Luận văn thạc sĩ về đặc điểm hình thái và trình tự gen rpoC1 của cây dừa cạn (Catharanthus roseus)

Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen rpoc1 của cây dừa cạn Catharanthus roseus L. G. Don, góp phần vào bảo tồn và phát triển cây thuốc.

• Tác giả: Đinh Anh Tuấn
• Người hướng dẫn: GS. Chu Hoàng Mậu
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học - Đại Học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Điểm Hình Thái Và Trình Tự Gen rpoC1 Của Cây Dừa Cạn [Catharanthus Roseus (L. Don]
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. CÂY DỪA CẠN
• 1.2. HỆ THỐNG PHÂN LOẠI CÂY DỪA CẠN
• 1.3. GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA CÂY DỪA CẠN
• 1.4. ĐẶC ĐIỂM CỦA MÃ VẠCH DNA (DNA BARCODING)
• 1.5. ỨNG DỤNG MÃ VẠCH DNA TRONG NHẬN BIẾT CÂY DƯỢC LIỆU
• 1.6. GEN LỤC LẠP
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
• 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.3. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ MÁY MÓC
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4.1. Phương pháp thu mẫu
• 2.4.2. Các phương pháp sinh học phân tử
• 2.4.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
• 2.4.4. Phương pháp nhân gen rpoC1 bằng kĩ thuật PCR
• 2.4.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR (phương pháp thôi gel)
• 2.4.6. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của đoạn gen rpoC1
• 2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.5. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA CÁC GIỐNG DỪA CẠN THU TẠI HÀ GIANG VÀ THÁI NGUYÊN
• 3.1.1. Đặc điểm hình thái rễ, thân, hoa, quả và hạt của cây dừa cạn
• 3.1.2. Đặc điểm khác biệt về hình thái giữa ba giống dừa cạn
• 3.2. PHÂN LẬP GEN rpoC1 TỪ CÁC MẪU DỪA CẠN
• 3.2.1. Tách DNA tổng số từ các mẫu dừa cạn
• 3.2.2. Khuếch đại đoạn gen rpoC1 bằng PCR
• 3.2.3. Kết quả xác định trình tự đoạn gen rpoC1 phân lập từ các mẫu dừa cạn
• 3.3. PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG CỦA CÁC MẪU DỪA CẠN DỰA TRÊN TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN CỦA ĐOẠN GEN rpoC1
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu gen rpoC1 và cây dừa cạn

Nghiên cứu gen rpoC1 và đặc điểm hình thái của cây dừa cạn (Catharanthus roseus) là một lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử và công nghệ sinh học. Cây dừa cạn không chỉ có giá trị thẩm mỹ mà còn chứa nhiều hợp chất có lợi cho sức khỏe. Việc tìm hiểu về gen rpoC1 giúp hiểu rõ hơn về di truyền và các đặc điểm hình thái của cây này.

1.1. Đặc điểm sinh học của cây dừa cạn

Cây dừa cạn là loại cây thân thảo, có hoa đẹp và chứa nhiều alkaloid. Các giống cây dừa cạn khác nhau có màu sắc hoa khác nhau, từ hồng tím đến trắng vàng. Đặc điểm hình thái của cây dừa cạn rất đa dạng và phong phú.

1.2. Tầm quan trọng của gen rpoC1

Gen rpoC1 đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp RNA polymerase, ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh trưởng của cây. Nghiên cứu gen này giúp xác định các đặc điểm di truyền và khả năng thích ứng của cây dừa cạn trong môi trường khác nhau.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu cây dừa cạn

Mặc dù cây dừa cạn có nhiều lợi ích, nhưng việc nghiên cứu và phát triển giống cây này gặp nhiều thách thức. Các vấn đề như sự đa dạng di truyền, khả năng thích ứng với môi trường và sự biến đổi khí hậu cần được giải quyết. Việc phân tích gen rpoC1 có thể giúp vượt qua những thách thức này.

2.1. Sự đa dạng di truyền của cây dừa cạn

Cây dừa cạn có nhiều giống khác nhau, mỗi giống có đặc điểm di truyền riêng. Việc nghiên cứu sự đa dạng này giúp xác định các gen có liên quan đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây.

2.2. Ảnh hưởng của môi trường đến cây dừa cạn

Môi trường sống ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của cây dừa cạn. Các yếu tố như độ ẩm, ánh sáng và chất đất có thể tác động đến sự phát triển của cây và sự biểu hiện của gen rpoC1.

