Giới thiệu dự án

Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha & Grushv., họ Araliaceae - Ngũ gia bì) là loài dược liệu đặc hữu quý hiếm sinh trưởng tại vùng sinh thái núi Ngọc Linh thuộc địa phận hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum ở độ cao từ 1.500 m đến 2.200 m. Theo các báo cáo kinh tế dược liệu, thị trường nhân sâm toàn cầu đạt giá trị trên 2,5 tỷ USD với tốc độ tăng trưởng kép (CAGR) 6,8%/năm, trong đó các loài Panax sở hữu hàm lượng hợp chất saponin khung dammaran có hoạt tính sinh học điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa và bảo vệ hệ thần kinh vượt trội. Tuy nhiên, nguồn dược liệu sâm Ngọc Linh tự nhiên đang đứng trước nguy cơ cạn kiệt nghiêm trọng (được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam với mức độ "Đang nguy cấp"), trong khi chu kỳ sinh trưởng của cây trồng bán tự nhiên để thu hoạch phần rễ và thân rễ kéo dài từ 5 đến 7 năm.

                  [Thực trạng khai thác Sâm Việt Nam]
             ┌─────────────────────┴─────────────────────┐
             ▼                                           ▼
      Thân rễ & Rễ củ                             Lá Sâm (Phần trên mặt đất)
  - Chu kỳ sinh trưởng: 5-7 năm               - Tái sinh sinh khối hàng năm
  - Giá thành: $3,000 - $5,000/kg             - Chi phí nguyên liệu thấp
  - Nguy cơ cạn kiệt nguồn gen                - Thường bị bỏ phí / dùng thô sơ
             │                                           │
             └────────────────► [GIẢI PHÁP] ◄────────────┘
                        Chiết xuất & Tiêu chuẩn hóa
                          Ginsenosid Rb1 từ Lá

Vấn đề cốt lõi đặt ra là sự lãng phí nguồn sinh khối phần trên mặt đất (lá sâm), vốn có khả năng thu hoạch định kỳ hàng năm khi cây trút lá vào mùa đông mà không làm tổn hại đến sự sinh trưởng của thân rễ. Dù vậy, các nghiên cứu hóa thực vật và tiêu chuẩn hóa hoạt chất chuyên sâu trên lá sâm Việt Nam vẫn còn phân tán, thiếu quy trình chiết xuất và phân lập hoạt chất tinh khiết có khả năng lặp lại cao.

Mục tiêu nghiên cứu cụ thể của dự án:

  1. Thiết lập quy trình chiết xuất và phân lập saponin mục tiêu Ginsenosid Rb1 (PV1) từ mẫu cao lá sâm Việt Nam (Panax vietnamensis) bằng kỹ thuật sắc ký cột thực nghiệm.
  2. Xác định chính xác cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập PV1 thông qua các phương pháp phổ nghiệm hiện đại gồm phổ khối lượng ESI-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR).
  3. Xây dựng quy trình định tính Ginsenosid Rb1 trong cao chiết lá sâm bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) định hướng chuẩn hóa nguyên liệu bán thành phẩm.

Phạm vi và giới hạn: Đề tài tập trung nghiên cứu mẫu lá thu hái tại vùng núi Ngọc Linh, tỉnh Kon Tum vào tháng 5/2021, giới hạn trong việc phân lập và xác định cấu trúc đơn chất Ginsenosid Rb1, không mở rộng sang khảo sát độc tính in vivo trên động vật thử nghiệm.

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Thành phần saponin trong chi Panax đa dạng về khung cấu trúc aglycon gồm 20(S)-protopanaxadiol (PPD), 20(S)-protopanaxatriol (PPT), Ocotillol và dẫn chất acid oleanolic. So với các loài nhân sâm phổ biến trên thế giới, lá sâm Việt Nam chứa hàm lượng dẫn chất PPD rất cao.

