Đặt vấn đề Viêm phế quản truyền nhiễm (IB- Infectious Bronchitis) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính và nặng ở gà do virus IBV (Infectiuos bronchitis virus) thuộc nhóm Gammacorona virus thuộc họ Coronaviridae gây ra. Bệnh IB xảy ra quanh năm, loại virus này rất dễ lây lan trên tất cả các giống gà và mọi lứa tuổi với tỉ lệ nhiễm bệnh từ 50-100% đàn gà. Trong đó xảy ra nghiêm trọng nhất ở gà dưới 6 tuần tuổi, và có thể lây sang các loại gia cầm khác như vịt, chim bồ câu, chim cút với các triệu chứng điển hình ở đường hô hấp. Ngoài ra, bệnh gây tổn thương thận (đối với vi rút thể thận) và tổn thương ống dẫn trứng, làm giảm năng suất và chất lượng trứng.
Đến nay, bệnh đã lưu hành ở khắp các quốc gia, gây tổn thất nặng nề về kinh tế. Khó khăn chính của việc phòng ngừa và kiểm soát bệnh IB hiện nay là có nhiều kiểu gen và kiểu huyết thanh. Việc phân tích di truyền của IBV chủ yếu dựa trên gen S1 là gen đóng vai trò quan trọng trong khả năng lây nhiễm. tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu về đặc điểm phân tử của gen S1 của virus IBV tại Việt Nam còn hạn chế.
Chính vì vậy, nhằm cung cấp thêm những cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu và kiểm soát dịch bệnh viêm phế quản truyền nhiễm tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu đặc điểm phân tử vùng gen S1 của virus IBV gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà tại Việt Nam năm 2021”. Mục đích, nội dung nghiên cứu Mục đích Giải trình tự được vùng gen S1 của chủng virus IBV gây bệnh trên gà ở Việt Nam năm 2021, từ đó phân tích đặc điểm phân tử để xác định được genotype đang lưu hành. Nội dung nghiên cứu - Tách chiết RNA tổng số của virus IBV từ mẫu bệnh phẩm gà bệnh. 1 - Xác định thông tin về gen S1 trên GenBank, thiết kế mồi và khuếch đại các phân đoạn gen bằng phản ứng PCR; Giải trình tự nucleotide của các phân đoạn gen S1 thu nhận được.
- Phân tích đặc điểm phân tử của gen S1; So sánh với các chủng của Việt Nam và thế giới đã được công bố trên GenBank - Xây dựng cây phát sinh chủng loại của IBV dựa trên trình tự nucleotide; Xác định được genotype. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (IB - Infectious Bronchitis) 1. Lịch sử bệnh viêm phế quản truyền nhiễm Bệnh IB được phát hiện ở miền Bắc bang Dakota nước Mỹ vào mùa xuân năm 1930 và được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1931.
Sau đó vi rút gây bệnh đã được phân lập và đặt tên là virus viêm phế quản truyền nhiễm (IBV - Infectious bronchitis virus) (Schalk, Hawn, 1931). Ban đầu, IBV được công nhận là bệnh xảy ra chủ yếu ở gà non, sau đó nó được ghi nhận phổ biến ở các đàn gà bán trưởng thành và gà đẻ. Năm 1937, Beaudette và Hudson thực hiện cấy chuyển thành công virus trên trứng có phôi gà lần đầu tiên. Năm 1940, những triệu chứng hô hấp đặc trưng và sự giảm sản lượng trứng ở những đàn gà đẻ bị nhiễm bệnh được ghi nhận; những tổn thương thận được phát hiện vào những năm 1960 (Cavanagh và Gelb, 2008; Jungerr và cộng sự, 1956); tổn thương ruột được báo cáo năm 1985.
Năm 1941, phân lập thành công chủng virus Massachusett; tiếp theo vào năm 1951, chủng Connecticut được phân lập thành công. Triệu chứng lâm sàng Gà bị bệnh có những triệu chứng hô hấp điển hình như khó thở, thở khò khè, vươn cổ lên thở, hắt hơi, kém ăn, xù lông. Ngoài ra, bệnh gây tổn thương thận (đối với vi rút thể thận) và tổn thương ống dẫn trứng, làm giảm năng suất và chất lượng trứng (vỏ trứng đẻ ra mềm và nhăn nheo). Bệnh tích - Viêm tích dịch ở xoang mũi, khí quản.