III. Phương pháp nghiên cứu gen rpoC1 trong cây dừa cạn

Nghiên cứu gen rpoC1 được thực hiện thông qua các phương pháp sinh học phân tử hiện đại. Các phương pháp này bao gồm tách chiết DNA, khuếch đại gen bằng PCR và phân tích trình tự nucleotide. Những phương pháp này giúp xác định chính xác trình tự gen và các biến thể di truyền.

3.1. Phương pháp tách chiết DNA

Tách chiết DNA từ mẫu cây dừa cạn là bước đầu tiên trong nghiên cứu. Phương pháp này giúp thu được DNA nguyên chất để phục vụ cho các bước phân tích tiếp theo.

3.2. Khuếch đại gen bằng PCR

Kỹ thuật PCR được sử dụng để khuếch đại đoạn gen rpoC1. Phương pháp này cho phép tạo ra số lượng lớn DNA cần thiết cho việc phân tích và nghiên cứu.

IV. Kết quả nghiên cứu gen rpoC1 và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu gen rpoC1 cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các giống cây dừa cạn. Những phát hiện này không chỉ có giá trị trong nghiên cứu khoa học mà còn có thể ứng dụng trong sản xuất giống cây dừa cạn có chất lượng cao hơn.

4.1. Phân tích trình tự nucleotide của gen rpoC1

Phân tích trình tự nucleotide cho thấy sự đa dạng di truyền giữa các mẫu cây dừa cạn. Những khác biệt này có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất giống cây

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng để phát triển các giống cây dừa cạn mới, có khả năng chống chịu tốt hơn với điều kiện môi trường khắc nghiệt.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu gen rpoC1 và đặc điểm hình thái của cây dừa cạn mở ra nhiều triển vọng cho việc phát triển giống cây mới. Những kết quả đạt được sẽ góp phần nâng cao giá trị kinh tế và bảo tồn nguồn gen quý hiếm của cây dừa cạn.

5.1. Tương lai của nghiên cứu gen trong cây dừa cạn

Nghiên cứu gen sẽ tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện giống cây dừa cạn. Các công nghệ mới sẽ giúp phát hiện và khai thác các gen có giá trị.

5.2. Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu

Công nghệ sinh học sẽ được áp dụng để tối ưu hóa quy trình sản xuất giống cây dừa cạn, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Việt Nam sở hữu hệ thực vật phong phú với gần 12000 loài thực vật bậc cao có mạch thuộc 2256 chi và 305 họ, mở ra tiềm năng to lớn cho ngành công nghệ sinh học và phát triển dược liệu. Trong số các loài cây thuốc quý, cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don thuộc họ Trúc đào Apocynaceae) đóng vai trò đặc biệt quan trọng khi chứa hơn 60 loại alkaloid terpenoid indole khác nhau. Các hoạt chất tiêu biểu như vinblastine và vincristine chiếm tỷ lệ khoảng 1 phần vạn trong lá khô nhưng là thành phần thiết yếu trong phác đồ điều trị ung thư bạch cầu và ung thư hạch. Tuy nhiên, việc nhận diện và phân loại chính xác các giống dừa cạn thương mại hiện nay gặp nhiều rào cản khi chỉ dựa vào hình thái truyền thống, nhất là ở giai đoạn cây non hoặc khi dược liệu đã qua sơ chế, băm sấy.

Đề tài nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu phân lập, giải trình tự đoạn gen lục lạp rpoC1 và so sánh đặc điểm hình thái giữa ba giống dừa cạn có màu sắc hoa khác nhau (hoa hồng tím, hoa trắng vàng, hoa trắng đỏ). Nghiên cứu được triển khai trong phạm vi thời gian từ tháng 6 năm 2015 đến tháng 4 năm 2016 tại hai địa bàn thu mẫu là thành phố Hà Giang và thành phố Thái Nguyên, thực nghiệm tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Gen, Trường Đại học Sư phạm thuộc Đại học Thái Nguyên. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu phân tử với độ tương đồng chuỗi đạt 96,6% đến 100%, thiết lập dữ liệu mã vạch DNA chuẩn xác nhằm phục vụ công tác giám định nguồn gen và nâng cao hiệu quả kiểm soát chất lượng dược liệu trong y tế cộng đồng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu ứng dụng lý thuyết phân loại học phân tử kết hợp với khái niệm mã vạch DNA (DNA barcoding) do Paul Hebert đề xuất từ năm 2003. Phương pháp này dựa trên nguyên lý sử dụng một đoạn trình tự nucleotide chuẩn, ngắn và bảo thủ trong hệ gen để định danh chính xác loài sinh vật tương tự như cơ chế quét mã vạch hàng hóa. Trong hệ gen thực vật bậc cao, bộ gen lục lạp (cpDNA) có cấu trúc dạng vòng kép với kích thước từ 120000 đến 170000 cặp base (bp), chứa khoảng 100 gen chức năng và có tính di truyền theo dòng mẹ.

