệp lên men thực phẩm truyền thống tại châu Á, loài vi nấm này đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ chứng nhận an toàn ở mức GRAS. Nhờ năng lực bài tiết vượt trội các loại enzyme ngoại bào vào môi trường, A. oryzae trở thành nhà máy tế bào lý tưởng để sản xuất thương mại protein tự nhiên và tái tổ hợp. Tuy nhiên, việc cải biến di truyền trên đối tượng này gặp rào cản nghiêm trọng: nấm có khả năng kháng tự nhiên với hầu hết các kháng sinh chọn lọc phổ biến, trong khi phương pháp chuyển gen truyền thống qua tế bào trần lại cực kỳ phức tạp, chi phí đắt đỏ và tỷ lệ sống sót chỉ dao động từ 1% đến 50%.

Được thực hiện tại Phòng Genomic trực thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội vào năm 2016, luận văn tập trung phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (ATMT) cho nấm sợi A. oryzae. Nghiên cứu đặt ra các mục tiêu cụ thể gồm: xác nhận các chủng A. oryzae an toàn không sinh độc tố aflatoxin; tạo chủng đột biến trợ dưỡng uridine/uracil bằng cách xóa gen pyrG; thiết kế hệ thống vector nhị thể chuyên dụng; đánh giá hiệu quả chuyển gen thông qua các gen chỉ thị huỳnh quang GFP, DsRed; và bước đầu ứng dụng biểu hiện gen phyA mã hóa enzyme phytase từ A. fumigatus. Kết quả nghiên cứu nâng hiệu quả thao tác di truyền và tái tổ hợp tương đồng lên trên 75%, giải quyết triệt để nút thắt kỹ thuật và tạo tiền đề vững chắc cho việc sản xuất enzyme tái tổ hợp quy mô công nghiệp tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên hai trụ cột lý thuyết cốt lõi trong di truyền học vi sinh vật:

Thứ nhất, lý thuyết chuyển gen trung gian qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Vi khuẩn đất Gram âm này có khả năng chuyển giao đoạn T-DNA nằm giữa hai biên giới hạn 25 bp trên Ti-plasmid vào nhân tế bào chủ dưới sự điều khiển của hệ thống gen vir. Hoạt động của cụm gen này được kích hoạt tối ưu bởi hợp chất phenolic acetosyringone ở nồng độ 200 µM. Khi ứng dụng trên nấm sợi, T-DNA có xu hướng tích hợp vào hệ gen dưới dạng bản đơn tại một vị trí xác định hoặc ngẫu nhiên, tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân tích chức năng gen hoặc gây đột biến định hướng.

Thứ hai, lý thuyết chọn lọc trợ dưỡng dựa trên con đường sinh tổng hợp pyrimidine. Enzyme orotidine 5'-monophosphate decarboxylase do gen pyrG mã hóa giữ vai trò quyết định trong việc tổng hợp uridine 5'-monophosphate (UMP). Chủng mang đột biến mất đoạn gen pyrG không thể tự sinh trưởng trên môi trường tối thiểu trừ khi được bổ sung 0,1% uridine và 0,1% uracil. Đặc biệt, enzyme này chuyển hóa tiền chất 5-fluoroorotic acid (5-FOA) thành chất độc 5-fluorouracil gây chết tế bào tự nhiên, nhưng các thể đột biến hỏng gen pyrG lại đề kháng hoàn toàn với 5-FOA ở nồng độ 2 g/L, tạo cơ chế chọn lọc đối kháng 2 chiều tuyệt đối.

Các khái niệm chính được vận hành xuyên suốt gồm: Chuyển gen trung gian Agrobacterium (ATMT), Marker chọn lọc trợ dưỡng (pyrG), Độc tố ung thư aflatoxin, Vector nhị thể (Binary vector), và Protein chỉ thị huỳnh quang (GFP/DsRed).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng tổng cộng 18 chủng vi sinh vật, bao gồm 11 chủng A. oryzae (chủng chuẩn quốc tế RIB40, chủng trợ dưỡng AUT1-PlD, chủng phân lập bản địa VS1 và 8 chủng từ nguồn bảo tồn giống VTCCF), 2 chủng A. flavus (NRRL 3357, VTCCF 013), cùng các chủng đối chứng A. niger N402, A. nidulans FGSC A4, A. fumigatus VTCCF 015, vi khuẩn Escherichia coli DH5α và A. tumefaciens AGL1.

Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nhằm đối chiếu trực tiếp giữa chủng chuẩn công nghiệp thế giới RIB40 và chủng bản địa VS1 thu nhận từ làng nghề sản xuất tương truyền thống tại miền Bắc Việt Nam, nhằm đánh giá sự tương thích sinh học và tốc độ bài tiết enzyme.

Quy trình phân tích tích hợp các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại:

• Thiết kế phản ứng Multiplex PCR với 5 mồi đồng thời (ITS1, ITS4, Aof-ITS-F, AFB-F, AFB-R) để phân biệt chính xác A. oryzae an toàn và A. flavus sinh độc tố chỉ trong một bước điện di. Rationale của việc chọn kỹ thuật này là tối ưu hóa thời gian, loại bỏ hoàn toàn sai số từ nuôi cấy cảm quan và tiết kiệm 80% chi phí so với giải trình tự toàn bộ cụm gen 70 kb.
• Biến nạp plasmid vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng máy xung điện Bio-Rad với thông số chuẩn 2,5 kV, 400 Ω, 25 µF.
• Quá trình đồng nuôi cấy ATMT được thực hiện trên màng lọc cellulose đặt trên môi trường cảm ứng IM bổ sung 200 µM acetosyringone trong 60 giờ ở 22°C trước khi chuyển sang đĩa thạch chọn lọc chứa 300 mg/L kháng sinh cefotaxime để diệt trừ vi khuẩn mang.
• Toàn bộ timeline nghiên cứu từ khâu tách chiết nucleic acid, tạo dòng trên vector pGreen2, cảm ứng chuyển gen đến sàng lọc kiểu hình trên môi trường PSM kéo dài trong nhiều đợt thử nghiệm lặp lại từ 5 đến 7 ngày mỗi mẻ nuôi cấy.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thực nghiệm đã ghi nhận bốn phát hiện khoa học then chốt với số liệu định lượng cụ thể:

Thứ nhất, phản ứng Multiplex PCR 5 mồi đã phân loại thành công 100% các chủng khảo sát. Tất cả 10 chủng A. oryzae an toàn chỉ xuất hiện 2 băng DNA đặc trưng là 595 bp (vùng ITS chung) và 486 bp (vùng ITS phân nhóm Flavi), hoàn toàn không xuất hiện băng 116 bp đặc hiệu cho trình tự nối aflR-aflJ. Ngược lại, chủng A. flavus NRRL 3357 biểu hiện trọn vẹn cả 3 băng (595 bp, 486 bp, 116 bp) và phát tín hiệu huỳnh quang màu xanh lục của aflatoxin B1 dưới ánh sáng UV bước sóng 365 nm trên đĩa thạch dừa CAM.

Thứ hai, chủng bản địa A. oryzae VS1 chứng minh ưu thế sinh trưởng vượt trội so với chủng chuẩn quốc tế RIB40. Sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA ở 30°C, đường kính khuẩn lạc của VS1 đạt 3,5 cm, cao hơn 16,7% so với đường kính 3,0 cm của RIB40. Cả hai chủng đều thể hiện hoạt lực thủy phân tinh bột mạnh mẽ với đường kính vòng phân giải đạt từ 5 mm đến 7 mm trên môi trường bổ sung 1% tinh bột tan. Đồng thời, khảo sát cho thấy 100% (8/8) chủng A. oryzae kiểm tra đều có khả năng kháng tự nhiên đối với cả ba loại kháng sinh hygromycin B, phleomycin và nourseothricin ở các nồng độ thử nghiệm 100, 150 và 200 mg/L.