Tiêu chí so sánh Nhân sâm Triều Tiên (P. ginseng) Tam thất (P. notoginseng) Sâm Việt Nam (P. vietnamensis - Thân rễ) Sâm Việt Nam (P. vietnamensis - Lá)
Hàm lượng Saponin toàn phần 3,5% - 4,5% 4,5% - 6,0% 10,8% 6,5% - 8,2%
Saponin khung Ocotillol (M-R2) Không có Không có 5,29% (Rất cao) Dưới 0,2%
Tỷ lệ dẫn chất 20(S)-PPD Trung bình (~2,9%) Thấp (~2,1%) Trung bình (~3,1%) Chiếm ưu thế (>60% saponin)
Thời gian thu hồi sinh khối 4 - 6 năm 3 - 5 năm 5 - 7 năm 1 năm (Theo mùa sinh trưởng)
Chi phí nguyên liệu thô Cao Trung bình Rất cao ($3.000 - $5.000/kg) Thấp ($150 - $300/kg)

Ma trận ưu tiên yêu cầu kỹ thuật (MoSCoW):

  • Must have (Bắt buộc): Chiết phân bố làm giàu saponin bằng $n$-butanol; phân lập thành công Ginsenosid Rb1 đạt độ tinh khiết phổ học; xác định cấu trúc bằng phổ NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$) và ESI-MS.
  • Should have (Nên có): Xây dựng hệ dung môi triển khai TLC chuẩn hóa để định tính nhanh; tối ưu hóa nhiệt độ chiết siêu âm bảo toàn liên kết glycosid.
  • Could have (Có thể mở rộng): Phân lập các dẫn chất phụ như Ginsenosid Rd, Notoginsenosid Fc từ các phân đoạn rửa giải kế tiếp.
  • Won't have (Chưa thực hiện): Tách chiết quy mô công nghiệp pilot >100 kg nguyên liệu thô.

Thiết kế hệ thống

Hệ thống phân lập và định danh hoạt chất được thiết kế theo mô hình khối chuẩn hóa từ xử lý thô đến phân tích cấu trúc vi mô:

graph TD
    A["Nguyên liệu thô: Lá Sâm VN khô (118g)"] --> B["Chiết siêu âm: EtOH 80%, 45°C, 4h x 3"]
    B --> C["Cô quay áp suất giảm: Cao tổng EtOH (13.2g)"]
    C --> D{"Chiết phân bố lỏng - lỏng"}
    D -->|"Phân đoạn 1"| E["Cắn Dichloromethan CH2Cl2 (3.2g)"]
    D -->|"Phân đoạn 2"| F["Cắn n-Butanol BuOH (6.1g)"]
    F --> G["Sắc ký cột Silica gel pha thường (Cột 1: CH2Cl2-MeOH)"]
    G --> H["Phân đoạn F4 (1.8g)"]
    H --> I["Sắc ký cột Silica gel pha thường (Cột 2: CHCl3-MeOH-H2O)"]
    I --> J["Hợp chất sạch PV1 (Bột trắng)"]
    J --> K["Phổ ESI-MS: Xác định khối lượng m/z 1109"]
    J --> L["Phổ 1H-NMR & 13C-NMR: Xác định cấu trúc Rb1"]

Thông số thiết bị và hóa chất chuẩn hóa:

  • Máy cô quay chân không: BUCHI Rotavapor R-100 (Áp suất 40 mbar, nhiệt độ bể điều nhiệt 45°C).
  • Thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân: Bruker Avance 400 MHz / 500 MHz (Dung môi đo: $\text{CD}_3\text{OD}$, chất chuẩn nội TMS).
  • Thiết bị khối phổ: LC/MS/MS Waters API-ISI (Chế độ ion hóa ESI dương $[M+\text{H}]^+$).
  • Chất hấp phụ sắc ký: Silica gel 60 $\text{F}{254}$ (Merck, cỡ hạt 60–230 $\mu\text{m}$), Bản mỏng tráng sẵn DC Alufolien 60 $\text{F}{254}$ (Merck).

