Nghiên Cứu Và Thử Nghiệm Hạt Nano Kim Loại Được Chức Năng Hóa Bề Mặt Trong Chẩn Đoán Vi Khuẩn Lao

Nghiên cứu hạt nano kim loại chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán vi khuẩn lao, mang lại tiềm năng mới cho y học và công nghệ sinh học.

• Tác giả: Chử Lương Luân
• Người hướng dẫn: PGS. Phan Tuấn Nghĩa
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Và Thử Nghiệm Hạt Nano Kim Loại Được Chức Năng Hóa Bề Mặt Trong Chẩn Đoán Vi Khuẩn Lao
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LAO
• 1.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn lao
• 1.1.2. Hệ gene vi khuẩn lao
• 1.1.3. Khả năng gây bệnh và tình hình bệnh lao
• 1.2. Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn lao
• 1.3. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ HẠT NANO KIM LOẠI
• 1.3.1. Tính chất của hạt nano kim loại
• 1.3.2. Một số loại hạt nano kim loại
• 1.3.3. Ứng dụng của hạt nano kim loại trong y học
• 1.4. CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT HẠT NANO TỪ, GẮN KẾT VÀ LÀM GIÀU TẾ BÀO VI KHUẨN LAO
• 1.4.1. Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ
• 1.4.2. Quá trình gắn kết hạt nano từ với kháng thể kháng lao
• 1.4.3. Làm giàu tế bào vi khuẩn lao bằng từ trường
• 1.5. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 1.5.1. Mẫu đờm lao và vaccine BCG
• 1.5.2. Hạt nano kim loại có từ tính
• 1.5.3. Mồi đặc hiệu
• 1.5.4. Các hóa chất và nguyên liệu khác
• 1.5.5. Máy móc và thiết bị
• 2. PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Phương pháp chấm kết tủa miễn dịch
• 2.2. Phương pháp gắn kết hạt nano từ đã được chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao
• 2.3. Phương pháp làm giàu vi khuẩn lao để làm khuôn cho phản ứng PCR
• 2.4. Phương pháp ly giải tế bào vi khuẩn lao thu ADN
• 2.5. Đánh giá độ bền của phức hệ hạt từ gắn kháng thể kháng lao
• 2.6. Nhân bản đoạn gen đích đặc hiệu bằng PCR
• 2.7. Điện di trên gel agarose
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN GẮN KHÁNG THỂ LÊN BỀ MẶT HẠT NANO TỪ TRÊN BCG
• 3.1.1. Kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng lao
• 3.1.2. Kiểm tra hiệu suất phản ứng gắn kết trong các đệm khác nhau
• 3.1.3. Kết quả ly giải tế bào vi khuẩn lao bằng các phương pháp khác nhau
• 3.1.4. Tối ưu hóa nồng độ BCG sử dụng
• 3.1.5. Tối ưu hóa thời gian phản ứng gắn kết
• 3.1.6. Độ đặc hiệu của phương pháp
• 3.2. THỬ NGHIỆM CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU LÊN MẪU BỆNH PHẨM
• 3.3. ĐÁNH GIÁ ĐỘ BỀN CỦA PHỨC HỆ HẠT NANO TỪ GẮN KHÁNG THỂ KHÁNG LAO
• KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Hạt Nano Kim Loại và Bệnh Lao

Bệnh lao, do vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis (MTB) gây ra, vẫn là một thách thức lớn toàn cầu. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng một phần ba dân số thế giới nhiễm MTB, với hàng triệu ca tử vong mỗi năm. Chẩn đoán sớm là yếu tố then chốt để điều trị hiệu quả và ngăn ngừa lây lan. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như soi trực tiếp và nuôi cấy vi khuẩn có những hạn chế về độ nhạy và thời gian. Do đó, việc ứng dụng các công nghệ mới, đặc biệt là công nghệ nano y học, hứa hẹn mang lại những đột phá trong chẩn đoán bệnh lao. Nghiên cứu hạt nano kim loại, đặc biệt là ứng dụng hạt nano được chức năng hóa bề mặt, đang mở ra hướng đi mới đầy tiềm năng trong lĩnh vực này. Luận văn của Chử Lương Luân đã đi sâu vào nghiên cứu và thử nghiệm hạt nano kim loại trong chẩn đoán vi khuẩn lao, đánh dấu một bước tiến quan trọng trong việc ứng dụng vật liệu nano vào y học.

1.1. Tầm quan trọng của chẩn đoán sớm vi khuẩn lao

Chẩn đoán sớm vi khuẩn lao là yếu tố then chốt để điều trị hiệu quả và ngăn ngừa lây lan. Phát hiện muộn dẫn đến khó khăn trong điều trị và tăng nguy cơ lây nhiễm cho cộng đồng. Các phương pháp truyền thống thường đòi hỏi số lượng vi khuẩn lớn hoặc thời gian kéo dài, gây ảnh hưởng đến quá trình điều trị. Theo WHO, việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời có thể giảm đáng kể tỷ lệ tử vong do lao. Do đó, việc tìm kiếm các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, chính xác và hiệu quả là vô cùng quan trọng.

1.2. Giới thiệu về hạt nano kim loại và tiềm năng ứng dụng

Hạt nano kim loại có kích thước siêu nhỏ, mang lại những tính chất độc đáo so với vật liệu thông thường. Chúng có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là y học. Trong chẩn đoán, hạt nano có thể được sử dụng để phát hiện các dấu ấn sinh học của bệnh, tăng cường độ nhạy của xét nghiệm và rút ngắn thời gian chẩn đoán. Hạt nano vàng, hạt nano bạc, và hạt nano đồng là những loại hạt nano kim loại phổ biến được nghiên cứu và ứng dụng trong chẩn đoán bệnh. Nghiên cứu của Chử Lương Luân tập trung vào hạt nano kim loại có từ tính, mở ra khả năng tách chiết và làm giàu vi khuẩn lao.