Thứ ba, tạo thành công chủng đột biến mất đoạn gen pyrG bằng vector nhị thể mang hai đoạn tương đồng 5'pyrG (1,41 kb) và 3'pyrG (1,33 kb). Các khuẩn lạc chuyển gen phát triển ổn định trên môi trường CD chọn lọc chứa 2 g/L 5-FOA, 0,5% uridine, 0,2% uracil và 300 mg/L cefotaxime, được khẳng định mất hoàn toàn đoạn mã hóa 0,9 kb của gen pyrG qua kiểm tra PCR.

Thứ tư, hoàn thiện bộ 3 vector nhị thể gồm pEX1 (mang gen GFP 720 bp), pEX2 (mang gen DsRed 678 bp) và pEX3 (mang gen phyA 1,51 kb). Hệ thống ATMT đưa thành công các gen chỉ thị vào hệ sợi nấm trợ dưỡng, ghi nhận tín hiệu huỳnh quang xanh lục ở bước sóng 509 nm và huỳnh quang đỏ ở bước sóng 583 nm. Thể chuyển gen pEX3 biểu hiện enzyme phytase ngoại bào tạo vòng phân giải phytate trong suốt rõ rệt trên đĩa thạch PSM sau 3 ngày nuôi cấy.

Thảo luận kết quả

Khả năng kháng tự nhiên của nấm sợi A. oryzae đối với các kháng sinh thông dụng bắt nguồn từ cấu trúc vách tế bào chitin dày đặc cùng hệ thống bơm tống thuốc đa cơ chế. Thực tế này giải thích vì sao các công bố quốc tế trước đây thường thất bại khi áp dụng marker kháng sinh trên loài nấm này. Việc chuyển hướng sang hệ thống marker trợ dưỡng pyrG không chỉ khắc phục hiện tượng kháng thuốc mà còn giảm thiểu đáng kể chi phí hóa chất trong quy mô công nghiệp.

So với phương pháp biến nạp qua tế bào trần có hiệu quả trao đổi chéo chỉ đạt từ 1% đến 50% và đòi hỏi thao tác thủy phân vách tế bào nghiêm ngặt, phương pháp ATMT đã nâng tỷ lệ tái tổ hợp tương đồng lên ngưỡng 75% đến 97%. Việc T-DNA tích hợp dạng bản đơn giúp bảo toàn tính toàn vẹn của hệ gen vật chủ, hạn chế tối đa các biến dị ngoài ý muốn.

Về mặt trình bày dữ liệu, các kết quả phân loại phân tử được trực quan hóa tối ưu qua sơ đồ điện di gel agarose đa giếng, phản ánh sự tương quan rõ rệt giữa kích thước vạch DNA chuẩn và sản phẩm khuếch đại. Số liệu sinh trưởng và hoạt tính enzyme được mô tả hiệu quả thông qua biểu đồ cột so sánh đường kính khuẩn lạc (cm) và biểu đồ phân bố kích thước vòng phân giải cơ chất (mm) theo các mốc thời gian nuôi cấy 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ, qua đó chứng minh năng lực bài tiết enzyme tái tổ hợp vượt trội của chủng nấm sợi bản địa.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đề xuất bốn nhóm giải pháp kỹ thuật và ứng dụng thực tiễn với lộ trình cụ thể:

Thứ nhất, tối ưu hóa các thông số vận hành của hệ thống ATMT. Nhóm nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm sinh học phân tử cần tiến hành khảo sát dải nồng độ chất cảm ứng acetosyringone từ 200 µM đến 350 µM, kiểm soát mật độ tế bào vi khuẩn ở ngưỡng OD600 từ 0,6 đến 0,8 và duy trì nhiệt độ đồng nuôi cấy nghiêm ngặt ở mức 22°C đến 24°C nhằm mục tiêu nâng hiệu suất chuyển gen tổng thể tăng thêm 15% đến 20% trong khung thời gian 6 tháng tới.

Thứ hai, mở rộng khai thác chủng đột biến A. oryzae VS1 khuyết dưỡng pyrG làm sinh vật chủ biểu hiện công nghiệp. Các trung tâm nghiên cứu enzym và doanh nghiệp công nghệ sinh học nên ứng dụng chủng này để sản xuất thử nghiệm các enzyme tái tổ hợp giá trị cao như phytase, cellulase và xylanase, hướng đến mục tiêu hạ giá thành sản xuất phụ gia thức ăn chăn nuôi từ 30% đến 40% trong lộ trình từ 12 đến 18 tháng.