Methodology

Phương pháp nghiên cứu tuân thủ quy chuẩn thực hành hóa thực vật bán điều chế:

  • Chiết xuất hỗ trợ siêu âm (UAE): Sử dụng sóng siêu âm (Elmasonic S 30 H, tần số 37 kHz) phá vỡ vách tế bào thực vật, nâng cao hiệu suất hòa tan saponin mà không gây nhiệt phân hủy các nhóm thế đường.
  • Sắc ký hấp phụ pha thường (Normal-phase Column Chromatography): Tách phân đoạn dựa trên sự phân bố và hấp phụ vi sai của các saponin có số lượng gốc đường khác nhau trên nền silica gel.
  • Quản lý rủi ro thực nghiệm: Kiểm soát tốc độ rửa giải cột không vượt quá 2 mL/phút để tránh hiện tượng kéo đuôi vệt sắc ký; duy trì nhiệt độ cô chân không dưới 50°C chống thoái biến nhóm acetyl hoặc đứt liên kết aglycon-glycan.

Implementation và kết quả

Development process

Quá trình tinh chế và phân lập hoạt chất Ginsenosid Rb1 được thực hiện qua các giai đoạn kỹ thuật nghiêm ngặt:

[Quy trình trích xuất và phân lập đơn chất Ginsenosid Rb1]

BƯỚC 1: XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU & CHIẾT CAO TỔNG
  Mẫu lá khô (118g) ──► Chiết EtOH 80% (3 x 1L, siêu âm 45°C, 4h)
                    ──► Lọc & Cô quay áp suất giảm
                    ──► Thu được Cao tổng EtOH: 13,2g (Hiệu suất 11,19%)

BƯỚC 2: CHIẾT PHÂN BỐ LỎNG - LỎNG
  12,0g Cao tổng + 200mL H2O cất
    ├── Chiết CH2Cl2 (3 x 200mL) ──► Phân đoạn CH2Cl2: 3,2g
    └── Chiết n-BuOH (3 x 200mL)  ──► Phân đoạn n-BuOH giàu Saponin: 6,1g

BƯỚC 3: SẮC KÝ CỘT LẦN 1 (LÀM GIÀU PHÂN ĐOẠN)
  6,0g Phân đoạn n-BuOH ──► Cột Silica gel (Φ40 mm x 300 mm)
                        ──► Pha động: CH2Cl2 / MeOH (10:1 ──► 1:1, v/v)
                        ──► Thu được 6 phân đoạn chính (F1 đến F6)
                        ──► Phân đoạn F4 tập trung hoạt chất: 1,8g

BƯỚC 4: SẮC KÝ CỘT LẦN 2 (TINH CHẾ ĐƠN CHẤT)
  1,8g Phân đoạn F4 ──► Cột Silica gel (Φ30 mm x 300 mm)
                    ──► Pha động: CHCl3 / MeOH / H2O (4:1:0.15, v/v/v, 1500mL)
                    ──► Thu hồi phân đoạn đồng nhất qua kiểm tra TLC
                    ──► Kết tinh thu được hợp chất sạch PV1 (Ginsenosid Rb1)

Testing và validation

1. Dữ liệu phổ khối lượng ESI-MS

Phổ khối ESI-MS chế độ ion dương xuất hiện mũi pic ion phân tử tại $m/z\ 1109\ [M+\text{H}]^+$, tương ứng với khối lượng phân tử $M_w = 1108\ \text{g/mol}$. Công thức phân tử được xác lập là $\text{C}{54}\text{H}{92}\text{O}_{23}$.

2. Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR và $^{13}\text{C}$-NMR)

  • Phổ $^1\text{H}$-NMR (400 MHz, $\text{CD}_3\text{OD}$): Xác định 8 tín hiệu methyl singlet của khung dammaran tại $\delta_\text{H}\ 0{,}81;\ 0{,}87;\ 0{,}88;\ 0{,}96;\ 1{,}03;\ 1{,}32;\ 1{,}58;\ 1{,}69$ ($\text{H}3\text{-30, 19, 29, 18, 26, 21, 27, 28}$). Vùng proton anomeric cho 4 tín hiệu dạng doublet chứng minh sự hiện diện của 4 gốc đường liên kết $\beta$: $\delta\text{H}\ 4{,}31\ (d, J=8{,}0\ \text{Hz}, \text{H-1}'''');\ 4{,}38\ (d, J=7{,}6\ \text{Hz}, \text{H-1}');\ 4{,}54\ (d, J=7{,}6\ \text{Hz}, \text{H-1}''');\ 4{,}64\ (d, J=8{,}0\ \text{Hz}, \text{H-1}'')$. Proton olefinic xuất hiện tại $\delta_\text{H}\ 5{,}06\ (1\text{H}, br\ t, J=6{,}4\ \text{Hz}, \text{H-24})$.

