Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc cây họ đậu (Fabaceae), là cây trồng quan trọng không chỉ ở Việt Nam và còn xuất hiện ở gần 200 quố c gia trên thế giới. Đậu tương là cây trồng cạn ngắn ngày , có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao. Đối với nông nghiệp, đậu tương là cây trồng thân thiện với môi trường và thúc đẩy phát triển kinh tế nông nghiệp. Đậu tương được ví như nhà máy sản xuất đạm tự nhiên nhờ các nốt sần trong rễ cây giúp cải thiện chất lượng đất thông qua khả năng hấp thụ nitơ tự nhiên.
Các sản phẩm từ đậu tương đã và đang được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới. Nhiều nghiên cứu cho thấy đậu tương tốt cho sức khỏe con người nhờ có chứa thành phần isoflavone. Isoflavone là dươ ̣c chất có nguồn gốc thảo mộc , có thể làm giảm sự xuất hiện của một số loại ung thư, giảm các triệu chứng mãn kinh, ngăn ngừa các bệnh về tim mạch, béo phì, loãng xương, ngăn chặn sự gia tăng cholesterol trong máu. Bên cạnh đó isoflavone giúp phụ nữ tăng cường chất lượng của da, giảm được các nếp nhăn, giảm độ sâu của nếp nhăn mắt, làm cho da săn chắc hơn nhờ tăng cường kết nối collagen, đồng thời cải thiện màu sắc và giữ ẩm cho da.
Con đường sinh tổng hợp isoflavone ở đâ ̣u tương được biết là một nhánh của con đường phenylpropanoid với hai enzyme chìa khóa là chalcone synthase (CHI) và isoflavone synthase (IFS) để tổng hợp isoflavone genistein và daidzein có khả năng chống oxi hóa mạnh nhất. Chúng được tìm thấy chủ yếu ở đậu tương và các loại cây họ đậu khác. Tuy nhiên, hàm lượng isoflavone trong đậu tương rấ t thấ p, khoảng từ 50 – 3000 µg/g và tồn tại ở hai dạng chính là glycoside và aglucone. Dạng glycoside có trọng lượng phân tử lớn, chiếm tới trên 90% isoflavone tổng số được cho là hấp thụ hạn chế trong hệ tiêu hóa người, trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4 khi đó, dạng aglucone được hấp thụ nhanh hơn , nhưng hàm lươ ̣ng la ̣i rất thấp , chỉ chiếm từ 1% – 5% isoflavone tổng số.
Chính vì vậy nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen vào việc cải thiện theo hướng nâng cao hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương là rất cần thiết. Kỹ thuật biể u hiê ̣n gen ở thực vâ ̣t cho phép tạo ra các dòng cây có khả năng tổng hợp isoflavone với hàm lượng cao , tạo nguyên liê ̣u phu ̣c vụ sản xuất các chế phẩ m sinh ho ̣c đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của công tác chăm sóc và bảo vêsư ̣ ́ c khỏe con người ở nước ta. Xuất phát từ những lý do trên , đề tài luận văn thạc sĩ đã được chúng tôi lựa chọn và thực hiện là: “Nghiên cứu đặc điểm của gen mã hóa chalcone isomerase phân lập từ cây đậu tương”. Mục tiêu nghiên cứu Phân tích được đặc điểm của gen mã hóa chalcone synthase trong con đường sinh tổ ng hơ ̣p isoflavone phân lâ ̣p từ hai giống đâ ̣u tương khác nhau về hàm lượng isoflavone.
Nội dung nghiên cứu 3. Phân tích hàm lượng isoflavone trong hạt nảy mầm của ba giống đậu tương Viê ̣t Nam là ĐT51, DT90 và DT84. Nghiên cứu thông tin về gen mã hóa chalcone isomerase (CHI), thiế t kế că ̣p mồ i PCR nhân gen CHI, tách dòng và xác định trình tự gen CHI. Phân tích sự đa da ̣ng về trình t ự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen CHI.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đậu tƣơng Kế t quả phân tić h đă ̣c điể m của gen CHI và xác định những điểm sai khác về trình tự nucleotide của gen CHI và trình tự amino acid suy diễ n giữa c ác giố ng đâ ̣u tương khác nhau về hàm lươ ̣ng daidzein và genistein là cơ sở để giải thích mối liên quan giữa gen CHI với hoa ̣t đô ̣ng tổ ng hơ ̣p isoflavone ở đâ ̣u Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Đồng thời cũng là cơ sở sử dụng đoạn mã hó a của gen CHI trong viê ̣c thiế t kế vector chuyể n gen trong mu ̣c đić h nâng cao hàm lươ ̣ng isoflavone trong đâ ̣u tương bằ ng kỹ thuâ ̣t chuyể n gen. Kế t quả xác đinh ̣ hàm lươ ̣ng daidzein và genistein của các giố ng đâ ̣u tương nghiên cứu cung c ấp dữ liệu cho chọn giống đậu tương theo định hướng nâng cao hàm lươ ̣ng isoflavone của đâ ̣u tương. Kết quả nghiên cứu của luận văn là tư liệu khoa học phục vụ cho mục đích nghiên cứu và giảng dạy công nghê ̣ sinh ho ̣c.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. CÂY ĐẬU TƢƠNG 1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm thực vật học của cây đậu tƣơng Cây đậu tương hay còn được gọi là cây đậu nành có tên khoa học là Glycine max (L.) Merrill, là loại cây ăn hạt, thân thảo thuộc họ đậu (Fabaceae), đậu tương mang bộ nhiễm sắc thể 2n=40.