Thứ ba, chuẩn hóa và chuyển giao quy trình Multiplex PCR 5 mồi vào kiểm định chất lượng thực phẩm. Cơ quan quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm cùng các cơ sở sản xuất nước tương, tương truyền thống cần triển khai xét nghiệm định kỳ cho 100% nguồn giống nấm mốc đầu vào, đảm bảo loại trừ triệt để nguy cơ nhiễm chéo chủng sinh độc tố A. flavus trong vòng 3 đến 6 tháng.

Thứ tư, cải biến và hoàn thiện cấu trúc vector biểu hiện nấm sợi. Các nhà khoa học công nghệ sinh học cần tiến hành tích hợp các promoter mạnh như promoter gpdA hoặc promoter cảm ứng amyB vào khung vector pEX, nhằm gia tăng nồng độ bài tiết protein ngoại bào tái tổ hợp đạt mức trên 2 g/L đến 5 g/L trong chu kỳ nghiên cứu từ 1 đến 2 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn là tài liệu chuyên khảo mang giá trị học thuật và ứng dụng cao cho bốn nhóm độc giả chính:

Nhóm thứ nhất: Các nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Vi sinh vật học, Di truyền học và Công nghệ Sinh học. Luận văn cung cấp toàn bộ quy trình thiết kế vector nhị thể, kỹ thuật tạo dòng trên nấm sợi bậc cao và phương pháp điều khiển tái tổ hợp tương đồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

Nhóm thứ hai: Kỹ sư công nghệ sinh học và chuyên viên R&D tại các nhà máy sản xuất enzyme, chế phẩm sinh học. Tài liệu mang lại hướng dẫn chi tiết về việc sử dụng chủng A. oryzae an toàn làm nhà máy tế bào để sản xuất quy mô lớn các enzyme công nghiệp như phytase và amylase với chi phí tinh sạch tối thiểu.

Nhóm thứ ba: Chuyên viên kiểm nghiệm chất lượng (QA/QC) và thanh tra an toàn thực phẩm. Kỹ thuật Multiplex PCR 5 mồi và phương pháp thử nghiệm phát quang trên môi trường thạch dừa CAM được trình bày chi tiết, hỗ trợ đắc lực cho công tác phân biệt nhanh nấm mốc làm tương an toàn và nấm mốc sinh độc tố gây ung thư.

Nhóm thứ tư: Học viên cao học và sinh viên các ngành Khoa học Sự sống. Luận văn là hình mẫu chuẩn mực về phương pháp bố trí thí nghiệm thực nghiệm vi sinh phân tử, xử lý dữ liệu di truyền học và cách tiếp cận giải quyết các thách thức kỹ thuật trong phòng thí nghiệm.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao không thể sử dụng trực tiếp các loại kháng sinh thông thường để chọn lọc thể chuyển gen ở Aspergillus oryzae?

Các chủng nấm sợi A. oryzae sở hữu khả năng kháng tự nhiên rất cao với hầu hết các chất kháng sinh diệt nấm. Dữ liệu thực nghiệm trên 8 chủng nấm cho thấy chúng vẫn sinh trưởng bình thường trên môi trường chứa 100 đến 200 mg/L hygromycin B, phleomycin và nourseothricin. Do đó, việc ứng dụng marker trợ dưỡng pyrG kết hợp chất đối kháng 5-FOA là giải pháp bắt buộc để sàng lọc chính xác thể chuyển gen.

Quy trình Multiplex PCR trong nghiên cứu phân biệt hai loài Aspergillus oryzae và Aspergillus flavus dựa trên nguyên lý nào?

