MỞ ĐẦU Aspergillus oryzae là loài nấm sợi đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm truyền thống và đồ uống tại nhiều nƣớc châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia và Philippines. Loài nấm này đã đƣợc Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn (GRAS). oryzae đƣợc sử dụng để sản xuất tƣơng truyền thống tại một số địa phƣơng ở các tỉnh phía Bắc. oryzae có khả năng tiết một lƣợng lớn các enzyme khác nhau vào môi trƣờng.
Do đó, loài nấm này đƣợc sử dụng nhƣ nhà máy tế bào để sản xuất thƣơng mại nhiều loại enzyme và protein cả ở dạng tự nhiên và tái tổ hợp. Gần đây chủng A. oryzae RIB40 dùng trong sản xuất công nghiệp tại Nhật Bản đã đƣợc giải trình tự toàn bộ hệ gen. Sự hiểu biết tƣờng tận về hệ gen của A.
oryzae mở ra nhiều cơ hội trong cải biến di truyền và biểu hiện gen trên loài nấm sợi an toàn này. Hiện nay, hai phƣơng pháp phổ biến nhất trong chuyển gen vào nấm sợi là chuyển gen qua tế bào trần và chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Tuy nhiên việc chuyển gen vào nấm sợi A. oryzae cho đến nay chỉ sử dụng phƣơng pháp chuyển gen qua tế bào trần.
Phƣơng pháp này tƣơng đối phức tạp và tốn kém, khó có thể thực hiện tại điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam. Phƣơng pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens đơn giản hơn với chi phí hợp lý. Tuy nhiên chƣa có một nghiên cứu nào báo cáo về việc chuyển gen thành công ở nấm sợi A.
oryzae có khả năng kháng lại hầu hết các hợp chất kháng sinh thƣờng đƣợc sử dụng cho chuyển gen. Do đó phát triển các chủng A. oryzae trợ dƣỡng để sử dụng cho chuyển gen là giải pháp duy nhất để cải biến di truyền cũng nhƣ biểu hiện gen ở A. Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển gen hiệu quả cho nấm sợi A.
oryzae thông qua vi khuẩn A. tumefaciens nhằm phục vụ hƣớng nghiên cứu bền vững về biểu hiện enzyme/protein tái tổ hợp ở loài nấm này, chúng tôi thực hiện đề tài 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ―Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae‖ với những nội dung chính nhƣ sau: - Xác nhận các chủng A. oryzae an toàn, có thể sử dụng làm đối tƣợng chuyển gen. oryzae đột biến trợ dƣỡng uridine/uracil bằng cách xóa gen pyrG.
- Tạo một số vector nhị thể (binary vector) sử dụng cho chuyển gen và biểu hiện gen ở nấm sợi A. - Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen sử dụng các gen chỉ thị huỳnh quang GFP và DsRed. - Bƣớc đầu ứng dụng hệ thống chuyển gen mới tạo đƣợc để biểu hiện gen phyA mã hóa enzyme phytase từ nấm sợi Aspergillus fumigatus. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1.
Giới thiệu chung về nấm sợi Aspergillus oryzae 1. Đặc điểm sinh học của nấm sợi Aspergillus oryzae Nấm sợi A. oryzae thuộc phân nhóm Flavi của chi Aspergillus, trong họ Trichocomaceae. oryzae có cấu tạo đa bào, khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng đĩa thạch, hệ sợi có màu trắng xám sau đó phát triển chuyển sang màu vàng nhạt đến xanh.
Hệ sợi nấm A. oryzae sinh trƣởng rất nhanh và phân mảnh, chiều ngang có kích thƣớc 5-7 µm. Trên những sợi này hình thành cấu trúc sinh sản vô tính, gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử của A.
oryzae thƣờng dài 1-2 mm. Trên cuống phồng lên tạo thành bọng, từ bọng này mọc lên các tế bào nhỏ, thuôn dài hình chai, xếp sát nhau, gọi là thể bình; trên thể bình có đính những chuỗi bào tử màu vàng lục hay màu vàng hoa cau (còn gọi là bào tử đính) [31, 53, 80, 99]. Hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của nấm sợi A. oryzae đƣợc Machida và cộng sự mô tả chi tiết nhƣ trong Hình 1.
