MỞ ĐẦU Bệnh lao là một trong ba bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất thế giới, bệnh đƣợc gây ra bởi vi khuẩn lao có tên khoa học là Mycobacterium tuberculosis (MTB). Tổ chức Y tế thế giới (WHO) ƣớc tính khoảng 1/3 dân số toàn cầu hiện nay đã bị nhiễm MTB và có khoảng 1,7 triệu ngƣời tử vong do lao hàng năm, tức là khoảng 4700 ngƣời tử vong mỗi ngày vì lao. Mặc dù công tác tiêm chủng vaccine BCG, phòng chống và phát triển thuốc chống lại vi khuẩn lao đã có những bƣớc tiến đáng kể nhƣng cho đến nay bệnh lao vẫn là một vấn đề sức khỏe có tính thách thức đối với toàn cầu. Bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn lao nếu phát hiện muộn sẽ rất khó điều trị và tăng nguy cơ lây truyền sang ngƣời lành.
Do đó việc chẩn đoán sớm các chủng vi khuẩn lao sẽ góp phần đáng kể trong điều trị bệnh lao [1, 33]. Để chẩn đoán vi khuẩn lao, hiện nay bệnh viện và các cơ sở y tế trong nƣớc vẫn phải dựa vào các phƣơng pháp cổ điển nhƣ soi trực tiếp, nuôi cấy vi khuẩn…, yêu cầu số lƣợng vi khuẩn lao lớn hoặc thời gian chẩn đoán lao cần ít nhất 4 – 6 tuần. Với những nhƣợc điểm nhƣ vậy sẽ khó khăn cho công tác điều trị, khó đáp ứng yêu cầu giám sát và thanh toán bệnh lao [2, 3]. Khắc phục những nhƣợc điểm đó, việc ứng dụng sinh học phân tử kết hợp công nghệ nano đang tạo ra những đột phá trong chẩn đoán vi khuẩn lao cũng nhƣ các chủng vi khuẩn khác.
Thời gian chẩn đoán có thể rút ngắn xuống còn vài ngày, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho việc kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn [23, 25]. Công nghệ nano ngày nay đang có những bƣớc tiến quan trọng trong chẩn đoán và hỗ trợ điều trị bệnh nhằm mục đích cải thiện và nâng cao sức khỏe của con ngƣời. Trong số đó, các hạt nano kim loại đặc biệt là hạt nano kim loại có từ tính đƣợc chức năng hóa bề mặt đã và đang đƣợc nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân những năm gần đây, ví dụ nhƣ phân tách tế bào, tách chiết acid nucleic (ADN, ARN), gắn kết với kháng thể…[5, 27]. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu và thử nghiệm hạt nano kim loại đƣợc chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán vi khuẩn lao” với các mục tiêu sau : Xây dựng quy trình gắn kết hạt nano kim loại có từ tính đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao và đánh giá khả năng làm giàu MTB bằng hạt nano kim loại có từ tính đã đƣợc chức năng hóa bề mặt gắn anti-TB để phát hiện MTB bằng kỹ thuật PCR.
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LAO Vi khuẩn lao do Robert Koch tìm ra năm 1882, vì vậy còn đƣợc gọi là Bacilie de Koch (viết tắt là BK). Đã hơn một thế kỷ kể từ khi phát hiện ra vi khuẩn lao, nhờ việc áp dụng các kỹ thuật hiện đại trong hóa sinh, miễn dịch, sinh học phân tử…cùng với kính hiển vi điện tử, ngƣời ta đã hiểu tƣơng đối rõ về cấu trúc, đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh của vi khuẩn lao.