Phương pháp tích hợp 5 mồi đặc hiệu trong một phản ứng: cặp ITS1/ITS4 nhân bản đoạn 566-599 bp làm đối chứng dương cho DNA nấm; cặp Aof-ITS-F/ITS4 tạo đoạn 486 bp nhận diện phân nhóm Flavi; cặp AFB-F/AFB-R khuếch đại đoạn 116 bp đặc hiệu cho vùng liên gen aflR-aflJ sinh độc tố chỉ có ở A. flavus. Kết quả A. oryzae chỉ có 2 băng, xác nhận an toàn tuyệt đối.

Phương pháp ATMT mang lại những ưu điểm vượt trội nào so với kỹ thuật chuyển gen qua tế bào trần?

Kỹ thuật ATMT cho phép sử dụng trực tiếp hệ sợi hoặc bào tử nấm mà không cần bước xử lý enzyme phân giải vách tế bào phức tạp. T-DNA được chuyển giao có xu hướng tích hợp dạng bản đơn vào bộ gen vật chủ, đồng thời nâng hiệu suất trao đổi chéo tương đồng để xóa gen đích đạt từ 75% đến 97%, vượt xa mức 1% đến 50% của phương pháp tế bào trần.

Cơ chế hoạt động của marker trợ dưỡng pyrG trong chọn lọc hai chiều là gì?

Gen pyrG mã hóa enzyme tổng hợp uracil cần thiết cho tế bào. Khi bị xóa gen, chủng nấm đòi hỏi bổ sung 0,1% uridine/uracil và kháng được 2 g/L chất độc 5-FOA. Khi đưa gen pyrG lành lặn trở lại qua vector nhị thể, thể chuyển gen phục hồi khả năng tự dưỡng pyrimidine, giúp nấm mọc bình thường trên môi trường tối thiểu mà không cần kháng sinh.

Việc biểu hiện thành công gen phyA trong nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn như thế nào đối với ngành chăn nuôi?

Gen phyA kích thước 1,51 kb mã hóa phytase ngoại bào giúp phân giải liên kết phytate khó tiêu trong thức ăn thực vật. Biểu hiện thành công enzyme này trên chủng nấm an toàn A. oryzae mở ra tiềm năng sản xuất chế phẩm sinh học quy mô lớn, giúp động vật đơn dạ dày hấp thu tối đa phospho tự nhiên, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và cắt giảm chi phí thức ăn chăn nuôi.

Kết luận

Nghiên cứu đã giải quyết trọn vẹn bài toán xây dựng hệ thống chuyển gen cho nấm sợi Aspergillus oryzae với 5 đóng góp khoa học nổi bật:

• Xây dựng thành công quy trình Multiplex PCR 5 mồi giúp định danh chính xác 100% chủng A. oryzae an toàn và phân biệt triệt để với loài A. flavus sinh độc tố aflatoxin.
• Tuyển chọn và đánh giá toàn diện chủng bản địa A. oryzae VS1 với tốc độ phát triển đường kính khuẩn lạc đạt 3,5 cm sau 3 ngày, vượt trội hơn chủng chuẩn công nghiệp quốc tế RIB40.
• Tạo lập thành công chủng đột biến mất đoạn gen pyrG thông qua cơ chế tái tổ hợp tương đồng nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
• Thiết kế và hoàn thiện bộ ba vector nhị thể pEX1, pEX2, pEX3 mang marker chọn lọc dinh dưỡng và các gen chỉ thị huỳnh quang GFP (720 bp), DsRed (678 bp).
• Bước đầu biểu hiện thành công gen phyA (1,51 kb) mã hóa phytase ngoại bào có hoạt tính xúc tác mạnh, khẳng định tính khả thi của hệ thống chuyển gen mới.

Trong 12 tháng tiếp theo, nghiên cứu cần tiến hành nâng quy mô nuôi cấy lên hệ thống bioreactor dung tích từ 10 lít đến 50 lít nhằm đánh giá độ bền di truyền và tối ưu hóa quy trình thu hồi enzyme tái tổ hợp. Đây là giải pháp công nghệ nền tảng; các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học hãy chủ động liên hệ hợp tác, tiếp nhận chuyển giao hệ thống vector và chủng giống để đẩy mạnh ứng dụng sản xuất enzyme phục vụ phát triển kinh tế sinh học bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Aspergillus oryzae là loài nấm sợi đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm truyền thống và đồ uống tại nhiều nƣớc châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia và Philippines. Loài nấm này đã đƣợc Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn (GRAS). oryzae đƣợc sử dụng để sản xuất tƣơng truyền thống tại một số địa phƣơng ở các tỉnh phía Bắc. oryzae có khả năng tiết một lƣợng lớn các enzyme khác nhau vào môi trƣờng.