Khung lý thuyết của đề tài tập trung vào gen rpoC1, một gen lục lạp có chiều dài dao động từ 409 đến 545 bp, đảm nhiệm chức năng mã hóa cho tiểu đơn vị beta prime của enzyme RNA polymerase. Nhờ tốc độ tiến hóa ổn định và mức độ bảo thủ cao, gen rpoC1 trở thành chỉ thị phân tử lý tưởng để phát hiện các đột biến điểm (SNPs) và đánh giá sai khác di truyền giữa các giống dưới loài. Bên cạnh đó, lý thuyết hóa phân loại học về nhóm alkaloid terpenoid indole cũng được tích hợp để giải thích mối tương quan giữa đặc điểm phân loại học và giá trị dược lý của loài Catharanthus roseus.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu của nghiên cứu bao gồm 4 mẫu thực vật dừa cạn tươi được thu thập trực tiếp và 2 trình tự đối chứng quốc tế mang mã số KC561139 và JN115007 tải từ Ngân hàng Gen Quốc tế NCBI. Phương pháp chọn mẫu là chọn mẫu có chủ đích, thu thập các cá thể trưởng thành khỏe mạnh, đại diện cho 3 kiểu hình màu hoa tại tỉnh Hà Giang (TIM_HG, TV_HG) và tỉnh Thái Nguyên (TIM_TN, TRANG_TN). Cỡ mẫu thực nghiệm gồm 4 mẫu đại diện được thuần hóa và chăm sóc trong cùng điều kiện ánh sáng và chế độ nước để loại trừ biến dị thích nghi môi trường.

Quy trình phân tích phân tử được thực hiện theo các bước nghiêm ngặt:

• Tách chiết DNA tổng số từ 200 mg mô lá non bằng phương pháp CTAB 2% với nitơ lỏng ở âm 196 độ C. Phương pháp CTAB được lựa chọn vì khả năng loại bỏ triệt để polysaccharide và polyphenol đặc thù trong lá dừa cạn.
• Khuếch đại đoạn gen rpoC1 qua phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu rpoC1-1f và rpoC1-3r, chu trình nhiệt 35 chu kỳ với nhiệt độ gắn mồi 55 độ C trong 40 giây. Kỹ thuật PCR Master Mix 2X tối ưu hóa độ chính xác của phản ứng nhân bản.
• Tinh sạch sản phẩm PCR qua cột lọc GenJET PCR Purification và giải trình tự nucleotide tự động trên hệ thống máy ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer bằng hóa chất BigDye Terminator v3.1.
• Xử lý số liệu và phân tích phát sinh chủng loại bằng các phần mềm tin sinh học chuyên dụng BioEdit, BLAST và DNAstar.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, về đặc điểm thực vật học, cả ba giống dừa cạn khảo sát đều có thân thảo cao tới 100 cm, phân cành nhiều, rễ cái cắm sâu từ 10 đến 20 cm (có thể đạt 35 đến 40 cm), lá đơn mọc đối dài 3 đến 8 cm với 12 đến 14 cặp gân phụ. Sự khác biệt hình thái rõ nét nhất nằm ở màu sắc cánh hoa và tâm hoa: giống hoa hồng tím có thân xanh phớt hồng, giống hoa trắng đỏ có cánh trắng tâm đỏ, và giống hoa trắng vàng có thân xanh nhạt cùng cánh trắng tâm vàng.

Thứ hai, nghiên cứu đã phân lập và nhân bản thành công đoạn gen rpoC1 với kích thước đồng nhất là 505 bp ở cả 4 mẫu nghiên cứu, mã hóa chuỗi peptide gồm 168 amino acid. Thành phần nucleotide ở các mẫu TIM_HG, TIM_TN và TV_HG gồm 139 base loại A, 161 base loại T, 84 base loại C và 121 base loại G; riêng mẫu TRANG_TN có 138 base loại A và 162 base loại T.