1.3. Mục tiêu nghiên cứu và phạm vi của luận văn

Luận văn của Chử Lương Luân tập trung vào việc xây dựng quy trình gắn kết hạt nano kim loại có từ tính với kháng thể kháng vi khuẩn lao. Mục tiêu chính là đánh giá khả năng làm giàu MTB bằng hạt nano kim loại đã được chức năng hóa bề mặt, từ đó phát hiện MTB bằng kỹ thuật PCR. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, chính xác và hiệu quả hơn cho bệnh lao. Phạm vi nghiên cứu bao gồm tổng hợp hạt nano, chức năng hóa bề mặt, gắn kết kháng thể, thử nghiệm trên mẫu bệnh phẩm và đánh giá độ bền của phức hệ hạt nano.

II. Thách Thức Chẩn Đoán Lao Giải Pháp Hạt Nano Kim Loại

Các phương pháp chẩn đoán lao truyền thống, như soi trực tiếp và nuôi cấy, đối mặt với nhiều hạn chế. Soi trực tiếp có độ nhạy thấp, đặc biệt khi số lượng vi khuẩn lao trong mẫu bệnh phẩm ít. Nuôi cấy mất nhiều thời gian, thường từ 4-6 tuần, gây chậm trễ trong việc điều trị. Các phương pháp sinh học phân tử như PCR có độ nhạy cao hơn, nhưng vẫn cần cải thiện về quy trình và chi phí. Hạt nano kim loại hứa hẹn giải quyết những thách thức này bằng cách tăng cường độ nhạy, rút ngắn thời gian và giảm chi phí chẩn đoán. Việc sử dụng hạt nano để làm giàu vi khuẩn lao trước khi thực hiện các xét nghiệm sinh học phân tử có thể cải thiện đáng kể hiệu quả chẩn đoán.

2.1. Hạn chế của phương pháp soi trực tiếp và nuôi cấy vi khuẩn

Soi trực tiếp có độ nhạy thấp, chỉ phát hiện được khi số lượng vi khuẩn lao trong mẫu bệnh phẩm đạt ngưỡng nhất định. Điều này dẫn đến bỏ sót các trường hợp bệnh nhân có số lượng vi khuẩn thấp, đặc biệt là ở giai đoạn sớm của bệnh. Nuôi cấy mất nhiều thời gian, thường từ 4-6 tuần, gây chậm trễ trong việc điều trị và có thể làm tăng nguy cơ lây lan bệnh. Ngoài ra, nuôi cấy đòi hỏi trang thiết bị và kỹ thuật viên có trình độ cao, làm tăng chi phí chẩn đoán.

2.2. Ưu điểm của phương pháp PCR trong chẩn đoán lao

PCR (phản ứng chuỗi polymerase) là một phương pháp sinh học phân tử có độ nhạy cao, có thể phát hiện vi khuẩn lao ngay cả khi số lượng rất ít trong mẫu bệnh phẩm. PCR cũng có thời gian thực hiện nhanh hơn so với nuôi cấy, thường chỉ mất vài giờ. Tuy nhiên, PCR vẫn có những hạn chế nhất định, như chi phí cao và yêu cầu trang thiết bị hiện đại. Ngoài ra, PCR có thể cho kết quả dương tính giả nếu quy trình thực hiện không được kiểm soát chặt chẽ.

2.3. Vai trò của hạt nano kim loại trong nâng cao độ nhạy PCR

Hạt nano kim loại có thể được sử dụng để làm giàu vi khuẩn lao trước khi thực hiện PCR, giúp tăng cường độ nhạy của xét nghiệm. Bằng cách gắn kết hạt nano với kháng thể đặc hiệu cho vi khuẩn lao, có thể tách chiết và tập trung vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm. Điều này giúp tăng số lượng vi khuẩn lao trong mẫu PCR, từ đó cải thiện khả năng phát hiện bệnh. Ngoài ra, hạt nano cũng có thể được sử dụng để phát hiện trực tiếp sản phẩm PCR, giúp tăng cường độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm.

III. Phương Pháp Chức Năng Hóa Hạt Nano Kim Loại Hiệu Quả

Để hạt nano kim loại có thể ứng dụng hiệu quả trong chẩn đoán vi khuẩn lao, việc chức năng hóa bề mặt là vô cùng quan trọng. Chức năng hóa bề mặt giúp gắn kết hạt nano với các phân tử sinh học như kháng thể, aptamer, hoặc DNA, tạo ra các phức hợp có khả năng nhận diện và tương tác đặc hiệu với vi khuẩn lao. Quá trình này đòi hỏi sự lựa chọn cẩn thận các chất chức năng hóa, phương pháp gắn kết và điều kiện phản ứng để đảm bảo hiệu quả và độ ổn định của phức hợp hạt nano.

3.1. Tại sao cần chức năng hóa bề mặt hạt nano kim loại

Chức năng hóa bề mặt hạt nano kim loại là cần thiết để tạo ra các phức hợp có khả năng nhận diện và tương tác đặc hiệu với vi khuẩn lao. Bề mặt hạt nano thường trơ về mặt hóa học, không có khả năng gắn kết với các phân tử sinh học. Chức năng hóa bề mặt giúp tạo ra các nhóm chức năng trên bề mặt hạt nano, cho phép gắn kết với các phân tử sinh học như kháng thể, aptamer, hoặc DNA. Điều này giúp hạt nano có thể được sử dụng để phát hiện, tách chiết, hoặc tiêu diệt vi khuẩn lao.

3.2. Các phương pháp chức năng hóa bề mặt hạt nano phổ biến

Có nhiều phương pháp chức năng hóa bề mặt hạt nano kim loại khác nhau, tùy thuộc vào loại hạt nano, chất chức năng hóa và ứng dụng cụ thể. Một số phương pháp phổ biến bao gồm sử dụng các phân tử liên kết như APTS (3-aminopropyl triethoxysilane), EDC/NHS (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride/N-hydroxysuccinimide), hoặc sử dụng các lớp phủ polyme. Việc lựa chọn phương pháp chức năng hóa phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả và độ ổn định của phức hợp hạt nano.