Tuy nhiên, vi khuẩn lao vẫn là đối tƣợng nghiên cứu của nhiều công trình khoa học vì sự tinh vi trong siêu cấu trúc, tính chất phức tạp của các kháng nguyên, sự đa dạng trong hình thức tồn tại, nhất là những đột biến gen khi vi khuẩn kháng thuốc [2, 3]. Đặc điểm của vi khuẩn lao Tác nhân gây bệnh lao là Mycobacterium tuberculosis (MTB), tế bào MTB dài 3-5µm, rộng 0,3-0,5µm, không có lông, hai đầu tròn, thân có hạt, tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành hình chữ N, Y, V hoặc thành dãy phân nhánh nhƣ cành cây trên tiêu bản nhuộm Ziehl – Neelsen, không bị cồn và acid làm mất màu đỏ của fucsin. Vi khuẩn lao trong tiêu bản nhuộm Ziehl – Neelsen [35] MTB là vi khuẩn hiếu khí, phân chia mỗi lần từ 16 đến 20 giờ, rất chậm so với thời gian phân chia tính bằng phút của các vi khuẩn khác (trong số các vi khuẩn phân chia nhanh nhất là một chủng E. coli, có thể phân chia mỗi 20 phút).
MTB Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân không đƣợc phân loại Gram dƣơng hay Gram âm vì chúng không có đặc tính hoá học này, mặc dù thành tế bào có chứa peptidoglycan. Trên mẫu nhuộm Gram, tế bào vi khuẩn cho kết quả nhuộm rất yếu hoặc là không biểu hiện gì cả. MTB có thể chịu đựng đƣợc chất sát khuẩn yếu và sống sót trong trạng thái khô trong nhiều tuần nhƣng trong điều kiện tự nhiên, chỉ có thể phát triển trong sinh vật ký chủ (cấy MTB in vitro cần thời gian dài để có kết quả, nhƣng ngày nay là công việc bình thƣờng ở phòng xét nghiệm) [2, 3]. Hiện nay xu hƣớng phân loại vi khuẩn lao dựa vào trình tự ADN của chúng đã đƣợc áp dụng.
Ngƣời ta nhận thấy đoạn IS6110 với 1361 cặp base chỉ có ở bốn loại mycobacteria là M. microti (gọi chung là M. tuberculosis complex) mà không có ở các mycobacteria khác [17, 31]. Hệ gene vi khuẩn lao Từ năm 1998, nhờ Cole và cộng sự [16], toàn bộ trình tự của chủng MTB H37Rv đã đƣợc giải mã và phân tích, cung cấp những kiến thức sinh học về loài vi khuẩn sinh sản chậm này, mở ra những khái niệm mới trong can thiệp phòng và điều trị bệnh.
Toàn bộ hệ gene gồm 4411529 bp chứa khoảng 4000 gene, với tỷ lệ GC cao khoảng 65%. Điểm khác cơ bản trong hệ gene giữa MTB với những vi sinh vật khác là phần lớn các gene mã hoá những enzyme có liên quan đến việc tổng hợp và phân giải lipid, có 2 họ protein mới (PE và PPE) giàu glycine với cấu trúc lặp lại. MTB thƣờng kháng ngẫu nhiên với nhiều thuốc làm cho việc điều trị lao trở nên khó khăn. Sự kháng thuốc này chủ yếu là do vách tế bào kỵ nƣớc tác dụng nhƣ là rào cản thấm, tuy vậy nhiều yếu tố quyết định sự kháng thuốc đƣợc mã hóa trong hệ gene vi khuẩn nhƣ là enzyme thủy phân, enzyme biến đổi tác dụng của thuốc nhƣ β-lactamase, aminoglycoside acetyl transferase…và nhiều hệ thống vận chuyển thuốc ra ngoài khác.
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Hình 1. Hệ gene của chủng MTB H37Rv [16] Vòng tròn ngoài cùng biểu hiện thang cho MTB, 0 – nơi bắt đầu sao chép. Vòng tròn đầu tiên tính từ ngoài vào cho thấy vị trí gene ARN ổn định, trình tự DR đại diện bằng hình khối hồng. Vòng tròn thứ 2 bên trong chỉ trình tự mã hoá (theo chiều kim đồng hồ - xanh lá đậm, ngược chiều kim đồng hồ - xanh lá nhạt).