Thứ ba, phân tích BLAST khẳng định độ tương đồng chuỗi giữa các mẫu nghiên cứu với dữ liệu chuẩn trên NCBI đạt mức 99%. So sánh nội bộ cho thấy mẫu TIM_HG và TV_HG tương đồng 100% với mã số KC561139, trong khi mẫu TIM_TN đạt 99,6% và TRANG_TN đạt 99,4%.

Thứ tư, nghiên cứu phát hiện các vị trí đột biến thay thế nucleotide đơn lẻ tại các vị trí base 494, 495 và 496. Sự thay đổi này dẫn đến đột biến sai nghĩa tại vị trí amino acid thứ 165: mẫu TIM_HG và TV_HG mang Methionine, mẫu TIM_TN chuyển thành Serine, còn mẫu TRANG_TN chuyển thành Cysteine.

Thảo luận kết quả

Sự sai khác nucleotide tại các vị trí 494, 495 và 496 là minh chứng rõ ràng cho tính đa dạng di truyền ở cấp độ dưới loài của cây dừa cạn tại khu vực miền núi phía Bắc. Dữ liệu thực nghiệm có thể được trực quan hóa tối ưu thông qua bảng đối chiếu ma trận tương đồng nucleotide và sơ đồ cây phát sinh chủng loại Dendrogram xây dựng theo thuật toán Neighbor-Joining.

Sơ đồ hình cây phân chia 6 mẫu nghiên cứu thành hai nhánh rõ rệt với khoảng cách di truyền nucleotide đạt 5,4%. Nhánh thứ nhất bao gồm các mẫu thu thập tại Việt Nam, trong đó nhóm phụ gồm TIM_HG, TV_HG, TIM_TN liên kết chặt chẽ với nhau, còn TRANG_TN tách thành một phân nhóm độc lập. Đáng chú ý, khi so sánh ở cấp độ chuỗi amino acid suy diễn, khoảng cách di truyền giữa các mẫu giảm xuống chỉ còn 0,4%, phản ánh tính bảo thủ cao trong cấu trúc chức năng của protein RNA polymerase lục lạp. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu quốc tế về tính ổn định của gen rpoC1, khẳng định giá trị của chỉ thị này trong việc xây dựng hệ thống barcode phân biệt chuẩn xác các giống dừa cạn bản địa.

Đề xuất và khuyến nghị

• Xây dựng ngân hàng dữ liệu mã vạch DNA đa locus: Viện Dược liệu phối hợp cùng các trường đại học thực hiện tích hợp chỉ thị rpoC1 với các vùng gen matK, ITS và rbcL, hướng tới mục tiêu đạt tỷ lệ giám định chính xác 100% cho mọi dạng nguyên liệu dừa cạn thô và bột thuốc trong giai đoạn 2026-2028.
• Chuẩn hóa quy trình giám định phân tử nhanh: Cơ quan quản lý Dược và các trung tâm kiểm nghiệm cần áp dụng quy trình chiết xuất CTAB cải tiến kết hợp PCR định lượng, rút ngắn thời gian phân tích mẫu xuống dưới 24 giờ kể từ năm 2027.
• Quy hoạch vùng trồng dược liệu chuẩn GACP-WHO: Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tại các tỉnh Hà Giang, Thái Nguyên và vùng phụ cận cần hướng dẫn người dân chọn lọc giống thuần chủng, đảm bảo kiểm soát độ tinh sạch nguồn gen nhằm duy trì hàm lượng alkaloid toàn phần trong rễ đạt từ 0,7% đến 2,4%.
• Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống: Các viện công nghệ sinh học cần ứng dụng dấu chuẩn gen rpoC1 để chọn lọc các dòng dừa cạn hoa trắng có hoạt tính vincristine và vinblastine cao vượt trội, nâng cao sản lượng chiết xuất dược chất phục vụ sản xuất thuốc điều trị ung thư trong nước giai đoạn 2027-2030.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Dược học: Sử dụng số liệu giải trình tự gen rpoC1, bảng ma trận phân ly di truyền và quy trình tách chiết DNA làm tài liệu tham khảo trong giảng dạy và phát triển các đề tài phân loại học phân tử thực vật.
• Chuyên viên kiểm nghiệm tại các trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm: Khai thác quy trình phân tích PCR và dữ liệu đột biến nucleotide tại vị trí 494-496 để xây dựng quy chuẩn phát hiện dược liệu giả mạo và kiểm soát chất lượng nguyên liệu dừa cạn đầu vào.
• Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và đơn vị phát triển vùng trồng: Ứng dụng các đặc điểm thực vật học và dữ liệu phân loại giống hoa trắng, hoa hồng tím để chọn lọc nguồn giống thuần chủng, tối ưu hóa quy trình thu hái theo từng bộ phận thân, lá, rễ.
• Học viên cao học và sinh viên ngành Sinh học, Nông nghiệp công nghệ cao: Tham khảo phương pháp luận khoa học, cách thức xử lý dữ liệu tin sinh học bằng BioEdit, BLAST và phương pháp trình bày cây phát sinh chủng loại cho các công trình nghiên cứu chuyên sâu.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao gen rpoC1 lại được lựa chọn làm mã vạch DNA cho cây dừa cạn?