3.3. Quy trình gắn kết kháng thể kháng lao lên hạt nano kim loại

Quy trình gắn kết kháng thể kháng lao lên hạt nano kim loại thường bao gồm các bước sau: (1) Chức năng hóa bề mặt hạt nano bằng các nhóm chức năng như amine hoặc carboxyl; (2) Hoạt hóa các nhóm chức năng bằng các chất hoạt hóa như EDC/NHS; (3) Gắn kết kháng thể kháng lao lên bề mặt hạt nano thông qua các liên kết hóa học. Sau khi gắn kết, cần kiểm tra hiệu quả gắn kết và độ đặc hiệu của phức hợp hạt nano.

IV. Ứng Dụng Hạt Nano Kim Loại Làm Giàu Vi Khuẩn Lao PCR

Một trong những ứng dụng quan trọng của hạt nano kim loại trong chẩn đoán lao là làm giàu vi khuẩn lao từ mẫu bệnh phẩm. Bằng cách gắn kết hạt nano với kháng thể đặc hiệu, có thể tách chiết và tập trung vi khuẩn lao từ các mẫu có số lượng vi khuẩn thấp. Quá trình này giúp tăng độ nhạy của các xét nghiệm sinh học phân tử như PCR, cho phép phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm và cải thiện hiệu quả điều trị.

4.1. Nguyên tắc làm giàu vi khuẩn lao bằng hạt nano từ tính

Nguyên tắc làm giàu vi khuẩn lao bằng hạt nano từ tính dựa trên việc sử dụng lực từ để tách chiết và tập trung vi khuẩn lao từ mẫu bệnh phẩm. Hạt nano từ tính được gắn kết với kháng thể đặc hiệu cho vi khuẩn lao. Khi trộn hạt nano với mẫu bệnh phẩm, kháng thể sẽ gắn kết với vi khuẩn lao. Sau đó, sử dụng nam châm để hút hạt nano từ tính, kéo theo vi khuẩn lao đã gắn kết. Quá trình này giúp loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu bệnh phẩm và tập trung vi khuẩn lao.

4.2. Quy trình làm giàu vi khuẩn lao và thực hiện phản ứng PCR

Quy trình làm giàu vi khuẩn lao và thực hiện phản ứng PCR bao gồm các bước sau: (1) Trộn hạt nano từ tính đã gắn kháng thể với mẫu bệnh phẩm; (2) Ủ hỗn hợp để kháng thể gắn kết với vi khuẩn lao; (3) Sử dụng nam châm để tách chiết hạt nano và vi khuẩn lao; (4) Rửa hạt nano để loại bỏ các thành phần không mong muốn; (5) Ly giải vi khuẩn lao để thu DNA; (6) Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại DNA và phát hiện vi khuẩn lao.

4.3. Đánh giá hiệu quả làm giàu và độ nhạy của phương pháp

Hiệu quả làm giàu vi khuẩn lao có thể được đánh giá bằng cách so sánh số lượng vi khuẩn lao trước và sau khi làm giàu. Độ nhạy của phương pháp có thể được đánh giá bằng cách xác định giới hạn phát hiện của PCR sau khi làm giàu. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả làm giàu bao gồm nồng độ hạt nano, thời gian ủ, lực từ và độ đặc hiệu của kháng thể.

V. Kết Quả Nghiên Cứu và Thảo Luận Về Hạt Nano Kim Loại

Nghiên cứu của Chử Lương Luân đã đạt được những kết quả đáng khích lệ trong việc ứng dụng hạt nano kim loại trong chẩn đoán vi khuẩn lao. Quy trình gắn kết hạt nano với kháng thể đã được tối ưu hóa, cho phép làm giàu vi khuẩn lao hiệu quả từ mẫu bệnh phẩm. Kết quả PCR cho thấy độ nhạy cao hơn so với các phương pháp truyền thống. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều vấn đề cần được nghiên cứu sâu hơn để hoàn thiện phương pháp và ứng dụng rộng rãi trong thực tế.

5.1. Tối ưu hóa điều kiện gắn kết kháng thể lên bề mặt hạt nano

Nghiên cứu đã tập trung vào việc tối ưu hóa các điều kiện gắn kết kháng thể lên bề mặt hạt nano, bao gồm nồng độ kháng thể, thời gian phản ứng, pH và nhiệt độ. Kết quả cho thấy các điều kiện tối ưu giúp tăng cường hiệu quả gắn kết và độ đặc hiệu của phức hợp hạt nano.

5.2. Đánh giá độ bền của phức hệ hạt nano từ gắn kháng thể

Độ bền của phức hệ hạt nano từ gắn kháng thể là một yếu tố quan trọng để đảm bảo hiệu quả của phương pháp. Nghiên cứu đã đánh giá độ bền của phức hệ trong các điều kiện khác nhau, bao gồm nhiệt độ, pH và thời gian bảo quản. Kết quả cho thấy phức hệ có độ bền tương đối cao, có thể được bảo quản trong thời gian dài mà không ảnh hưởng đến hiệu quả.

5.3. Thử nghiệm trên mẫu bệnh phẩm và so sánh với phương pháp khác

Phương pháp sử dụng hạt nano đã được thử nghiệm trên mẫu bệnh phẩm thực tế và so sánh với các phương pháp chẩn đoán truyền thống. Kết quả cho thấy phương pháp mới có độ nhạy cao hơn và thời gian thực hiện nhanh hơn so với các phương pháp truyền thống. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng của phương pháp trong chẩn đoán nhanh chóng và chính xác bệnh lao.