Vòng tròn thứ 3 minh họa trình tự ADN lặp (trình tự chèn – cam, họ 13E12 REP – hồng đậm, prophage – xanh dương), vòng tròn thứ 4 chỉ vị trí họ PPE (xanh lá), vòng tròn thứ 5 chỉ họ PE (tím, ngoại trừ PGRS), và vòng tròn thứ 6 chỉ vị trí trình tự PGRS (đỏ sậm). Biểu đồ tròn khu vực trung tâm biểu hiện lượng GC, màu vàng chỉ ít hơn 65% GC, khu vực màu đỏ là GC cao hơn 65% [16]. Các nghiên cứu cho thấy nhóm MTB có hệ gene bảo tồn cao. Các thành viên trong họ MTB có tính đa dạng cao khi xét về kiểu hình hoặc kiểu kí chủ, đây là ví dụ điển hình cho tính ổn định di truyền giữa các chủng, với tốc độ đột biến vô nghĩa làm nên điểm đa hình ƣớc tính khoảng 0,01% - 0,03%, nhất là không có bằng chứng nào cho thấy có sự di truyền ngang vật chất di truyền trong cùng thế hệ giữa các vi khuẩn lao nhƣ các vi khuẩn khác [16].
Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân 1. Khả năng gây bệnh và tình hình bệnh lao Về mặt dịch tễ học, tất cả những bệnh nhân lao đều có thể là nguồn lây, nhƣng mức độ lây rất khác nhau. Đối với các thể lao ngoài phổi (lao màng não, màng bụng, hạch, xƣơng khớp…) đƣợc gọi là những thể lao “kín”, nghĩa là vi khuẩn ít khả năng nhiễm vào môi trƣờng bên ngoài. Lao phổi là thể lao dễ đƣa vi khuẩn ra môi trƣờng bên ngoài.
Bệnh nhân lao phổi khác nhau thì khả năng lây bệnh cho ngƣời khác cũng khác nhau, tùy thuộc vào: số lƣợng vi sinh vật thoát ra ngoài môi trƣờng, mật độ vi sinh vật trong không khí, thời gian vật chủ phơi nhiễm không khí đã bị ô nhiễm, tình trạng miễn dịch của từng cá thể. Bệnh nhân nhiễm HIV và những bệnh nhân rối loạn miễn dịch qua trung gian tế bào thì bệnh càng trầm trọng khi bị nhiễm MTB. Tuy vậy khả năng lan truyền bệnh của những bệnh nhân này không cao [2, 3]. MTB tồn tại trong các hạt khí dung nhỏ lơ lửng ngoài không khí.
Khi đƣợc hít vào, vi khuẩn sẽ đi vào phổi, đến phế nang. Tại đây, vi khuẩn sẽ nhân lên hoặc bị ức chế tuỳ thuộc vào tình trạng hệ thống miễn dịch của cơ thể. Trong vòng 2-10 tuần, các đại thực bào đƣợc hoạt hoá, bao quanh vi khuẩn tạo nên lớp vỏ cứng giúp kìm hãm và kiểm soát vi khuẩn (giai đoạn lao nhiễm). Nếu hệ thống miễn dịch của cơ thể không thể kiểm soát đƣợc vi khuẩn, vi khuẩn sẽ nhân lên nhanh chóng và có thể theo đƣờng máu và đƣờng bạch huyết tấn công vào các bộ phận khác nhau nhƣ phổi, thận, não, xƣơng (giai đoạn lao bệnh) [2, 3].
MTB có cơ chế đặc biệt để tấn công vào tế bào. MTB có thể gắn trực tiếp vào thụ thể mannose trên đại thực bào nhờ glycolipid đã đƣợc mannose hoá trên vách, hoặc nhờ lipoarabinomannan, hay gắn gián tiếp nhờ thụ thể bổ thể, thụ thể Fc. Thông thƣờng khi vật lạ bị đại thực bào bắt giữ sẽ bị cơ chế thực bào qua trung gian chất oxy hoá tiêu diệt. MTB biến đổi cơ chế gây độc này, ngăn cản sự kết hợp phagosome với lysosome.