Hình thái khuẩn lạc và cấu trúc cuống sinh bào tử của nấm sợi Aspergillus oryzae RIB40 [53] 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nấm sợi A. oryzae sinh trƣởng tốt ở nhiệt độ 30ºC-40ºC, chúng có thể sinh trƣởng và phát triển dễ dàng trên nhiều loại cơ chất khác nhau nhƣ các mảnh vụn thực vật, cây lá, gỗ mục nát, các loại hạt, thức ăn gia súc. oryzae phân bố rộng rãi trên toàn thế giới, đặc biệt phổ biến ở các nƣớc nhiệt đới. Trong quá trình sinh trƣởng và phát triển, A.
oryzae tiết ra môi trƣờng một lƣợng lớn các enzyme thủy phân nhƣ cellulase, pectinase, xylanase, amylase, protease, glucoamylase [36, 53]. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A. oryzae Gần đây, chủng A. oryzae RIB40 đƣợc sử dụng trong công nghiệp sản xuất các thực phẩm lên men truyền thống tại Nhật Bản đã đƣợc giải trình tự toàn bộ hệ gen, theo đó hệ gen của A.
oryzae gồm 8 nhiễm sắc thể với tổng kích thƣớc là 37 megabase (Mb), dự đoán có 12.074 gen mã hóa protein, lớn hơn 25%-30% so với các loài khác thuộc chi Aspergillus. Chẳng hạn, hệ gen của A. oryzae lớn hơn loài A. Hệ gen của A.
oryzae lớn hơn chủ yếu do thu nạp thêm DNA trong quá trình tiến hóa. Việc mở rộng kích thƣớc hệ gen dƣờng nhƣ đặc trƣng cho các loài có quan hệ gần gũi với A. flavus, các loài này có kích thƣớc hệ gen tƣơng đƣơng nhau. Đặc biệt loài có quan hệ rất gần gũi với A.
flavus có độ tƣơng đồng DNA đến 99,5% [2, 53, 85]. oryzae có khả năng phân giải mạnh nhiều loại cơ chất có trong tự nhiên do loài này sở hữu các gen mã hóa enzyme thủy phân khác nhau. nidulans chứa lần lƣợt 135, 99 và 90 gen mã hóa cho các protease, chiếm khoảng 1% tổng số các gen trong hệ gen. Tất cả các gen mã hóa protease đƣợc tìm thấy trong A.
fumigatus và/hoặc A. nidulans đều có mặt trong A. oryzae, tuy nhiên các gen mã hóa một số enzyme aminopeptidase có mặt trong A. oryzae lại không có mặt trong hệ gen của A.
oryzae còn sở hữu thêm nhiều gen mã hóa protease tiết có khả năng hoạt động trong môi 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com trƣờng có tính axit. Sự gia tăng các protease hoạt động trong pH axit của A. oryzae có thể hình thành trong quá trình thuần hóa của con ngƣời [53]. Sự hiểu biết tƣờng tận về hệ gen của Aspergillus oryzae đã mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu cải biến di truyền ứng dụng loài nấm an toàn này trong sản xuất các sản phẩm nhằm phục vụ mục đích con ngƣời.
Vai trò của nấm sợi A. oryzae Nấm sợi A. oryzae đƣợc thuần hóa từ ít nhất 2000 năm trƣớc và hiện nay đƣợc sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm ở Nhật Bản, Trung Quốc và các nƣớc Đông Á nhƣ lên men đậu nành, làm nƣớc sốt, tƣơng và một số đồ uống có cồn nhƣ huangjiu, sake, makgeolli và shochu [4, 36, 111]. oryzae đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực phẩm do đặc tính sinh trƣởng nhanh, tiết lƣợng lớn các enzyme thủy phân nhƣ amylase, glucoamylase, carboxypeptidase, protease trong quá trình sinh trƣởng và tạo mùi thơm dễ chịu cho các sản phẩm lên men [37].