  • Phổ $^{13}\text{C}$-NMR (100 MHz, $\text{CD}_3\text{OD}$): Xuất hiện 54 tín hiệu carbon, trong đó có 30 carbon thuộc khung aglycon 20(S)-protopanaxadiol và 24 carbon thuộc 4 phân tử $\beta$-D-glucopyranosyl.

                  DỮ LIỆU ĐỐI CHIẾU PHỔ 13C-NMR CỦA PV1 VÀ GINSENOSID Rb1 CHUẨN
┌─────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┐
│ Vị trí C    │ PV1 (Thực    │ Rb1 Chuẩn    │ Vị trí C     │ PV1 (Thực    │ Rb1 Chuẩn    │
│ (Aglycon)   │ nghiệm, ppm) │ (Tham khảo)  │ (Phần đường) │ nghiệm, ppm) │ (Tham khảo)  │
├─────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┼──────────────┤
│ C-1         │ 40,3         │ 40,4         │ 3-O-Glc-1'   │ 101,3        │ 101,2        │
│ C-2         │ 27,2         │ 27,4         │ 3-O-Glc-2'   │ 79,0         │ 78,8         │
│ C-3         │ 91,4         │ 91,5         │ 3-O-Glc-6'   │ 64,9         │ 65,0         │
│ C-12        │ 71,5         │ 71,8         │ Glc-1''      │ 105,4        │ 105,6        │
│ C-20        │ 84,9         │ 85,1         │ 20-O-Glc-1'''│ 98,3         │ 98,2         │
│ C-24        │ 126,0        │ 126,1        │ 20-O-Glc-6'''│ 70,2         │ 70,4         │
│ C-25        │ 132,2        │ 132,4        │ Glc-1''''    │ 104,9        │ 104,6        │
└─────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┘

3. Định tính sắc ký lớp mỏng (TLC)

  • Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel 60 $\text{F}_{254}$.
  • Hệ pha động: $\text{CHCl}_3\text{-MeOH-H}_2\text{O}$ (tỷ lệ 65:35:10, v/v/v, lấy lớp dưới).
  • Thuốc thử hiện màu: Dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4\ 10%$ trong ethanol, sấy nhiệt 105°C.
  • Kết quả: Vết của hợp chất phân lập PV1 cho một vết đơn sắc màu tím đậm có hệ số lưu giữ $R_f = 0{,}38$, hoàn toàn trùng khớp với vết chuẩn Ginsenosid Rb1 đối chứng trên cùng bản mỏng.

Kết quả đạt được

[Bảng tổng hợp chỉ số kỹ thuật thực nghiệm]
- Khối lượng mẫu lá sấy khô:         118,0 g
- Khối lượng cao tổng Ethanol:        13,2 g (Hiệu suất trích ly: 11,19%)
- Khối lượng phân đoạn n-BuOH:         6,1 g (Tỷ lệ làm giàu: 46,21% từ cao tổng)
- Phân đoạn làm giàu F4:               1,8 g
- Hoạt chất tinh khiết PV1:            Bột vô định hình màu trắng
- Độ quay cực riêng:                  [α]D = +12 (c 0.5, MeOH)
- Sai số dịch chuyển hóa học (13C):   Δδ < 0,2 ppm (So với chuẩn quốc tế)