VI. Triển Vọng và Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Hạt Nano Lao

Nghiên cứu về hạt nano kim loại trong chẩn đoán vi khuẩn lao mở ra nhiều triển vọng trong tương lai. Các hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc phát triển các loại hạt nano mới với tính chất ưu việt hơn, tối ưu hóa quy trình chức năng hóa và gắn kết, và ứng dụng phương pháp trong chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm khác. Sự kết hợp giữa công nghệ nano và sinh học phân tử hứa hẹn mang lại những đột phá trong lĩnh vực chẩn đoán và điều trị bệnh.

6.1. Phát triển các loại hạt nano kim loại mới cho chẩn đoán lao

Các nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc phát triển các loại hạt nano kim loại mới với tính chất ưu việt hơn, như kích thước nhỏ hơn, độ ổn định cao hơn, và khả năng tương tác sinh học tốt hơn. Các loại hạt nano composite, kết hợp nhiều loại vật liệu khác nhau, cũng có thể mang lại những tính chất độc đáo và ứng dụng hiệu quả hơn.

6.2. Tối ưu hóa quy trình chức năng hóa và gắn kết kháng thể

Việc tối ưu hóa quy trình chức năng hóa và gắn kết kháng thể là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả và độ ổn định của phức hợp hạt nano. Các nghiên cứu có thể tập trung vào việc tìm kiếm các chất chức năng hóa mới, phương pháp gắn kết hiệu quả hơn, và điều kiện phản ứng tối ưu.

6.3. Ứng dụng hạt nano kim loại trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm

Hạt nano kim loại có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm khác, như HIV, viêm gan, và sốt xuất huyết. Bằng cách gắn kết hạt nano với các kháng thể hoặc aptamer đặc hiệu cho các tác nhân gây bệnh, có thể phát triển các phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, chính xác và hiệu quả.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh lao do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis (MTB) gây ra là một trong ba bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ tử vong cao nhất toàn cầu, với khoảng 1,7 triệu người tử vong mỗi năm, tương đương khoảng 4700 người mỗi ngày theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong tiêm chủng vaccine BCG và phát triển thuốc điều trị, bệnh lao vẫn là thách thức lớn do khả năng phát hiện muộn và sự xuất hiện của các chủng đa kháng thuốc. Việc chẩn đoán sớm MTB đóng vai trò then chốt trong kiểm soát và điều trị bệnh, tuy nhiên các phương pháp truyền thống như soi kính hiển vi và nuôi cấy vi khuẩn thường mất nhiều thời gian (4-6 tuần) và yêu cầu số lượng vi khuẩn lớn.

Trong bối cảnh đó, công nghệ nano, đặc biệt là hạt nano kim loại có từ tính được chức năng hóa bề mặt, đã mở ra hướng đi mới trong chẩn đoán vi khuẩn lao với ưu điểm rút ngắn thời gian, tăng độ nhạy và độ đặc hiệu. Luận văn này tập trung nghiên cứu và thử nghiệm hạt nano kim loại từ tính được chức năng hóa bề mặt để gắn kết với kháng thể kháng MTB, nhằm làm giàu và phát hiện vi khuẩn lao trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật PCR. Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn 2010-2012 tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, với mục tiêu xây dựng quy trình gắn kết hạt nano từ với kháng thể và đánh giá hiệu quả làm giàu MTB, góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán bệnh lao tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết về vi khuẩn lao (MTB): MTB là vi khuẩn hiếu khí, phân chia chậm (16-20 giờ/lần), có thành tế bào chứa acid mycolic đặc trưng, giúp kháng thuốc và tồn tại lâu trong môi trường. Hệ gene MTB gồm khoảng 4.000 gene với tỷ lệ GC cao (~65%), trong đó đoạn IS6110 là trình tự đặc hiệu dùng làm mồi trong PCR để phát hiện MTB.

• Lý thuyết về hạt nano kim loại có từ tính: Hạt nano Fe3O4 có kích thước khoảng 20 nm, có tính siêu thuận từ, được chức năng hóa bề mặt bằng nhóm amine (NP-NH2) qua phản ứng thủy phân organosilane (APTS). Lớp phủ này giúp hạt nano liên kết bền vững với kháng thể và tăng tính ổn định trong dung môi.

• Mô hình gắn kết hạt nano từ với kháng thể: Sử dụng cầu nối trung gian EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) để tạo liên kết amide giữa nhóm amine trên hạt nano và nhóm carboxyl trên kháng thể anti-TB, đảm bảo phức hợp bền vững và giữ hoạt tính kháng thể.

• Khái niệm làm giàu tế bào vi khuẩn bằng từ trường: Các hạt nano từ tính gắn kháng thể đặc hiệu sẽ liên kết với vi khuẩn MTB trong mẫu bệnh phẩm, sau đó được tập trung bằng từ trường, giúp làm giàu và tách biệt vi khuẩn để tăng độ nhạy cho phản ứng PCR.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu đờm lao của bệnh nhân được cung cấp từ Viện Quân Y 103, đã được kiểm tra sơ bộ bằng phương pháp soi trực tiếp. Vaccine BCG dạng đông khô do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp được sử dụng làm mẫu chuẩn.

• Chế tạo hạt nano từ tính: Hạt nano Fe3O4 kích thước ~20 nm được tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa ion Fe3+ và Fe2+ trong môi trường khí N2 ở 90°C, sau đó chức năng hóa bề mặt bằng APTS để tạo nhóm amine.

• Gắn kết kháng thể lên hạt nano: Sử dụng cầu nối EDC để gắn kháng thể đa dòng anti-TB lên bề mặt hạt nano từ tính NP-NH2. Các điều kiện tối ưu về nồng độ EDC, kháng thể và loại đệm (MES, PBS với pH từ 4,5 đến 7,4) được khảo sát.

• Làm giàu vi khuẩn lao: Phức hợp hạt nano từ - kháng thể được ủ với mẫu đờm hoặc vaccine BCG trong 45 phút, sau đó tập trung bằng từ trường để thu nhận vi khuẩn.

