BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP TRẦN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ LOÀI GIỔI ĂN HẠT (Micheliaspp.) Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC M SỐ 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS VŨ QUANG NAM 2. TS BÙI VĂN THẮNG Hà Nội – 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn khoa học của giảng viên PGS.TS Vũ Quang Nam và PGS.TS Bùi Văn Thắng – Viện Công nghệ sinh học trường Đại học Lâm nghiệp. Các nội dung nghiên cứu, kết quả nêu trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác.
Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ. Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kì công trình nghiên cứu nào khác đã được công bố, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá luận văn của hội đồng khoa học. N i g y 6 th g 8 Người cam đoan Trần Thị Thu Hiền ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Lâm nghiệp, bản thân tôi đã l nh hội được rất nhiều kiến thức qu báu và nhận được sự quan tâm, giúp đ từ phía nhà trường, gia đình và bạn b đồng nghiệp. Tôi xin gửi lời cảm n chân thành nhất đến toàn th qu Thầy Cô giáo trong, ngoài nhà trường, đến gia đình, bạn b và đồng nghiệp đã ủng hộ, giúp đ , tạo điều kiện về vật chất, tinh thần cho tôi trong suốt thời gian vừa qua.
Luận văn tốt nghiệp này được sự hỗ trợ về mọi phư ng diện từ đề tài nghiên cứu khoa học c bản, được sự tài trợ của Quỹ Phát tri n khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), giai đoạn 2017 – 2020, Mã số: 106.TS Vũ Quang Nam làm Chủ trì với tên “Nghiên cứu giám định các loài Giổi hạt ở Việt Nam (Michelia spp.) bằ g phươ g ph p hì h thái, phân tử v si h th i”. Tôi xin chân thành cảm n sự giúp đ qu báu đó! Tôi xin bày tỏ lòng biết n sâu sắc tới các giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Vũ Quang Nam và PGS.TS Bùi Văn Thắng – Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đ tôi từ khi hình thành tưởng, trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học này. Đặc biệt, tôi xin cảm n các cô giáo Th.S Nguyễn Thị Hải Hà và cô giáo Th.S Nguyễn Thị Th của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện thí nghiệm phân tử, phân tích số liệu đ bản luận văn được hoàn thành. Mặc dù đã có nhiều cố gắng, nhưng trong đề tài nghiên cứu khoa học của tôi chắc h n không tránh khỏi nh ng thiếu sót.
Kính mong nhận được sự đóng góp kiến của qu Thầy Cô giáo, bạn b đồng nghiệp đ đề tài nghiên cứu khoa học của tôi được hoàn thiện h n. Tôi xin trân trọng cảm n! N i g y 6 th g 8 Học vi n Trần Thị Thu Hiền iii MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT.
v DANH MỤC CÁC BẢNG. vi DANH MỤC CÁC HÌNH. 1 Chƣơng 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU. Khái quát về đối tượng nghiên cứu.
Chi iổi (Michelia L. 6 4 Lo i iổi hạt (Michelia spp. Tổng quan về DNA mã vạch (DNA barcode). 12 iới thiệu về DNA ã vạ h.
12 C đặ điể ơ bả ủ trì h tự DNA ã vạ h…………………….14 3 M t số o us đượ sử dụ g tro g phươ g ph p DNA ã vạ h ở thự vật. Một số DNA mã vạch được sử dụng trong nghiên cứu ở thực vật. Một số thành tựu nghiên cứu về DNA mã vạch ở thực vật. Một số nghiên cứu về các loài Giổi ăn hạt.
25 5 M t số ghiê ứu ở go i ướ …………………………………….25 5 M t số ghiê ứu tại Việt N. 26 iv Chƣơng 2 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Nội dung nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.
Hóa chất và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu. Các thiết bị sử dụ g tro g ghiê ứu. Phư ng pháp nghiên cứu .4 hươ g ph p ghiê ứu hì h th i v vị trí ph oại .4 hươ g ph p ghiê ứu ph tử. 34 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.
Kết quả nghiên cứu giám định các loài Giổi ăn hạt. Về ph oại v hệ thố g h thự vật hi iổi. Đặ trư g ơ bả về hì h th i ủ o i tro g hi iổi. Đặ điể hì h th i ơ bả ủ o i iổi hạt……………………42 3.
Khóa tra phân loại cho m t số loài Giổi ở Việt Nam. Kết quả nghiên cứu giám định các loài Giổi ăn hạt bằng chỉ thị phân tử 53 3. Kết quả x đị h đoạ DNA ã vạ h ủ o i iổi hạt 53 3. X đị h v ph tí h trì h tự u eotide ủ đoạ DNA ã vạ h .3 X y dự g y ph t si h hủ g oại.