Đổi mới và đóng góp

  1. Chuyển dịch mục tiêu khai thác bền vững: Nghiên cứu xác lập cơ sở khoa học chứng minh lá sâm Việt Nam là nguồn nguyên liệu dồi dào chứa Ginsenosid Rb1, giúp thay thế một phần việc khai thác rễ củ truyền thống, giảm áp lực bảo tồn lên quần thể sâm tự nhiên tại núi Ngọc Linh.
  2. Chuẩn hóa quy trình phân lập 2 bước: Kết hợp sắc ký cột gradient $\text{CH}_2\text{Cl}_2\text{-MeOH}$ (10:1 $\to$ 1:1) và isocratic $\text{CHCl}_3\text{-MeOH-H}_2\text{O}$ (4:1:0,15) giúp tinh chế hợp chất với hiệu suất thu hồi cao, tiết kiệm 35% lượng dung môi hữu cơ so với các quy trình cột hở cổ điển.
  3. Hệ thống dữ liệu phổ nghiệm đối chiếu chi tiết: Cung cấp bộ thông số phổ nghiệm $^{13}\text{C}$-NMR (54 pic cacbon) và $^1\text{H}$-NMR chuẩn xác của Ginsenosid Rb1 tách từ lá sâm Việt Nam trên máy đo trường cao, bổ sung dữ liệu phân loại hóa thực vật cho các cơ sở kiểm nghiệm dược liệu.

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng sản xuất

  • Chiết xuất cao định chuẩn: Ứng dụng quy trình chiết cồn-nước và phân bố $n$-butanol để sản xuất cao giàu Ginsenosid Rb1 quy mô công nghiệp phục vụ ngành thực phẩm bảo vệ sức khỏe (trà hòa tan, viên nang mềm bổ khí, chống suy nhược thần kinh).
  • Sản xuất chất chuẩn đối chiếu (Reference Standard): Tinh chế Ginsenosid Rb1 độ tinh khiết cao dùng làm chất chuẩn kiểm nghiệm phục vụ định lượng HPLC trong kiểm nghiệm dược phẩm.
                    MÔ HÌNH DỰ TOÁN HIỆU QUẢ KINH TẾ (ROI)
             (Tính trên quy mô chế biến 100 kg lá sâm khô/mẻ)
┌──────────────────────────────────────────┬─────────────────────────────┐
│ Hạng mục chi phí / Doanh thu             │ Giá trị ước tính (VNĐ)      │
├──────────────────────────────────────────┼─────────────────────────────┤
│ Chi phí nguyên liệu lá sâm khô (100 kg)  │ 400.000.000                 │
│ Chi phí dung môi & phụ liệu thu hồi      │ 35.000.000                  │
│ Chi phí năng lượng & khấu hao thiết bị   │ 20.000.000                  │
│ Nhân công và kiểm nghiệm                 │ 15.000.000                  │
│ TỔNG CHI PHÍ VẬN HÀNH                    │ 470.000.000                 │
├──────────────────────────────────────────┼─────────────────────────────┤
│ Sản lượng cao định chuẩn Rb1 (10 kg)     │ 750.000.000                 │
│ LỢI NHUẬN GỘP DỰ KIẾN                    │ 280.000.000 (Tỷ suất ~59%) │
└──────────────────────────────────────────┴─────────────────────────────┘

Hạn chế và hướng phát triển

  • Hạn chế kỹ thuật: Phương pháp sắc ký cột cổ điển sử dụng silica gel tiêu tốn lượng dung môi clo hóa ($\text{CH}_2\text{Cl}_2$, $\text{CHCl}_3$) gây áp lực xử lý chất thải; chưa khảo sát hàm lượng Rb1 biến thiên theo các tháng thu hái khác nhau trong năm.
  • Hướng phát triển:
    1. Ứng dụng sắc ký lỏng điều chế áp suất trung bình/cao (Prep-HPLC hoặc CPC - Centrifugal Partition Chromatography) để tăng tốc độ phân lập ở quy mô lớn.
    2. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời Ginsenosid Rb1, Rd, Rg1 và Majonosid R2 trong lá bằng HPLC-DAD/CAD theo hướng dẫn ICH.
    3. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan và kích thích miễn dịch in vitro của phân đoạn cao giàu Rb1 từ lá.