Gen rpoC1 nằm trong hệ gen lục lạp có cấu trúc vòng kép bền vững, kích thước trung bình 505 bp rất thuận lợi cho việc khuếch đại PCR và giải trình tự. Gen này sở hữu các vùng bảo thủ xen kẽ những vị trí đột biến điểm đặc thù, giúp phân biệt rõ ràng các giống cây mà không bị ảnh hưởng bởi môi trường bên ngoài.

Ba giống dừa cạn nghiên cứu có sự khác biệt gì ở cấp độ phân tử?

Phân tích trình tự cho thấy giống hoa hồng tím và hoa trắng vàng tại Hà Giang giống nhau 100%, trong khi mẫu hoa hồng tím Thái Nguyên sai khác ở 2 vị trí nucleotide và mẫu hoa trắng đỏ sai khác ở 3 vị trí nucleotide. Sự biến đổi này dẫn tới thay đổi amino acid thứ 165 giữa Methionine, Serine và Cysteine.

Hoạt chất quý trong cây dừa cạn tập trung nhiều nhất ở bộ phận nào?

Hàm lượng alkaloid toàn phần biến thiên rõ rệt theo cơ quan thực vật. Rễ cây chứa tỷ lệ hoạt chất cao nhất đạt từ 0,7% đến 2,4%, tiếp theo là thân chứa khoảng 0,46% và lá dao động từ 0,37% đến 1,15%, trong đó lá là nguồn chính để chiết tách vinblastine và vincristine.

Phương pháp tách chiết CTAB 2% sử dụng trong nghiên cứu có ưu điểm gì?

Phương pháp CTAB 2% kết hợp nghiền mô trong nitơ lỏng âm 196 độ C giúp phá vỡ hoàn toàn vách tế bào thực vật, đồng thời kết tủa và loại bỏ hiệu quả các hợp chất thứ cấp, tanin và polysaccharide. Nhờ đó, sản phẩm DNA tổng số thu được có độ tinh sạch cao, tạo băng điện di sắc nét.

Khoảng cách di truyền 5,4% ở cấp độ nucleotide phản ánh điều gì?

Khoảng cách di truyền 5,4% chứng minh giữa các giống dừa cạn tại miền Bắc Việt Nam đã có sự phân hóa di truyền nhất định ở mức dưới loài do điều kiện địa lý và chọn lọc tự nhiên. Tuy nhiên, khoảng cách amino acid chỉ 0,4% cho thấy chức năng sinh học của protein vẫn được bảo toàn nguyên vẹn.

Kết luận

• Đã xác định chi tiết các đặc điểm hình thái thực vật của 3 giống dừa cạn thu tại Hà Giang và Thái Nguyên, chỉ ra sự khác biệt đặc trưng về màu sắc cánh hoa, tâm hoa và sắc tố thân cây.
• Tách chiết thành công DNA tổng số đạt độ tinh sạch cao và nhân bản đặc hiệu đoạn gen lục lạp rpoC1 kích thước 505 bp bằng cặp mồi rpoC1-1f và rpoC1-3r.
• Xác định đầy đủ trình tự 505 nucleotide mã hóa 168 amino acid, phát hiện các điểm đột biến nucleotide tại vị trí 494, 495, 496 và sai khác amino acid tại vị trí 165.
• Đánh giá mức độ tương đồng chuỗi đạt từ 96,6% đến 100%, xác định khoảng cách di truyền 5,4% ở cấp độ nucleotide và 0,4% ở cấp độ amino acid suy diễn.
• Đóng góp nguồn dữ liệu trình tự chuẩn xác vào hệ thống mã vạch DNA quốc gia, tạo tiền đề khoa học vững chắc cho việc định danh dược liệu và bảo tồn nguồn gen quý.