• Ly giải tế bào và tách chiết ADN: Nghiên cứu so sánh 4 phương pháp ly giải tế bào khác nhau, sử dụng các loại đệm TE, TET, nước cất và kết hợp xử lý nhiệt 100°C trong 20 phút để thu ADN làm khuôn cho PCR.

• Phản ứng PCR: Sử dụng mồi đặc hiệu IS6110 (249 bp) để nhân bản ADN MTB. Phản ứng PCR được thực hiện với enzyme Taq polymerase hoặc Dream Taq polymerase, sản phẩm được phân tích bằng điện di gel agarose 2%.

• Đánh giá hiệu quả: Sử dụng phương pháp Dot blot để kiểm tra sự có mặt và mức độ gắn kết kháng thể trên hạt nano, phân tích hình ảnh bằng phần mềm Image J để định lượng độ sáng vết đốm. Kết quả PCR được đánh giá dựa trên sự xuất hiện băng ADN đặc hiệu.

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành trong khoảng thời gian 2010-2012, bao gồm các bước tổng hợp hạt nano, tối ưu hóa gắn kết, thử nghiệm làm giàu vi khuẩn, ly giải tế bào và phân tích PCR.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Xác định sự có mặt và hiệu quả gắn kết kháng thể anti-TB trên hạt nano từ:

   • Phương pháp Dot blot cho thấy kháng thể anti-TB có khả năng nhận biết đặc hiệu với mẫu vaccine BCG, với độ nhạy giảm dần theo nồng độ pha loãng từ 1:2 đến 1:50.
   • Phân tích bằng phần mềm Image J cho thấy mức độ gắn kết kháng thể lên hạt nano dao động từ 31% đến 41%, cao nhất ở đệm PBS pH 6,5 (41%).

2. Tối ưu điều kiện gắn kết hạt nano từ với kháng thể:

   • Tỷ lệ tối ưu giữa đệm gắn kết : kháng thể : EDC là 71:2:2 (µl).
   • Đệm PBS pH 6,5 và MES pH 6,5 được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo do hiệu suất gắn kết cao và ổn định.

3. Hiệu quả ly giải tế bào và tách chiết ADN:

   • Trong 4 phương pháp ly giải, phương pháp sử dụng đệm TE hoặc TET kết hợp xử lý nhiệt 100°C trong 20 phút cho kết quả tốt nhất, với băng ADN đặc hiệu 249 bp rõ nét trên gel agarose.
   • Phương pháp ly giải bằng nước cất hoặc không có EDTA cho hiệu quả thấp hơn, thể hiện qua băng ADN mờ hoặc không rõ.

4. Tối ưu nồng độ mẫu BCG và thời gian phản ứng gắn kết:

   • Nồng độ BCG tối ưu để phát hiện bằng PCR sau làm giàu là khoảng 4x10^-5 mg/ml, với băng ADN đặc hiệu vẫn rõ nét.
   • Thời gian ủ phức hợp hạt nano từ - kháng thể tối ưu là 30 phút, cho kết quả PCR tốt hơn so với 15 hoặc 60 phút.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc chức năng hóa bề mặt hạt nano từ tính bằng nhóm amine và gắn kết kháng thể anti-TB qua cầu nối EDC là phương pháp hiệu quả để tạo phức hợp bền vững, có khả năng làm giàu vi khuẩn lao trong mẫu bệnh phẩm. Việc lựa chọn đệm PBS pH 6,5 phù hợp với điều kiện phản ứng gắn kết giúp tăng hiệu suất liên kết và ổn định phức hợp trong quá trình bảo quản.

Phương pháp ly giải tế bào kết hợp xử lý nhiệt và sử dụng đệm chứa EDTA giúp bảo vệ ADN khỏi sự phân hủy bởi nuclease, đồng thời phá vỡ thành tế bào MTB có cấu trúc phức tạp, từ đó nâng cao hiệu quả tách chiết ADN làm khuôn cho PCR. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về tách chiết ADN MTB.

Việc tối ưu nồng độ mẫu và thời gian phản ứng gắn kết giúp rút ngắn quy trình, tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp chẩn đoán. Các dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh mức độ gắn kết kháng thể trên các loại đệm khác nhau, hình ảnh gel điện di PCR với các điều kiện ly giải và nồng độ mẫu khác nhau, cũng như biểu đồ thời gian phản ứng gắn kết so với cường độ băng PCR.

So với các phương pháp truyền thống, kỹ thuật sử dụng hạt nano từ tính chức năng hóa bề mặt kết hợp PCR cho phép phát hiện MTB nhanh chóng, chính xác với lượng vi khuẩn thấp, góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán và kiểm soát bệnh lao.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Ứng dụng quy trình gắn kết hạt nano từ tính với kháng thể anti-TB trong chẩn đoán lâm sàng:

   • Triển khai tại các phòng xét nghiệm chuyên khoa để làm giàu vi khuẩn lao từ mẫu đờm, rút ngắn thời gian chẩn đoán PCR xuống còn vài giờ.
   • Thời gian thực hiện: 6-12 tháng để đào tạo và chuyển giao công nghệ.

2. Phát triển bộ kit chẩn đoán dựa trên hạt nano từ tính chức năng hóa bề mặt:

   • Thiết kế bộ kit chuẩn hóa quy trình gắn kết, làm giàu và ly giải ADN, giúp các cơ sở y tế dễ dàng áp dụng.
   • Chủ thể thực hiện: các công ty công nghệ sinh học phối hợp với viện nghiên cứu.
   • Thời gian: 1-2 năm để nghiên cứu và thương mại hóa.

3. Nâng cao năng lực kỹ thuật và đào tạo nhân viên y tế:

   • Tổ chức các khóa đào tạo về kỹ thuật nano và PCR cho cán bộ xét nghiệm nhằm đảm bảo chất lượng và độ tin cậy của kết quả.
   • Thời gian: liên tục, ưu tiên trong 12 tháng đầu triển khai.