Trong lên men truyền thống, A. oryzae thƣờng đƣợc nuôi ở môi trƣờng rắn, điều kiện này thích hợp cho sự phát triển hiếu khí của sợi nấm. Độ ẩm thích hợp trong quá trình lên men ở môi trƣờng rắn giúp tăng khả năng sản sinh các enzyme và các chất chuyển hóa mà thƣờng sẽ không đƣợc sản xuất trong điều kiện lên men lỏng [99]. Ngoài vai trò trong sản xuất các thực phẩm truyền thống, nấm sợi A.
oryzae còn đƣợc sử dụng trong một số ngành công nghiệp sản xuất enzyme có giá trị kinh tế cao nhƣ glucoamylase, α-amylase và một số protease phục vụ sản xuất bánh kẹo, đồ uống. Glucoamylase và α-amylase thuộc nhóm enzyme amylase, chiếm tới gần 20% tổng sản lƣợng enzyme đƣợc sản xuất, trong đó chủ yếu đƣợc sản xuất bởi nấm sợi A. Nguồn cung cấp enzyme protease cho công nghiệp sản xuất thực phẩm và các chất tẩy rửa đến từ các loài nấm sợi thuộc chi Conidiobolus, Verticillium, Penicillium và Aspergillus, trong đó phải kể đến loài sinh protease rất cao là A. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bên cạnh những lợi ích về kinh tế, A.
oryzae còn đƣợc coi là vi sinh vật mô hình dùng cho nghiên cứu về biểu hiện enzyme và protein tái tổ hợp. Ngoài ra nghiên cứu chuyển gen còn hỗ trợ trong việc tìm ra chức năng cũng nhƣ vai trò của các gen mới [54]. Phân biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin Hiện nay, tỷ lệ ngƣời mắc bệnh ung thƣ tăng lên ngày một tăng cao. Một trong những nguyên nhân chính là do ăn phải thực phẩm chứa các chất gây ung thƣ, trong đó có độc tố nấm aflatoxin.
Độc tố aflatoxin đƣợc sinh ra bởi nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trên các loại hạt nông sản quan trọng không đƣợc bảo quản tốt nhƣ gạo, lạc, ngô, đậu tƣơng. Hình thái của A. flavus gần nhƣ giống hệt với loài A. oryzae mà thƣờng đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm [17, 26, 80].
oryzae là hai loài thuộc phân nhóm Flavi của chi Aspergillus. Tƣơng tự nhƣ A. oryzae, nấm sợi A. flavus có khả năng tồn tại ở nhiệt độ từ 12ºC đến 48ºC và sinh trƣởng tối ƣu nhất ở 28ºC đến 37ºC.
Hầu hết trong chu trình sống A. flavus tồn tại ở dạng hệ sợi và sinh sản bằng bào tử đính. Giống với một số chủng A. oryzae, dƣới điều kiện bất lợi, sợi nấm A.
flavus chuyển thành cấu trúc đặc biệt gọi là hạch nấm (sclerotia). Hạch nấm giúp chúng có thể tồn tại dƣới các điều kiện khắc nghiệt. Khi điều kiện trở nên thuận lợi, các hạch nấm sẽ phát triển thành dạng sợi và từ đó sinh ra các cuống mang bào tử đính, phát tán ra ngoài môi trƣờng đất và không khí [17, 26]. Trong tự nhiên, rất khó để có thể phân biệt hai loài A.
flavus bởi hình thái rất giống nhau. Hơn nữa, khi giải trình tự hai chủng đại diện cho hai loài, nhận thấy genome của chủng A. oryzae RIB40 và A. flavus NRRL 3357 có độ tƣơng đồng 99,5% DNA và 98% protein [85].
Phân tích tiến hóa trên một số chủng thuộc hai chi này, nhận thấy A. oryzae có mức độ tƣơng đồng tùy thuộc vào 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com từng chủng. Ví dụ nhƣ hai chủng A. flavus SRRC 1357 và SRRC 2112 có mối quan hệ gần gũi với A.
flavus khác, do có nhiều đặc điểm của A. Từ các dữ liệu về hệ gen, A. oryzae đƣợc cho rằng có nguồn gốc phát sinh từ loài A.