Để tiếp tục hoàn thiện hệ thống cơ sở dữ liệu mã vạch phân tử, các nghiên cứu tiếp theo cần mở rộng phân tích các vùng gen matK và ITS trên các quần thể dừa cạn tại các vùng sinh thái khác nhau trong giai đoạn tới. Các tổ chức nghiên cứu và doanh nghiệp dược phẩm quan tâm đến quy trình phân tích di truyền hoặc hợp tác phát triển vùng trồng dược liệu chuẩn hóa có thể kết nối với nhóm tác giả qua kênh Học liệu Đại học Thái Nguyên để tiếp nhận chuyển giao kỹ thuật.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. CÂY DỪA CẠN 1. Hệ thống phân loại cây Dừa cạn Giống Catharanthus (thuộc họ trúc đào Apocynaceae) gồm có 8 loài, hầu hết là cây thân thảo lâu năm.

Trong đó, chỉ có loài Catharanthus pusillus có nguồn gốc từ Ấn Độ, còn tất cả các loài còn lại có nguồn gốc từ Madagasca, số lượng nhiễm sắc thể cho tất cả các loài Catharanthus đều là 2n=16 [1], [22]. Tám loài thuộc giống này đó là:  Catharanthus coriaceus Markgr. Madagascar;  Catharanthus lanceus (Bojer ex A. Madagascar;  Catharanthus longifolius (Pichon) Phichon.

Madagascar;  Catharanthus ovalis Markgr. Madagasca;  Catharanthus pusillus (Murray) G.Don India subcontinent;  Catharanthus roseus (L) G. Madagascar;  Catharanthus scintulus (Pichon) Pichon. Madagascar;  Catharanthus trichophyllus (Baker) Pichon.

Những giống Catharanthus có nguồn gốc từ Madagascar thường dùng để làm cảnh và được biết đến nhiều nhất là loài Madagascar Periwinkle hay còn gọi là vinca nhờ vào khả năng chịu hạn và chịu nóng của nó. Ngoài việc có công dụng như một loài cây cảnh, từ lâu dịch chiết alkaloid từ Catharanthus roseus đã được sử dụng trong y học dân gian như một loài thuốc chống đái Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 5 tháo đường, lợi tiểu, chữa tiêu chảy, xuất huyết, giúp vết thương mau lành… và ngày nay người ta còn tìm được một công dụng hết sức quan trọng của loài Catharanthus roseus đó là khả năng trị bệnh ung thư rất hiệu quả [1], [22]. Dừa cạn có tên khoa học là Catharanthus roseus (L) G. Don; Vinca rosea L; Lochnera rosea Reich, tên gọi khác là bông dừa, hoa hải đằng, trường xuân hoa… Về phân loại khoa học, dừa ca ̣n có tên khoa học là Catharanthus roseus (L.

Don, thuô ̣c Giới (regnum) Plantae, bộ (ordo) Gentianales, họ (familia) Apocynaceae, chi (genus) Catharanthus, loài (species) C. Catharanthus roseus giàu alkaloid thuộc loại alkaloid terpenloid indole, trong nhóm này có ba giống dừa ca ̣n khác nhau về màu sắ c hoa, ‘roseus’ với hoa màu tím hoặc hồng, ‘ocellatus’ với hoa màu trắng nhụy đỏ, ‘albus’ với hoa màu trắng [22]. Hoa của ba giống Catharanthus A: Catharanthus roseus var. roseus B: Catharanthus roseus var.

ocellatus C: Catharanthus roseus var. Giá trị sử dụng của cây dừa cạn Trong dừa cạn có trên 10 alkaloid, rất phức tạp, người ta đã phát hiện có hơn 60 chất khác nhau như: ajmalicin, tetrahydroalstonin, serpentin, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 lochnerin, akuammin, reserpin. Trong tất cả các alkaloid, có loại vinblastin và vincritin là hai chất có tác dụng tốt trong chữa các ung thư về máu, ajmalicin là thuốc điều trị tim mạch rất tốt cho rối loạn thần kinh tim. Nhưng chỉ mới phát hiện ra những dược tính của dừa cạn trong việc áp dụng chữa bệnh vì trong tài liệu cổ của y học cổ truyền không thấy đề cập đến cây này.

Tuy vậy, y học cổ truyền một số nước cũng có ghi lại một vài kinh nghiệm sử dụng dừa cạn để chữa bệnh. Ví dụ, ở Ấn Độ, châu Úc, nam châu Phi, quần đảo Antilles, người ta dùng dừa cạn sắc uống để chữa bệnh tiểu đường cho thấy kết quả rất khả quan. Ngoài ra, rễ dừa cạn còn được dùng để tẩy giun, chữa sốt, làm thuốc thông tiểu, điều kinh, trị tăng huyết áp, chữa sốt rét, kiết lị, tiêu hóa kém. Bộ phận dùng để làm thuốc của dừa cạn là rễ, lá hoặc cả cây.