4. Mở rộng nghiên cứu ứng dụng hạt nano từ tính trong phát hiện các chủng MTB đa kháng thuốc:

   • Kết hợp với phân tích gen đột biến kháng thuốc để phát hiện sớm các chủng nguy hiểm.
   • Chủ thể thực hiện: viện nghiên cứu và bệnh viện chuyên khoa.
   • Thời gian: 2-3 năm nghiên cứu và thử nghiệm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Sinh học phân tử, Công nghệ nano y sinh:

   • Hiểu rõ về ứng dụng hạt nano từ tính trong chẩn đoán vi khuẩn lao, phương pháp chức năng hóa bề mặt và kỹ thuật PCR.
   • Use case: phát triển các đề tài nghiên cứu liên quan đến chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.

2. Bác sĩ và kỹ thuật viên phòng xét nghiệm chuyên khoa lao:

   • Nắm bắt quy trình làm giàu vi khuẩn lao bằng hạt nano từ tính để nâng cao độ nhạy xét nghiệm PCR.
   • Use case: áp dụng kỹ thuật mới trong chẩn đoán lâm sàng, rút ngắn thời gian chẩn đoán.

3. Các nhà quản lý y tế và hoạch định chính sách:

   • Đánh giá tiềm năng ứng dụng công nghệ nano trong chương trình phòng chống lao quốc gia.
   • Use case: xây dựng kế hoạch đầu tư trang thiết bị và đào tạo nhân lực.

4. Công ty công nghệ sinh học và sản xuất kit xét nghiệm:

   • Tham khảo quy trình chuẩn hóa gắn kết hạt nano từ với kháng thể và tối ưu hóa điều kiện phản ứng.
   • Use case: phát triển sản phẩm kit chẩn đoán nhanh, chính xác cho thị trường trong nước và quốc tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Hạt nano từ tính được chức năng hóa bề mặt như thế nào để gắn kháng thể?
   Hạt nano Fe3O4 được phủ lớp silica chứa nhóm amine bằng phản ứng thủy phân organosilane (APTS). Kháng thể anti-TB được gắn lên bề mặt hạt qua cầu nối EDC tạo liên kết amide giữa nhóm amine trên hạt và nhóm carboxyl trên kháng thể, đảm bảo phức hợp bền vững và giữ hoạt tính kháng thể.

2. Phương pháp làm giàu vi khuẩn lao bằng hạt nano từ có ưu điểm gì?
   Phương pháp này giúp tập trung vi khuẩn MTB từ mẫu bệnh phẩm nhờ liên kết đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và lực từ trường, tăng độ nhạy cho phản ứng PCR, rút ngắn thời gian chẩn đoán so với nuôi cấy truyền thống.

3. Tại sao cần tối ưu đệm và pH trong phản ứng gắn kết?
   Đệm và pH ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt hóa nhóm carboxyl và hình thành liên kết amide qua EDC. Nghiên cứu cho thấy pH từ 4,5 đến 7,5 là khoảng tối ưu, trong đó PBS pH 6,5 cho hiệu suất gắn kết cao nhất (41%).

4. Phương pháp ly giải tế bào nào hiệu quả nhất để tách ADN MTB?
   Phương pháp sử dụng đệm TE hoặc TET kết hợp xử lý nhiệt 100°C trong 20 phút cho hiệu quả ly giải và tách chiết ADN tốt nhất, giúp thu được ADN chất lượng cao làm khuôn cho PCR.

5. Kỹ thuật PCR sử dụng mồi IS6110 có đặc điểm gì?
   Mồi IS6110 dài 249 bp đặc hiệu cho đoạn trình tự bảo thủ trên hệ gene MTB, giúp phát hiện chính xác vi khuẩn lao với độ nhạy cao, kể cả khi số lượng vi khuẩn trong mẫu rất thấp.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công quy trình chức năng hóa bề mặt hạt nano từ tính Fe3O4 bằng nhóm amine và gắn kết kháng thể anti-TB qua cầu nối EDC với hiệu suất gắn kết lên đến 41% ở đệm PBS pH 6,5.
• Phương pháp làm giàu vi khuẩn lao bằng phức hợp hạt nano từ - kháng thể giúp tăng độ nhạy phát hiện MTB trong mẫu đờm bằng kỹ thuật PCR.
• Phương pháp ly giải tế bào sử dụng đệm TE hoặc TET kết hợp xử lý nhiệt 100°C trong 20 phút cho hiệu quả tách chiết ADN tốt nhất, đảm bảo chất lượng mẫu cho PCR.
• Tối ưu nồng độ mẫu BCG và thời gian phản ứng gắn kết giúp rút ngắn quy trình chẩn đoán, tăng độ chính xác và khả năng ứng dụng thực tiễn.
• Đề xuất triển khai ứng dụng kỹ thuật này trong các phòng xét nghiệm chuyên khoa lao, phát triển bộ kit chẩn đoán và mở rộng nghiên cứu ứng dụng trong phát hiện các chủng đa kháng thuốc.

Khuyến khích các cơ sở y tế và viện nghiên cứu phối hợp triển khai thử nghiệm lâm sàng, đồng thời phát triển sản phẩm thương mại dựa trên công nghệ hạt nano từ tính chức năng hóa bề mặt để nâng cao hiệu quả chẩn đoán và kiểm soát bệnh lao tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Bệnh lao là một trong ba bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất thế giới, bệnh đƣợc gây ra bởi vi khuẩn lao có tên khoa học là Mycobacterium tuberculosis (MTB). Tổ chức Y tế thế giới (WHO) ƣớc tính khoảng 1/3 dân số toàn cầu hiện nay đã bị nhiễm MTB và có khoảng 1,7 triệu ngƣời tử vong do lao hàng năm, tức là khoảng 4700 ngƣời tử vong mỗi ngày vì lao. Mặc dù công tác tiêm chủng vaccine BCG, phòng chống và phát triển thuốc chống lại vi khuẩn lao đã có những bƣớc tiến đáng kể nhƣng cho đến nay bệnh lao vẫn là một vấn đề sức khỏe có tính thách thức đối với toàn cầu. Bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn lao nếu phát hiện muộn sẽ rất khó điều trị và tăng nguy cơ lây truyền sang ngƣời lành.