Do đó, loài nấm này đƣợc sử dụng nhƣ nhà máy tế bào để sản xuất thƣơng mại nhiều loại enzyme và protein cả ở dạng tự nhiên và tái tổ hợp. Gần đây chủng A. oryzae RIB40 dùng trong sản xuất công nghiệp tại Nhật Bản đã đƣợc giải trình tự toàn bộ hệ gen. Sự hiểu biết tƣờng tận về hệ gen của A.

oryzae mở ra nhiều cơ hội trong cải biến di truyền và biểu hiện gen trên loài nấm sợi an toàn này. Hiện nay, hai phƣơng pháp phổ biến nhất trong chuyển gen vào nấm sợi là chuyển gen qua tế bào trần và chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Tuy nhiên việc chuyển gen vào nấm sợi A. oryzae cho đến nay chỉ sử dụng phƣơng pháp chuyển gen qua tế bào trần.

Phƣơng pháp này tƣơng đối phức tạp và tốn kém, khó có thể thực hiện tại điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam. Phƣơng pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens đơn giản hơn với chi phí hợp lý. Tuy nhiên chƣa có một nghiên cứu nào báo cáo về việc chuyển gen thành công ở nấm sợi A.

oryzae có khả năng kháng lại hầu hết các hợp chất kháng sinh thƣờng đƣợc sử dụng cho chuyển gen. Do đó phát triển các chủng A. oryzae trợ dƣỡng để sử dụng cho chuyển gen là giải pháp duy nhất để cải biến di truyền cũng nhƣ biểu hiện gen ở A. Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển gen hiệu quả cho nấm sợi A.

oryzae thông qua vi khuẩn A. tumefaciens nhằm phục vụ hƣớng nghiên cứu bền vững về biểu hiện enzyme/protein tái tổ hợp ở loài nấm này, chúng tôi thực hiện đề tài 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] ―Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae‖ với những nội dung chính nhƣ sau: - Xác nhận các chủng A. oryzae an toàn, có thể sử dụng làm đối tƣợng chuyển gen. oryzae đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil bằng cách xóa gen pyrG.

- Tạo một số vector nhị thể (binary vector) sử dụng cho chuyển gen và biểu hiện gen ở nấm sợi A. - Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen sử dụng các gen chỉ thị huỳnh quang GFP và DsRed. - Bƣớc đầu ứng dụng hệ thống chuyển gen mới tạo đƣợc để biểu hiện gen phyA mã hóa enzyme phytase từ nấm sợi Aspergillus fumigatus. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Chƣơng 1.

Giới thiệu chung về nấm sợi Aspergillus oryzae 1. Đặc điểm sinh học của nấm sợi Aspergillus oryzae Nấm sợi A. oryzae thuộc phân nhóm Flavi của chi Aspergillus, trong họ Trichocomaceae. oryzae có cấu tạo đa bào, khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng đĩa thạch, hệ sợi có màu trắng xám sau đó phát triển chuyển sang màu vàng nhạt đến xanh.

Hệ sợi nấm A. oryzae sinh trƣởng rất nhanh và phân mảnh, chiều ngang có kích thƣớc 5-7 µm. Trên những sợi này hình thành cấu trúc sinh sản vô tính, gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử của A.

oryzae thƣờng dài 1-2 mm. Trên cuống phồng lên tạo thành bọng, từ bọng này mọc lên các tế bào nhỏ, thuôn dài hình chai, xếp sát nhau, gọi là thể bình; trên thể bình có đính những chuỗi bào tử màu vàng lục hay màu vàng hoa cau (còn gọi là bào tử đính) [31, 53, 80, 99]. Hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của nấm sợi A. oryzae đƣợc Machida và cộng sự mô tả chi tiết nhƣ trong Hình 1.