Thông thường, người ta thường nhổ nguyên cả bụi cây dừa cạn về rửa sạch, cắt nhỏ, phơi khô để cất dùng dần. Trước khi sử dụng có thể sao qua cho thơm rồi sắc nước uống. Tùy theo mục đích trị liệu, dừa cạn có thể được phối hợp với các vị thuốc khác hoặc dùng độc vị [1]. Năm 1958, xuất phát từ kinh nghiệm dùng dừa cạn chữa khối u của người dân Ấn Độ, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu và phát hiện chất kháng ung thư trong lá cây dừa cạn là vincaleucoblastine (còn gọi là vinblastin), 4 năm sau, Svoboda và cộng sự cũng tìm thêm một alkaloid nữa là vincaleucocristin (còn gọi là vincristin).

Những thực nghiệm lâm sàng cho thấy, chiết xuất vinplastin, vincristin có tác dụng làm giảm bạch cầu, ức chế mạnh sự phân bào. Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với tubulin, là protein ống vi thể ở thoi phân bào, phong bế sự tạo thành các vi ống này và gây ngừng phân chia tế bào ở pha giữa. Ở nồng độ cao, thuốc diệt được tế bào, còn ở nồng độ thấp làm ngừng phân chia tế bào [23]. Hàm lượng các alkaloid này trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 7 dừa cạn rất nhỏ (khoảng 1 phần vạn trong lá dừa cạn khô đối với vinblastin còn đối với vincristin thì ít hơn 10 lần nữa).

Vì thế, quá trình điều chế hai alkaliod từ cây dừa cạn là một quá trình phức tạp và chi phí giá thành cao [3]. Còn với khoa học hiện đại, từ năm 1952, y học đã phát hiện ra dược tính của dừa cạn. Xuất phát từ việc bác sĩ Clark Noble ở Canada đã nhận được một gói chuyển phát nhanh loại cây này do một người dân gửi tới với lời giới thiệu “dân địa phương đã dùng chúng trị bệnh tiểu đường” nên ông đã đưa vào phân tích. Kết quả khá bất ngờ, thay vì tác dụng hạ đường huyết trong máu, ông lại phát hiện ra hoạt tính trị bệnh ung thư bạch cầu của loại cây này.

Dừa cạn đã được đưa vào bệnh viện thử nghiệm và trở thành cây dược liệu chính thức theo y khoa hiện đại. Khi dùng dừa cạn làm thuốc nên chọn loại hoa trắng vì hoạt chất của chúng cao hơn cây hoa đỏ, hồng. Thành phần vincristin có tác dụng với bệnh nhân ung thư nhưng chúng lại là thành phần gây hại cho thai nhi, ức chế hệ thần kinh. Vì vậy dừa cạn là cây dược liệu có độc, tránh dùng cho phụ nữ có thai, người huyết áp thấp.

Dừa cạn được xem là đặc hữu của vùng đất Madagascar với giá trị dược tính cao nhất thế giới. Hiện nay hàng năm người dân Madagascar xuất khẩu đến ngàn tấn dừa cạn phơi khô ra nước ngoài để làm dược liệu. Công ty Dược liệu Trung ương Việt Nam II cũng đã xuất khẩu cây này từ thập niên 1990. Thị trường dược phẩm Mỹ, Pháp, Nhật, Việt Nam… có nhiều loại thuốc được bào chế từ dừa cạn như thuốc trị cao huyết áp, ung thư (máu, tinh hoàn, dạ con)…Kết quả phân tích của bác sĩ Clark, chiết xuất dừa cạn giàu alkaloid (gồm các loại: vinblastin, vincristin, tetrahydroalstonin, pirinin, vindolin, catharanthin, vindolinin, ajmalicin….

Trong đó thành phần vincristin, vinblastin khi tách chiết thành dạng thuốc tiêm sẽ có tác dụng lớn trong ức chế tế bào hoặc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 8 sự phân bào. Cho nên chúng hạn chế được việc hình thành bạch cầu thừa ở bệnh nhân ung thư máu. Đặc biệt đến nay, y khoa vẫn chưa tìm ra phương pháp gì điều trị bệnh bạch cầu tốt hơn nên chiết xuất dừa cạn càng trở nên quý với bệnh nhân ung thư máu. Tuy nhiên không phải cứ dùng trà dừa cạn thì chữa được ung thư, bởi một liều tiêm vincristin, vinblastin có hàm lượng rất cao, việc dùng các thành phần này cũng dễ bị ngộ độc nên cần có sự hướng dẫn của bác sỹ điều trị.