Do đó việc chẩn đoán sớm các chủng vi khuẩn lao sẽ góp phần đáng kể trong điều trị bệnh lao [1, 33]. Để chẩn đoán vi khuẩn lao, hiện nay bệnh viện và các cơ sở y tế trong nƣớc vẫn phải dựa vào các phƣơng pháp cổ điển nhƣ soi trực tiếp, nuôi cấy vi khuẩn…, yêu cầu số lƣợng vi khuẩn lao lớn hoặc thời gian chẩn đoán lao cần ít nhất 4 – 6 tuần. Với những nhƣợc điểm nhƣ vậy sẽ khó khăn cho công tác điều trị, khó đáp ứng yêu cầu giám sát và thanh toán bệnh lao [2, 3]. Khắc phục những nhƣợc điểm đó, việc ứng dụng sinh học phân tử kết hợp công nghệ nano đang tạo ra những đột phá trong chẩn đoán vi khuẩn lao cũng nhƣ các chủng vi khuẩn khác.

Thời gian chẩn đoán có thể rút ngắn xuống còn vài ngày, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho việc kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn [23, 25]. Công nghệ nano ngày nay đang có những bƣớc tiến quan trọng trong chẩn đoán và hỗ trợ điều trị bệnh nhằm mục đích cải thiện và nâng cao sức khỏe của con ngƣời. Trong số đó, các hạt nano kim loại đặc biệt là hạt nano kim loại có từ tính đƣợc chức năng hóa bề mặt đã và đang đƣợc nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi trong Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 z Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân những năm gần đây, ví dụ nhƣ phân tách tế bào, tách chiết acid nucleic (ADN, ARN), gắn kết với kháng thể…[5, 27]. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu và thử nghiệm hạt nano kim loại đƣợc chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán vi khuẩn lao” với các mục tiêu sau : Xây dựng quy trình gắn kết hạt nano kim loại có từ tính đã đƣợc chức năng hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao và đánh giá khả năng làm giàu MTB bằng hạt nano kim loại có từ tính đã đƣợc chức năng hóa bề mặt gắn anti-TB để phát hiện MTB bằng kỹ thuật PCR.

Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 z Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LAO Vi khuẩn lao do Robert Koch tìm ra năm 1882, vì vậy còn đƣợc gọi là Bacilie de Koch (viết tắt là BK). Đã hơn một thế kỷ kể từ khi phát hiện ra vi khuẩn lao, nhờ việc áp dụng các kỹ thuật hiện đại trong hóa sinh, miễn dịch, sinh học phân tử…cùng với kính hiển vi điện tử, ngƣời ta đã hiểu tƣơng đối rõ về cấu trúc, đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh của vi khuẩn lao.

Tuy nhiên, vi khuẩn lao vẫn là đối tƣợng nghiên cứu của nhiều công trình khoa học vì sự tinh vi trong siêu cấu trúc, tính chất phức tạp của các kháng nguyên, sự đa dạng trong hình thức tồn tại, nhất là những đột biến gen khi vi khuẩn kháng thuốc [2, 3]. Đặc điểm của vi khuẩn lao Tác nhân gây bệnh lao là Mycobacterium tuberculosis (MTB), tế bào MTB dài 3-5µm, rộng 0,3-0,5µm, không có lông, hai đầu tròn, thân có hạt, tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành hình chữ N, Y, V hoặc thành dãy phân nhánh nhƣ cành cây trên tiêu bản nhuộm Ziehl – Neelsen, không bị cồn và acid làm mất màu đỏ của fucsin. Vi khuẩn lao trong tiêu bản nhuộm Ziehl – Neelsen [35] MTB là vi khuẩn hiếu khí, phân chia mỗi lần từ 16 đến 20 giờ, rất chậm so với thời gian phân chia tính bằng phút của các vi khuẩn khác (trong số các vi khuẩn phân chia nhanh nhất là một chủng E. coli, có thể phân chia mỗi 20 phút).

MTB Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 z Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân không đƣợc phân loại Gram dƣơng hay Gram âm vì chúng không có đặc tính hoá học này, mặc dù thành tế bào có chứa peptidoglycan. Trên mẫu nhuộm Gram, tế bào vi khuẩn cho kết quả nhuộm rất yếu hoặc là không biểu hiện gì cả. MTB có thể chịu đựng đƣợc chất sát khuẩn yếu và sống sót trong trạng thái khô trong nhiều tuần nhƣng trong điều kiện tự nhiên, chỉ có thể phát triển trong sinh vật ký chủ (cấy MTB in vitro cần thời gian dài để có kết quả, nhƣng ngày nay là công việc bình thƣờng ở phòng xét nghiệm) [2, 3]. Hiện nay xu hƣớng phân loại vi khuẩn lao dựa vào trình tự ADN của chúng đã đƣợc áp dụng.

Ngƣời ta nhận thấy đoạn IS6110 với 1361 cặp base chỉ có ở bốn loại mycobacteria là M. microti (gọi chung là M. tuberculosis complex) mà không có ở các mycobacteria khác [17, 31]. Hệ gene vi khuẩn lao Từ năm 1998, nhờ Cole và cộng sự [16], toàn bộ trình tự của chủng MTB H37Rv đã đƣợc giải mã và phân tích, cung cấp những kiến thức sinh học về loài vi khuẩn sinh sản chậm này, mở ra những khái niệm mới trong can thiệp phòng và điều trị bệnh.

