Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae

• Tác giả: Nguyễn Thị Khuyến
• Người hướng dẫn: TS. Trần Văn Tuấn
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỤC LỤC
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM SỢI Aspergillus oryzae
• 1.1. Đặc điểm sinh học của nấm sợi Aspergillus oryzae
• 1.2. Đặc điểm di truyền của nấm sợi A.
• 1.3. Vai trò của nấm sợi A.
• 1.4. Phân biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin
• 2. Các phương pháp chuyển gen vào nấm sợi
• 2.1. Phương pháp chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast)
• 2.2. Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện (electroporation)
• 2.3. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A.
• 2.4. Marker sử dụng trong chọn lọc các chủng chuyển gen
• 2.5. Một số gen chỉ thị dùng trong chuyển gen ở vi nấm
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Chủng vi sinh vật
• 3.2. Thiết bị và hóa chất
• 3.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Thu nhận bào tử nấm
• 3.4.2. Tách chiết DNA, RNA và tổng hợp cDNA
• 3.4.3. Quan sát hình thái và kiểm tra một số đặc điểm sinh lý sinh hóa
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Phân biệt các chủng A. oryzae an toàn và chủng Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin
• 4.2. Lựa chọn chủng A. oryzae phục vụ cho chuyển gen
• 4.3. Lựa chọn marker chuyển gen vào A.
• 4.4. Xây dựng hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A.
• 4.5. Xóa gen pyrG để tạo chủng đột biến trợ dưỡng uridine/uracil
• 4.6. Tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gen vào A. oryzae trợ dưỡng uridine/uracil
• 4.7. Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen với gen huỳnh quang GFP và DsRed
• 4.8. Chuyển gen GFP và DsRed vào nấm sợi A. oryzae trợ dưỡng uridine/uracil
• 4.9. Xác nhận các thể chuyển gen
• 4.10. Ứng dụng hệ thống chuyển gen mới thiết lập để biểu hiện gen phyA mã hóa enzyme phytase từ nấm sợi Aspergillus fumigatus
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về hệ thống chuyển gen Agrobacterium tumefaciens cho Aspergillus oryzae

Hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho Aspergillus oryzae đã trở thành một trong những phương pháp tiên tiến trong nghiên cứu di truyền. Aspergillus oryzae là một loài nấm sợi quan trọng trong sản xuất thực phẩm và enzyme. Việc phát triển hệ thống chuyển gen này không chỉ giúp cải thiện khả năng sản xuất enzyme mà còn mở ra cơ hội cho việc nghiên cứu các gen mới. Hệ thống này sử dụng Agrobacterium tumefaciens như một vector để chuyển gen vào tế bào nấm, giúp đơn giản hóa quy trình và giảm chi phí so với các phương pháp truyền thống.

1.1. Đặc điểm sinh học của nấm Aspergillus oryzae

Nấm Aspergillus oryzae thuộc phân nhóm Flavi, có khả năng sinh trưởng nhanh và tiết ra nhiều enzyme có giá trị. Loài nấm này được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm truyền thống như tương và rượu. Đặc điểm sinh học của nó cho phép phát triển trong nhiều điều kiện khác nhau, từ đó tạo ra các sản phẩm enzyme chất lượng cao.

1.2. Vai trò của Agrobacterium tumefaciens trong chuyển gen

Agrobacterium tumefaciens là một vi khuẩn có khả năng chuyển gen tự nhiên vào thực vật. Việc sử dụng vi khuẩn này trong chuyển gen cho Aspergillus oryzae giúp tăng cường hiệu quả và độ chính xác của quá trình chuyển gen, đồng thời giảm thiểu các vấn đề liên quan đến kháng sinh.

II. Thách thức trong nghiên cứu chuyển gen cho Aspergillus oryzae

Mặc dù hệ thống chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens có nhiều ưu điểm, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong việc áp dụng cho Aspergillus oryzae. Một trong những vấn đề lớn nhất là khả năng kháng lại các hợp chất kháng sinh thường được sử dụng trong quá trình chuyển gen. Điều này đòi hỏi phải phát triển các chủng nấm mới có khả năng hỗ trợ cho quá trình chuyển gen.

2.1. Khó khăn trong việc chọn lọc chủng nấm

Việc chọn lọc các chủng Aspergillus oryzae an toàn và hiệu quả cho quá trình chuyển gen là một thách thức lớn. Các chủng này cần phải có khả năng kháng lại các hợp chất kháng sinh mà không làm giảm hiệu suất sản xuất enzyme.

2.2. Vấn đề về chi phí và quy trình

Quy trình chuyển gen hiện tại vẫn còn phức tạp và tốn kém. Việc phát triển một quy trình đơn giản và tiết kiệm chi phí là cần thiết để áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu và sản xuất.

III. Phương pháp chuyển gen hiệu quả cho Aspergillus oryzae

Để phát triển hệ thống chuyển gen hiệu quả cho Aspergillus oryzae, một số phương pháp đã được nghiên cứu và áp dụng. Phương pháp sử dụng Agrobacterium tumefaciens là một trong những lựa chọn hàng đầu nhờ vào tính hiệu quả và độ chính xác cao trong việc chuyển gen.

3.1. Phương pháp chuyển gen qua vi khuẩn Agrobacterium

Phương pháp này sử dụng Agrobacterium tumefaciens để chuyển gen vào tế bào nấm. Quá trình này diễn ra thông qua việc vi khuẩn xâm nhập vào tế bào nấm và chuyển gen vào hệ gen của nó, giúp tạo ra các chủng nấm biến đổi gen.

3.2. Tạo vector nhị thể cho chuyển gen

Việc tạo ra các vector nhị thể là một bước quan trọng trong quá trình chuyển gen. Các vector này giúp mang gen cần chuyển vào tế bào nấm một cách hiệu quả, đồng thời cho phép theo dõi sự biểu hiện của gen sau khi chuyển vào.

IV. Ứng dụng thực tiễn của hệ thống chuyển gen cho Aspergillus oryzae

Hệ thống chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens cho Aspergillus oryzae không chỉ có giá trị trong nghiên cứu mà còn trong sản xuất thực phẩm và enzyme. Việc ứng dụng thành công hệ thống này có thể giúp cải thiện năng suất và chất lượng sản phẩm, đồng thời mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm mới.

4.1. Sản xuất enzyme và protein tái tổ hợp

Hệ thống chuyển gen này cho phép sản xuất các enzyme và protein tái tổ hợp với hiệu suất cao. Điều này có thể ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm và công nghiệp sinh học.

4.2. Nghiên cứu chức năng gen mới

Hệ thống chuyển gen cũng hỗ trợ trong việc nghiên cứu chức năng của các gen mới, từ đó giúp hiểu rõ hơn về cơ chế sinh học và ứng dụng trong cải biến di truyền.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu chuyển gen

Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens cho Aspergillus oryzae đã mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực di truyền học và công nghệ sinh học. Với những tiến bộ trong công nghệ, việc ứng dụng hệ thống này trong sản xuất và nghiên cứu sẽ ngày càng trở nên phổ biến.

5.1. Triển vọng trong nghiên cứu di truyền

Hệ thống chuyển gen này có thể được mở rộng để nghiên cứu các loài nấm khác, từ đó giúp phát triển các sản phẩm mới và cải thiện quy trình sản xuất.

5.2. Tương lai của công nghệ sinh học

Công nghệ sinh học sẽ tiếp tục phát triển, và hệ thống chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc cải tiến các sản phẩm sinh học và thực phẩm an toàn cho con người.