Hoạt chất trong dừa cạn phụ thuộc vào nơi trồng và thu hái. Giống trồng ở Việt Nam được đánh giá là thảo dược tốt tương đương dừa cạn ở Madagascar, chứa khoảng 0,1- 0,2% alkaloid toàn phần. Tỷ lệ alkaloid trong rễ (0,7-2,4%) cao hơn trong thân (0,46%) và lá (0,37-1,15%). Các nước Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc… cũng đang ra sức bào chế thuốc từ loại cây này [22].

Theo từ điển Cây thuốc Việt Nam, dừa cạn có vị hơi đắng, tính mát, có độc, có tác dụng kháng ung thư, trấn tĩnh, an thần, hạ huyết áp, thanh nhiệt, giải độc, hoạt huyết, tiêu thũng. Dừa cạn được nghiên cứu làm thuốc kìm hãm sự phát triển tế bào và được chỉ định trong điều trị bệnh Hodgkin (một loại ung thư hệ bạch huyết), bệnh bạch cầu lymphô cấp, một số ung thư. Trong dân gian vẫn dùng trị cao huyết áp, trị bệnh đái đường, điều kinh, chữa tiêu hóa kém và chữa lỵ, thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít. Có người dùng trị ung thư máu, ung thư phổi [1], [23].

Ở Trung Quốc, toàn cây dừa cạn dùng trị cao huyết áp, bệnh bạch huyết lymphô cấp tính và ung thư, mụn nhọt độc. Còn ở Nouvelle- Calédonie (châu Đại Dương), dừa cạn cũng là vị thuốc chống ung thư. Ở Australia, nước hãm rễ cây dừa cạn là loại thuốc dân gian chống tiểu đường [36]. Theo Tiến sĩ Võ Văn Chi, từ năm 1926 người ta đã tìm thấy một phức hợp có tính chất của digitalin, tới năm 1944 đã tìm thấy một hoạt chất có chức năng của insulin, điều đó cắt nghĩa được tác dụng hạ đường huyết của dừa cạn [1], [19].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 9 Theo kinh nghiệm sử dụng trong y học dân tộc của một số nước, rễ dừa cạn có tác dụng tẩy giun, chữa sốt, lị trực trùng, chứng tiêu khát, u xơ tuyến tiền liệt. Thân và lá có tính chất săn da (astringent), lọc máu (despuratif), dùng chữa một số bệnh ngoài da, sốt rét, bệnh máu trắng, thông tiểu. Kinh nghiệm dùng dừa cạn chữa bệnh tiểu đường cũng được ghi nhận ở Ấn Ðộ, châu Úc, nam châu Phi, quần đảo Antilles, nhưng chứng minh bằng thực tế khoa học thì chưa có [1], [22]. Chính nhờ thực nghiệm trên chuột mà các nhà khoa học Canada đã phát hiện tác dụng làm giảm bạch cầu của một số chất tách được từ dừa cạn và dẫn đến sự phát hiện ra chất vincaleucoblastin và 3 alkaloid khác cũng có tác dụng chống u là leurosin, leurocristin và leurosidin.

Ngoài ra người ta còn phát hiện tác dụng tẩy giun khá mạnh, tác dụng lợi tiểu của catharanthin, vindolinin và vindolidin. Những thí nghiệm dùng trên người bệnh được bắt đầu vào những năm 1960 ở Mỹ, Pháp và một số nước khác [1], [22]. Ở nước ta, nhân dân dùng dừa cạn dưới dạng thuốc sắc để làm thuốc lợi tiểu, chữa huyết áp, tiểu đường, ngày dùng 10-16g. Các bệnh về nội tiết như đái tháo đường, thông tiểu, viêm đường tiết niệu, tiểu tiện có máu, ít nước tiểu và trong bế kinh.

Rễ và lá dùng rất tốt trong hạ huyết áp, nếu cần ta cho thêm cây hoa đại (bông sứ), cỏ mần trầu và lá lạc tiên mỗi thứ khoản 20g sắc nước uống liên tục trong nhiều tháng liền đối với huyết áp cao ở giai đoạn đầu dù có nguyên nhân hay không có nguyên nhân vẫn rất tốt.