- Túi khí đục, có thể chứa dịch tiết vàng. - Thận nhạt màu, sưng; trong ống dẫn liệu chứa tinh thể urat. - Thoái hóa buồng trứng, vòi dẫn trứng sưng. Tổng quan về virus IBV 1.
Cách gọi tên và phân loại Tên khoa học: Avian infectious bronchitis virus Phân loại học Nhóm: RNA viruses Bộ: Nidovirales Họ: Coronaviridae Chi: Gamma Coronavirrus Loài: Avian infectious bronchitis virus 1. Đặc điểm sinh học của virus IBV 1. Hình thái và cấu trúc hệ gen của Virus IBV IBV có hình tròn hoặc đa hình thái với đường kính từ 50-220 nm, có cái gai hình chùy dài khoảng 20 nm nhô ra bề mặt (Cavanagh, 2005). Bên trong lớp vỏ là các nucleocapsid hình ống, đối xứng xoắn và mang thông tin di truyền.
Nhân của IBV có cấu tạo là RNA sợi đơn dương, kích thước khoảng 27 kb. Sơ đồ cấu trúc virus viêm phế quản truyền nhiễm (Nguồn:https://link.1007/978-3-319-47426-7_5#Fig1) 4 Virion của virus gồm 4 loại protein cấu trúc là: protein gai (spike, S), glycoprotein màng tích hợp (membrane, M), protein nhân (nucleocapsid, N), protein vỏ (envelop, E). Protein đột biến bao gồm 1145 acid amin và trải qua quá trình phân cắt sau dịch mã để tạo thành các tiểu đơn vị S1 và S2 (Jackwood & de Wit, 2013). Các chức năng tăng đột biến bao gồm gắn vào tế bào vật chủ, trung hòa kháng thể và bắt đầu miễn dịch bảo vệ (Johnson và cộng sự, 2003).
Hình ảnh hiển vi điện tử của virus viêm phế quản truyền nhiễm nhuộm âm tính với axit phosphotungstic.Các mũi tên chỉ ra các gai trên bề mặt của virion. Thanh = 100 nm Bộ gen của IBV bao gồm một ARN sợi đơn dương kích thước khoảng 27,6kb, không kể đuôi polyadenyl hóa. Ít nhất 10 khung đọc mở (ORF) đã được phát hiện (Zhang và cộng sự, 2010 ; Ammayappan và cộng sự, 2008): Protein không cấu trúc ORF1ab (nsp) (529–20.360), glycoprotein S tăng đột biến ORF2 [gồm 3498 nucleotide (20.820), mã hóa cho 1162 acid amin]; ORF3abc [3a gồm 174 nucleotide (23.993) mã hóa cho 57 acid amin; 3b gồm 195 nucleotide (23.187), mã hóa cho 64 acid amin;protein vỏ nhỏ 3c (E) gồm 330 nucleotide (24.491), mã hóa cho 109 acid amin]; ORF4, glycoprotein màng (M) [gồm 678 nucleotide (24.140), mã hóa cho 225 acid amin); ORF5ab [5a gồm 198 nucleotide (25.942)]; và ORF6 nucleoprotein N [gồm 1230 nucleotide (25.114), mã hóa cho 409 acid amin]. Gen 1 bao gồm hai vùng chồng chéo (ORF 1a và ORF 1b) với 20 kb được dịch mã thành một polyprotein, tiền thân của bản sao virus (Rep), tạo ra 15 protein không cấu trúc (Nsp2-16).
Phần còn lại của bộ gen mã hóa bốn protein cấu trúc: gai (S) glycoprotein, protein vỏ nhỏ (E), màng (M) glycoprotein và protein nucleocapsid (N), cũng như năm protein phụ không cấu trúc nhỏ. : 3a, 3b, 3c, 5a và 5b, không bắt buộc đối với sao chép in vitro, nhưng có thể đóng một vai trò trong bệnh sinh (Casais và cộng sự, 2005, Hogson và cộng sự, 2006).Tổ chức bộ gen của IBV cổ điển là 5'UTR-ORF1a-ORF1b-S-3a-3b-EM- 5a-5b-N- UTR 3 ′ Hình 1. Sơ đồ tổ chức hệ gen IBV 6 Protein M (25-33 kDa) tiếp xúc với mặt ngoài của vỏ virus. Các protein M được nhắm mục tiêu đến vùng tiền golgi, đóng vai trò quan trọng trong việc tổ hợp virus và tương tác với protein N và S (Kuo và Master 2002; de Haan và cộng sự, 2002).