67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO v DANH MỤC BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ Bp base pair CBOL Consortium for the Barcode of Life CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ITS Internal Transcribed Spacer kb kilobase NCBI National Centre for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction PVP Polyvinyl pyrrolidone rDNA ribosome deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid Rnase Ribonuclease RUBISCO. Rubilose – 1,5 – bisphosphate cacboxylase/oxygenase SDS Sodium dodecyl sulphate TAE Tris – Acetic acid – EDTA TE Tris – Ethylenediaminetetraacetic acid UV Ultra Violet v/p vòng/phút VNTR Variable number tandem repeat RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms LSC Large single – copy region SSC Small single – copy region vi DANH MỤC CÁC BẢNG TT T n bảng Trang 1.1 Phân bố một số loài thuộc chi Giổi ở Việt Nam 9 2.1 Các mẫu Giổi ăn hạt ở Việt Nam trong nghiên cứu 30 2.2 Thành phần đệm tách A 31 2.3 Thành phần đệm tách B 32 2.4 Thành phần đệm TE (TE Buffer) 32 2.5 Trình tự và thông tin về các cặp mồi trong nghiên cứu 36 2.6 Thành phần một phản ứng PCR 36 2.7 Chu kỳ phản ứng PCR 37 3.1 Kết quả đo hàm lượng và độ sạch các mẫu DNA tổng số 54 Trình tự nucleotide của gen atpB – rbcL phân lập từ các mẫu Giổi 3.2 59 ăn hạt Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen atpB – rbcL của các 3.3 mẫu Giổi ăn hạt với trình tự nucoleotide gen atpB – rbcL của loài 61 Michelia alba với mã số trên Genbank là AB623323.1 Trình tự nucleotide của gen trnH – psbA phân lập từ các mẫu Giổi 3.4 62 ăn hạt Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen trnH – psbA của các 3.5 mẫu Giổi ăn hạt nghiên cứu với trình tự nucoleotide gen trnH – 63 psbA của loài Magnolia insignis (KY921716.1) Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen trnL intron của các mẫu Giổi ăn hạt với trình tự nucoleotide gen trnL intron của các loài 3.6 64 Michelia champaca (AY009041.1), Michelia baillonii (AY009042.1), Magnolia laevifolia (MF583748.1) So sánh trình tự nucleotide của gen trnL – trnF của các mẫu Giổi ăn 3.7 66 hạt nghiên cứu vii DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang 1.1 Cây Giổi xanh trong rừng tự nhiên ở Kon Hà Nừng Gia Lai 10 Một phần cây Phylogeny hình thái th hiện mối quan hệ phát sinh 3.1A 41 của các loài Michelia Một phần cây Phylogeny phân tử (ndhF sequences) th hiện 3.1B 41 mối quan hệ phát sinh của các loài Michelia 3.2 Cành mang hoa của loài Giổi ăn hạt (Michelia tonkinensis) 42 3.3 Một số đặc trưng hình thái ở chi Michelia L. 43 Hình thái lá và lá non trong chồi búp ở các loài thuộc chi 3.
Một số đặc trưng hình thái của vết sẹo ở các loài thuộc chi 3.5 Giản đồ về sự phát sinh chồi cành syllepsis và prolepsis 45 3.6 Hình thái c quan sinh sản ở các loài thuộc chi Michelia 46 3.7 Hình thái loài Giổi ăn hạt (Michelia tonkinensis A.Chev) 49 Đặc đi m hình thái của bộ nhụy hoa và quả của một số loài 3.8 53 Giổi ăn hạt DNA tổng số của mẫu Giổi ăn hạt tách chiết được điện di trên 3.9 54 gel agarose 1% Sản phẩm PCR nhân đoạn gen atpB – rbcL được điện di trên 3.10 55 gel agarose 1% Sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnH – psb A được điện di trên 3.11 56 gel agarose 1% Sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnL intron được điện di trên 3.12 57 gel agarose 1% viii Sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnL – trn F được điện di trên 3.13 58 gel agarose 1% Cây phân loại dựa trên đoạn gen atpB – rbcL xây dựng bằng 3.14 67 MEGA (phư ng pháp Neighbor – joining) Cây phân loại dựa trên đoạn gen trnH – psbA xây dựng bằng 3.15 68 MEGA (phư ng pháp Neighbor – joining) Cây phân loại dựa trên đoạn gen trnL intron xây dựng bằng 3.16 69 MEGA (phư ng pháp Neighbor – joining) Cây phân loại dựa trên đoạn gen trnL – trnF xây dựng bằng 3. Lí do chọn đề tài Đất nước Việt Nam nổi tiếng với rất nhiều hệ sinh thái cùng môi trường sống đa dạng, được thiên nhiên ưu đãi bởi có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm gió mùa, đất đai màu m , là n i có điều kiện tự nhiên và khí hậu rất thích hợp cho nhiều loài cây cối phát tri n. Một quốc gia có hệ thực vật vô cùng phong phú và mang lại nhiều giá trị kinh tế cao, trong đó có loài Giổi ăn hạt, một trong nh ng loài cây mang nhiều giá trị không chỉ trong nghiên cứu khoa học mà cả trong thực tiễn đời sống. Loài Giổi ăn hạt đã được đề cập đến trong một số tài liệu về phân loại thực vật, về cây thuốc, về cây lâm đặc sản,.
Trong các tài liệu đó, chúng được nhắc đến là loài có phân bố ở các khu vực miền núi phía Bắc như các tỉnh: Hòa Bình, Phú Thọ, V nh Phúc, Tuyên Quang, Hà T nh và một số tỉnh khác ở Việt Nam.