Cây đâ ̣u tương đươ ̣c xế p trong hê ̣ thố ng như sau: Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Fabales Họ: Fabaceae Phân họ: Faboideae Giống: Glycine Loài: Max Cây đậu tương xuất hiện đầu tiên từ 1100 năm trước Công nguyên tại vùng Đông Bắc Trung Quốc. Theo nhiều tài liệu đã được nghiên cứu thì cây đậu tương có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu phía Bắc Trung Quốc từ thời các triều đại Phong kiến, sau đó có nhiều tài liệu cho rằng cây đậu tương được thuần hoá dưới triều đại Shang, hay còn gọi là triều đại nhà Thương, vào khoảng thế kỉ XVII đến thế kỉ XI trước Công Nguyên, sau đó lại được lan truyền sang Nhật Bản, Triều Tiên vào khoảng thế kỷ thứ VIII, và tiếp tục được lan truyền sang các nước châu Á khác như Thái Lan, Malaysia, Hàn Quốc, Việt Nam [1]. Đến thế kỷ XVII, cây đậu tương được giới thiệu vào Châu Âu bởi các nhà thực vật học và được đặt tên là Glycine max. Sau đó đến thế kỷ XVIII cây đậu tương mới được du nhập vào Mỹ, nhưng có nhiều kết quả cho thấy do có sự phù Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 7 hợp về điều kiện khí hậu và đất đai nên việc trồng trọt đậu tương tại Mỹ phát triển mạnh mẽ do đó đã cho sản lượng đậu tương tăng lên nhanh chóng, đến nay đậu tương vẫn được coi là cây trồng chính đem lại giá trị kinh tế cao tại Mỹ và nhiều quốc gia khác trên thế giới: Trung Quốc, Brazil.
Hiện nay, cây đậu tương vẫn đang là cây được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới bởi đậu tương là cây công nghiê ̣p, cây thực phẩ m đem lại giá trị kinh tế cao nhờ sự vượt trội hơn hẳn so với các cây trồng khác bởi hàm lượng các chất dinh dưỡng như protein, lipid cao, chứa nhiều vitamin, các khoáng chất và nhiều hoạt chất thảo mộc có lợi cho sức khoẻ con người. Tại Việt Nam đậu tương được ví như “vàng mọc từ đất” bởi đậu tương cho sản lượng cao, cải tạo đất và là cây trồng xen canh gối vụ với nhiều loại cây trồng, chứa nhiều hàm lượng protein đem lại nhiều giá trị kinh tế. Cây đậu tương là loại cây thân thảo, bụi nhỏ và là cây hằng năm. Thân cây mảnh, cao khoảng từ 0,8m đến 0,9 m, có lông, cành hướng lên phía trên.
Một cây đậu tương hoàn chỉnh bao gồm rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt. Rễ đâụ tương Rễ đậu tương là cây rễ cọc, bộ rễ bao gồm rễ cái (rễ chính) và nhiều rễ bên hay còn gọi là rễ phụ, trên rễ cái mọc ra nhiều rễ phụ là các rễ phụ cấp 2 và rễ phụ cấp 3. Trong điều kiện bình thường rễ cái ăn sâu vào đất khoảng 20-30 cm hoặc có khi ăn sâu đến 15oCm; thông thường các rễ con tập trung nhiều nhất ở độ sâu 6-2oCm. Bộ rễ phát triển và được chia thành 2 thời kỳ chính: (i) Thời kỳ thứ nhất: rễ cái và rễ phụ đầu tiên phát triển mạnh và sinh ra nhiều rễ con, thời kỳ này kéo dài từ 30-40 ngày sau mọc.
(ii) Thời kỳ thứ hai: lớp rễ đầu tiên phát triển chậm dần, rễ con không phát triển chỉ có các rễ phụ nhỏ kéo dài ra và phát triển cho tới gần thu hoạch. Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần chứa các vi khuẩn Rhizobium japonicum sinh sống, loại vi khuẩn này có dạng hình gậy hoặc hình cầu quan sát Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 8 được dưới kính hiển vi điện tử, vi khuẩn Rhizobium japonicum sống trong lòng đất, có khả năng cố định đạm từ khí trời, mỗi một cây họ đậu có vài trăm nốt sần phân bố đồng đều trên các rễ, ban đầu khi mới hình thành các nốt sần có màu sữa sau đó phát triển có màu hồng. Quá trình hình thành nốt sần kéo dài 16-21 ngày, phát triển nhiều mạnh nhất vào lúc đậu tương ra hoa và làm quả. Giữa vi sinh vật nốt sần với cây đậu tương chúng có mối quan hệ cộng sinh, cây cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoạt động và ngược lại vi khuẩn lại tích hợp nitơ tự do của không khí chuyển sang đạm hữu cơ để cây có thể sử dụng được.
Cây đậu tương càng nhiều chất dinh dưỡng cho vi sinh vật hoạt động thì vi sinh vật càng phát triển và tích lũy đạm được càng nhiều cho cây sinh trưởng và phát triển tốt. Thân, cành đâụ tương Thân cây đậu tương thuộc thân thảo có hình tròn, chia đốt, ít phân cành, trên thân có nhiều lông nhỏ. Thân đậu tương thường đứng hoặc có khi thân bò hay nửa bò, khi còn non thân có màu xanh hoặc tím, khi về già chuyển sang màu nâu nhạt, màu sắc của thân khi còn non có liên quan chặt chẽ với màu sắc của hoa sau này. Nếu thân lúc còn non có màu xanh thì hoa màu trắng và nếu khi cây còn non thân có màu tím thì hoa màu tím đỏ.
Thân cao trung bình 0,5- 1,2 m hoặc cũng có khi cao nhất đến 1,5m, trên thân mang 14-15 lóng, các lóng ở phía dưới thường ngắn, các lóng ở phía trên thường dài. Tùy theo giống và thời vụ gieo mà chiều dài lóng có sự khác nhau thường biến động từ 3-10 cm.