Toàn bộ hệ gene gồm 4411529 bp chứa khoảng 4000 gene, với tỷ lệ GC cao khoảng 65%. Điểm khác cơ bản trong hệ gene giữa MTB với những vi sinh vật khác là phần lớn các gene mã hoá những enzyme có liên quan đến việc tổng hợp và phân giải lipid, có 2 họ protein mới (PE và PPE) giàu glycine với cấu trúc lặp lại. MTB thƣờng kháng ngẫu nhiên với nhiều thuốc làm cho việc điều trị lao trở nên khó khăn. Sự kháng thuốc này chủ yếu là do vách tế bào kỵ nƣớc tác dụng nhƣ là rào cản thấm, tuy vậy nhiều yếu tố quyết định sự kháng thuốc đƣợc mã hóa trong hệ gene vi khuẩn nhƣ là enzyme thủy phân, enzyme biến đổi tác dụng của thuốc nhƣ β-lactamase, aminoglycoside acetyl transferase…và nhiều hệ thống vận chuyển thuốc ra ngoài khác.

Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 z Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân Hình 1. Hệ gene của chủng MTB H37Rv [16] Vòng tròn ngoài cùng biểu hiện thang cho MTB, 0 – nơi bắt đầu sao chép. Vòng tròn đầu tiên tính từ ngoài vào cho thấy vị trí gene ARN ổn định, trình tự DR đại diện bằng hình khối hồng. Vòng tròn thứ 2 bên trong chỉ trình tự mã hoá (theo chiều kim đồng hồ - xanh lá đậm, ngược chiều kim đồng hồ - xanh lá nhạt).

Vòng tròn thứ 3 minh họa trình tự ADN lặp (trình tự chèn – cam, họ 13E12 REP – hồng đậm, prophage – xanh dương), vòng tròn thứ 4 chỉ vị trí họ PPE (xanh lá), vòng tròn thứ 5 chỉ họ PE (tím, ngoại trừ PGRS), và vòng tròn thứ 6 chỉ vị trí trình tự PGRS (đỏ sậm). Biểu đồ tròn khu vực trung tâm biểu hiện lượng GC, màu vàng chỉ ít hơn 65% GC, khu vực màu đỏ là GC cao hơn 65% [16]. Các nghiên cứu cho thấy nhóm MTB có hệ gene bảo tồn cao. Các thành viên trong họ MTB có tính đa dạng cao khi xét về kiểu hình hoặc kiểu kí chủ, đây là ví dụ điển hình cho tính ổn định di truyền giữa các chủng, với tốc độ đột biến vô nghĩa làm nên điểm đa hình ƣớc tính khoảng 0,01% - 0,03%, nhất là không có bằng chứng nào cho thấy có sự di truyền ngang vật chất di truyền trong cùng thế hệ giữa các vi khuẩn lao nhƣ các vi khuẩn khác [16].

Khoa Sinh học Khóa 2010 - 2012 z Luận văn Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân 1. Khả năng gây bệnh và tình hình bệnh lao Về mặt dịch tễ học, tất cả những bệnh nhân lao đều có thể là nguồn lây, nhƣng mức độ lây rất khác nhau. Đối với các thể lao ngoài phổi (lao màng não, màng bụng, hạch, xƣơng khớp…) đƣợc gọi là những thể lao “kín”, nghĩa là vi khuẩn ít khả năng nhiễm vào môi trƣờng bên ngoài. Lao phổi là thể lao dễ đƣa vi khuẩn ra môi trƣờng bên ngoài.

Bệnh nhân lao phổi khác nhau thì khả năng lây bệnh cho ngƣời khác cũng khác nhau, tùy thuộc vào: số lƣợng vi sinh vật thoát ra ngoài môi trƣờng, mật độ vi sinh vật trong không khí, thời gian vật chủ phơi nhiễm không khí đã bị ô nhiễm, tình trạng miễn dịch của từng cá thể. Bệnh nhân nhiễm HIV và những bệnh nhân rối loạn miễn dịch qua trung gian tế bào thì bệnh càng trầm trọng khi bị nhiễm MTB. Tuy vậy khả năng lan truyền bệnh của những bệnh nhân này không cao [2, 3]. MTB tồn tại trong các hạt khí dung nhỏ lơ lửng ngoài không khí.

Khi đƣợc hít vào, vi khuẩn sẽ đi vào phổi, đến phế nang. Tại đây, vi khuẩn sẽ nhân lên hoặc bị ức chế tuỳ thuộc vào tình trạng hệ thống miễn dịch của cơ thể. Trong vòng 2-10 tuần, các đại thực bào đƣợc hoạt hoá, bao quanh vi khuẩn tạo nên lớp vỏ cứng giúp kìm hãm và kiểm soát vi khuẩn (giai đoạn lao nhiễm). Nếu hệ thống miễn dịch của cơ thể không thể kiểm soát đƣợc vi khuẩn, vi khuẩn sẽ nhân lên nhanh chóng và có thể theo đƣờng máu và đƣờng bạch huyết tấn công vào các bộ phận khác nhau nhƣ phổi, thận, não, xƣơng (giai đoạn lao bệnh) [2, 3].

MTB có cơ chế đặc biệt để tấn công vào tế bào. MTB có thể gắn trực tiếp vào thụ thể mannose trên đại thực bào nhờ glycolipid đã đƣợc mannose hoá trên vách, hoặc nhờ lipoarabinomannan, hay gắn gián tiếp nhờ thụ thể bổ thể, thụ thể Fc. Thông thƣờng khi vật lạ bị đại thực bào bắt giữ sẽ bị cơ chế thực bào qua trung gian chất oxy hoá tiêu diệt. MTB biến đổi cơ chế gây độc này, ngăn cản sự kết hợp phagosome với lysosome.

Vách MTB có loại acid mycolic là lipid chuyên biệt nhánh alpha, những phân tử kị nƣớc mạnh, hình thành lớp vỏ lipid bao quanh vi sinh vật, ảnh hƣởng đến khả năng thấm vật chất qua bề mặt tế bào.