Protein M cũng đóng vai trò quan trọng trong việc đóng gói RNA của virus thành các nucleocapsid bằng cách tương tác cụ thể với tín hiệu đóng gói RNA của virus (Narayanan và cộng sự, 2003). Protein N liên kết với RNA của bộ gen để tạo thành phức hợp ribonucleoprotein dạng xoắn. Protein N có vai trò cảm ứng tế bào lympho T gây độc tế bào (Seo và cộng sự 1997 ; Collisson và cộng sự 2000). Protein S (Spike) là protein dạng gai nằm trên lớp vỏ virion, có hình cánh hoa.
Protein S được phân cắt bởi các protease thành hai tiểu đơn vị S1 (90 Kda) và S2 (84 kDa) có kích thước tương ứng khoảng 500 và 600 amino acid; tiểu đơn vị S1 hình thành đầu nhọn của virus, và tiểu đơn vị S2 cố định S1 vào màng virus. Protein S chứa các epitop để trung hòa (Cavanagh, 1983; Kant và cộng sự, 1992 ; Koch và cộng sự, 1990 ; Mockett và cộng sự, 1984 ; Niesters và cộng sự, 1987). Trong tiểu đơn vị S1, ba vùng siêu biến (HVR) nằm trong các acid amin 38-67, 91-141, 274-387 (Kant và cộng sự 1992 ; Koch và cộng sự 199). Glycoprotein S1 là protein lây nhiễm và gây bệnh chính của IBV, và đóng một vai trò quan trọng trong việc gắn virus và cảm ứng kháng thể trung hòa (Cavanagh, 1983 ; Cavanagh và cộng sự, 1986 ; Shang và cộng sự, 2018).
Sự khác biệt trong tiểu đơn vị S1 góp phần vào sự khác biệt đáng kể trong kiểu huyết thanh của virus cũng như khả năng bảo vệ chéo kém (Cavanagh và cộng sự, 1986 ; Koch và cộng sự, 1990). Đặc tính kháng nguyên Hệ gen IBV có tỷ lệ đột biến và tái tổ hợp cao, dẫn đến sự xuất hiện liên tục của các biến thể di truyền và kháng nguyên mới trên toàn thế giới (Gough và cộng sự, 1992; Liu & Kong, 2004 ). Đặc tính kháng nguyên của các chủng IBV không thể được xác định hoàn toàn bằng phân tích di truyền mà cần phải được 7 nghiên cứu thông qua các xét nghiệm trung hòa virus giữa chủng IBV và các kháng thể đặc hiệu với kiểu huyết thanh (Darbyshire và cộng sự , 1979 ; Wadey & Faragher, 1981). Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus Gắn vào: bước đầu tiên trong quá trình xâm nhập và nhân lên của virus là gắn vào màng sinh chất của tế bào đích.
Sau khi liên kết với một thụ thể cụ thể, virus xâm nhập vào tế bào. Axit sialic liên kết α-2, 3 được chứng minh là cần thiết cho sự gắn kết gai (Wickramasinghe et al. 2011 ; Winter et al. 2008 ; Abd El Rahman et al.
2009 ; Promkuntod et al. Xâm nhập và cởi vỏ: virus được gắn với thụ thể dẫn đến sự thay đổi cấu trúc của protein S làm kích hoạt hoạt động dung hợp màng. Sau đó nucleocapsid của virus được giải phóng vào tế bào chất, ARN trần sẵn sàng cho quá trình dịch mã. Phiên mã và dịch mã RNA: sau khi RNA của virus được giải phóng vào tế bào chất, ORFs 1a và 1b được dịch mã thành các protein không cấu trúc chức năng gồm phức hợp RNA sao chép-dịch mã.
Phức hợp này tổng hợp một bản sao RNA đối mã đầy đủ được sử dụng làm mạch khuôn cho quá trình phiên mã của mRNA. Điểm khởi đầu của mỗi mRNA tương ứng với một đoạn các trình tự điều hòa phiên mã (TRSs, 5 ′ CT (T / G) AACAA (A / T) 3 ′) được tìm thấy ở đầu 3 ′ của trình tự chính và ở các vị trí khác nhau ngược dòng gen trong vùng gần 3 của hệ gen của IBV.