Hình thái khuẩn lạc và cấu trúc cuống sinh bào tử của nấm sợi Aspergillus oryzae RIB40 [53] 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Nấm sợi A. oryzae sinh trƣởng tốt ở nhiệt độ 30ºC-40ºC, chúng có thể sinh trƣởng và phát triển dễ dàng trên nhiều loại cơ chất khác nhau nhƣ các mảnh vụn thực vật, cây lá, gỗ mục nát, các loại hạt, thức ăn gia súc. oryzae phân bố rộng rãi trên toàn thế giới, đặc biệt phổ biến ở các nƣớc nhiệt đới. Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển, A.

oryzae tiết ra môi trƣờng một lƣợng lớn các enzyme thủy phân nhƣ cellulase, pectinase, xylanase, amylase, protease, glucoamylase [36, 53]. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. oryzae Gần đây, chủng A. oryzae RIB40 đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất các thực phẩm lên men truyền thống tại Nhật Bản đã đƣợc giải trình tự toàn bộ hệ gen, theo đó hệ gen của A.

oryzae gồm 8 nhiễm sắc thể với tổng kích thƣớc là 37 megabase (Mb), dự đoán có 12.074 gen mã hóa protein, lớn hơn 25%-30% so với các loài khác thuộc chi Aspergillus. Chẳng hạn, hệ gen của A. oryzae lớn hơn loài A. Hệ gen của A.

oryzae lớn hơn chủ yếu do thu nạp thêm DNA trong quá trình tiến hóa. Việc mở rộng kích thƣớc hệ gen dƣờng nhƣ đặc trƣng cho các loài có quan hệ gần gũi với A. flavus, các loài này có kích thƣớc hệ gen tƣơng đƣơng nhau. Đặc biệt loài có quan hệ rất gần gũi với A.

flavus có độ tƣơng đồng DNA đến 99,5% [2, 53, 85]. oryzae có khả năng phân giải mạnh nhiều loại cơ chất có trong tự nhiên do loài này sở hữu các gen mã hóa enzyme thủy phân khác nhau. nidulans chứa lần lƣợt 135, 99 và 90 gen mã hóa cho các protease, chiếm khoảng 1% tổng số các gen trong hệ gen. Tất cả các gen mã hóa protease đƣợc tìm thấy trong A.

fumigatus và/hoặc A. nidulans đều có mặt trong A. oryzae, tuy nhiên các gen mã hóa một số enzyme aminopeptidase có mặt trong A. oryzae lại không có mặt trong hệ gen của A.

oryzae còn sở hữu thêm nhiều gen mã hóa protease tiết có khả năng hoạt động trong môi 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] trƣờng có tính axit. Sự gia tăng các protease hoạt động trong pH axit của A. oryzae có thể hình thành trong quá trình thuần hóa của con ngƣời [53]. Sự hiểu biết tƣờng tận về hệ gen của Aspergillus oryzae đã mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu cải biến di truyền ứng dụng loài nấm an toàn này trong sản xuất các sản phẩm nhằm phục vụ mục đích con ngƣời.

Vai trò của nấm sợi A. oryzae Nấm sợi A. oryzae đƣợc thuần hóa từ ít nhất 2000 năm trƣớc và hiện nay đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm ở Nhật Bản, Trung Quốc và các nƣớc Đông Á nhƣ lên men đậu nành, làm nƣớc sốt, tƣơng và một số đồ uống có cồn nhƣ huangjiu, sake, makgeolli và shochu [4, 36, 111]. oryzae đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực phẩm do đặc tính sinh trƣởng nhanh, tiết lƣợng lớn các enzyme thủy phân nhƣ amylase, glucoamylase, carboxypeptidase, protease trong quá trình sinh trƣởng và tạo mùi thơm dễ chịu cho các sản phẩm lên men [37].