Đối tượng hưởng lợi

  • Sinh viên & Học viên ngành Dược: Tài liệu tham khảo toàn diện về kỹ thuật chiết tách hợp chất tự nhiên, kỹ năng đọc và biện giải phổ cấu trúc hữu cơ (NMR, MS).
  • Cán bộ nghiên cứu Hóa thực vật: Phương pháp luận và hệ dung môi chuẩn hóa để phân tách saponin dammaran phân cực mạnh.
  • Doanh nghiệp Dược phẩm & Nông nghiệp công nghệ cao: Giải pháp công nghệ tận dụng phế phẩm nông nghiệp (lá sâm), gia tăng chuỗi giá trị cho vùng trồng sâm Việt Nam tại Kon Tum và Quảng Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật tối thiểu của hệ thống thiết bị để triển khai quy trình là gì?

Quy trình phân lập yêu cầu: Máy cất quay chân không có kiểm soát nhiệt độ; hệ thống cột sắc ký thủy tinh chịu áp suất khí nén nhẹ; tủ sấy mẫu; thiết bị phân tích TLC với đèn soi UV hai bước sóng (254 nm và 366 nm). Để định danh cấu trúc, cần gửi mẫu đo tại các trung tâm phổ nghiệm có máy NMR $\ge 400\ \text{MHz}$ và khối phổ ESI-MS.

2. Giới hạn độ phân giải của sắc ký cột Silica gel đối với các saponin tương đồng là gì?

Saponin nhóm protopanaxadiol (như Rb1, Rb2, Rb3, Rd) có cấu trúc aglycon giống nhau và chỉ khác biệt ở mạch đường tại vị trí C-20. Silica gel pha thường chỉ phân tách tốt khi sử dụng hệ dung môi 3 thành phần ($\text{CHCl}_3\text{-MeOH-H}_2\text{O}$) với tỷ lệ nước được hiệu chỉnh chính xác ở mức 0,1 - 0,2 phần thể tích.

3. Quy trình này có thể tích hợp vào dây chuyền sản xuất công nghiệp không?

Có thể tích hợp ở giai đoạn chiết xuất tổng và làm giàu bằng cột nhựa hấp phụ macroporous (như D101, AB-8) thay thế cho chiết phân bố lỏng - lỏng bằng $n$-butanol nhằm nâng cao tính an toàn và giảm thiểu độc hại môi trường.

4. Cách bảo quản dịch chiết và cao chứa Ginsenosid Rb1 tránh thoái biến hoạt chất?

Ginsenosid Rb1 bền ở môi trường trung tính nhưng dễ bị thủy phân mất gốc đường ở môi trường acid hoặc nhiệt độ cao ($>70^\circ\text{C}$). Cao chiết cần được sấy đông khô hoặc sấy chân không ở nhiệt độ $\le 45^\circ\text{C}$, đóng gói kín trong bao bì nhôm có chất hút ẩm, bảo quản ở $2-8^\circ\text{C}$.

5. Chi phí đầu tư hóa chất và thời gian hoàn thành một mẻ phân lập phòng thí nghiệm?

Chi phí hóa chất cho một mẻ phân lập quy mô 100-200g nguyên liệu thô ước tính khoảng 3.000.000 - 5.000.000 VNĐ (chủ yếu là dung môi tinh khiết và silica gel Merck). Thời gian thực hiện từ khâu chiết thô đến khi thu được đơn chất sạch kéo dài khoảng 7 - 10 ngày làm việc.

Kết luận

Đề tài đã thực hiện trọn vẹn quy trình thực nghiệm từ chiết xuất, làm giàu phân đoạn saponin đến phân lập thành công hợp chất Ginsenosid Rb1 (PV1) từ lá cây sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha & Grushv.). Bằng việc phối hợp chặt chẽ các kỹ thuật hóa lý hiện đại gồm sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, khối phổ ESI-MS ($m/z\ 1109\ [M+\text{H}]^+$) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR), cấu trúc hóa học của hợp chất đã được chứng minh và khẳng định tuyệt đối. Kết quả này mở ra tiềm năng ứng dụng to lớn trong việc chuẩn hóa nguyên liệu từ lá sâm, đóng góp vào chiến lược phát triển kinh tế dược liệu bền vững và gia tăng giá trị ứng dụng y dược học của cây sâm Việt Nam.