Trong lên men truyền thống, A. oryzae thƣờng đƣợc nuôi ở môi trƣờng rắn, điều kiện này thích hợp cho sự phát triển hiếu khí của sợi nấm. Độ ẩm thích hợp trong quá trình lên men ở môi trƣờng rắn giúp tăng khả năng sản sinh các enzyme và các chất chuyển hóa mà thƣờng sẽ không đƣợc sản xuất trong điều kiện lên men lỏng [99]. Ngoài vai trò trong sản xuất các thực phẩm truyền thống, nấm sợi A.

oryzae còn đƣợc sử dụng trong một số ngành công nghiệp sản xuất enzyme có giá trị kinh tế cao nhƣ glucoamylase, α-amylase và một số protease phục vụ sản xuất bánh kẹo, đồ uống. Glucoamylase và α-amylase thuộc nhóm enzyme amylase, chiếm tới gần 20% tổng sản lƣợng enzyme đƣợc sản xuất, trong đó chủ yếu đƣợc sản xuất bởi nấm sợi A. Nguồn cung cấp enzyme protease cho công nghiệp sản xuất thực phẩm và các chất tẩy rửa đến từ các loài nấm sợi thuộc chi Conidiobolus, Verticillium, Penicillium và Aspergillus, trong đó phải kể đến loài sinh protease rất cao là A. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Bên cạnh những lợi ích về kinh tế, A.

oryzae còn đƣợc coi là vi sinh vật mô hình dùng cho nghiên cứu về biểu hiện enzyme và protein tái tổ hợp. Ngoài ra nghiên cứu chuyển gen còn hỗ trợ trong việc tìm ra chức năng cũng nhƣ vai trò của các gen mới [54]. Phân biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin Hiện nay, tỷ lệ ngƣời mắc bệnh ung thƣ tăng lên ngày một tăng cao. Một trong những nguyên nhân chính là do ăn phải thực phẩm chứa các chất gây ung thƣ, trong đó có độc tố nấm aflatoxin.

Độc tố aflatoxin đƣợc sinh ra bởi nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trên các loại hạt nông sản quan trọng không đƣợc bảo quản tốt nhƣ gạo, lạc, ngô, đậu tƣơng. Hình thái của A. flavus gần nhƣ giống hệt với loài A. oryzae mà thƣờng đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm [17, 26, 80].

oryzae là hai loài thuộc phân nhóm Flavi của chi Aspergillus. Tƣơng tự nhƣ A. oryzae, nấm sợi A. flavus có khả năng tồn tại ở nhiệt độ từ 12ºC đến 48ºC và sinh trƣởng tối ƣu nhất ở 28ºC đến 37ºC.

Hầu hết trong chu trình sống A. flavus tồn tại ở dạng hệ sợi và sinh sản bằng bào tử đính. Giống với một số chủng A. oryzae, dƣới điều kiện bất lợi, sợi nấm A.

flavus chuyển thành cấu trúc đặc biệt gọi là hạch nấm (sclerotia). Hạch nấm giúp chúng có thể tồn tại dƣới các điều kiện khắc nghiệt. Khi điều kiện trở nên thuận lợi, các hạch nấm sẽ phát triển thành dạng sợi và từ đó sinh ra các cuống mang bào tử đính, phát tán ra ngoài môi trƣờng đất và không khí [17, 26]. Trong tự nhiên, rất khó để có thể phân biệt hai loài A.

flavus bởi hình thái rất giống nhau. Hơn nữa, khi giải trình tự hai chủng đại diện cho hai loài, nhận thấy genome của chủng A. oryzae RIB40 và A. flavus NRRL 3357 có độ tƣơng đồng 99,5% DNA và 98% protein [85].

Phân tích tiến hóa trên một số chủng thuộc hai chi này, nhận thấy A. oryzae có mức độ tƣơng đồng tùy thuộc vào 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] từng chủng. Ví dụ nhƣ hai chủng A. flavus SRRC 1357 và SRRC 2112 có mối quan hệ gần gũi với A.

flavus khác, do có nhiều đặc điểm của A. Từ các dữ liệu về hệ gen, A. oryzae đƣợc cho rằng có nguồn gốc phát sinh từ loài A.