CHƯƠNG 1.3 Ý nghĩa đề tài -------------------------------------------------------------------------------- 2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về enzyme----------------------------------------------------------------------- 3 2.1 Định nghĩa về enzyme-------------------------------------------------------------- 3 2.2 Bản chất enzyme -------------------------------------------------------------------- 3 2.3 Tính chất của enzyme -------------------------------------------------------------- 4 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác------------------ 5 2.2 Enzyme cố định------------------------------------------------------------------------------ 6 2.2 Tính chất ưu nhược điểm của enzyme cố định---------------------------------- 6 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme cố định---------------------------- 7 2.4 Các phương pháp cố định enzyme------------------------------------------------ 8 2.5 Vật liệu cố định enzyme --------------------------------------------------------- 11 2.6 Ứng dụng của enzyme cố định -------------------------------------------------- 14 2.7 Tình hình nghiên cứu enzyme cố định trong và ngoài nước ---------------- 15 2.1 Định nghĩa enzyme protease ---------------------------------------------------- 17 2.2 Phân loại enzyme protease------------------------------------------------------- 18 2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease----------------------------------------------- 19 2.4 Ứng dụng của enzyme protease ------------------------------------------------- 23 2.4 Tổng quan về nấm mốc Aspergillus oryzae-------------------------------------------- 26 2.1 Khái quát về nấm mốc Aspergillus oryzae ------------------------------------ 26 2.2 Sinh tổng hợp enzyme protease ở Aspergillus oryzae----------------------- 27 CHƯƠNG 3. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm--------------------------------------------------------------------- 31 3.1 Nguồn gốc mẫu thí nghiệm ------------------------------------------------------ 31 3.4 Dụng cụ và thiết bị---------------------------------------------------------------- 31 3.4 Quy trình thu nhận và cố định enzyme ------------------------------------------------- 34 3.5 Phương pháp nghiên cứu ----------------------------------------------------------------- 35 3.1 Phương pháp giữ giống ---------------------------------------------------------- 35 3.2 Phương pháp cấy giống ---------------------------------------------------------- 35 3.3 Thu nhận CPE từ canh trường Aspergillus oryaze --------------------------- 36 3.4 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford------------------- 37 3.5 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến--------------- 40 3.6 Cố định enzyme protease trên natri alginate bằng phương pháp nhốt ----- 42 3.6 Phương pháp xử lý số liệu---------------------------------------------------------------- 43 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xây dựng đường chuẩn albumin -------------------------------------------------------- 44 4.2 Xây dựng đường chuẩn Tyrosin --------------------------------------------------------- 44 4.3 Xác định hàm lượng protein và hoạt độ protease của dịch lọc enzyme ------------ 45 4.4 Xác định hàm lượng protein và hoạt độ protease của chế phẩm enzyme ---------- 45 4.5 Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme protease từ canh trường Aspergillus oryzae-----46 4.6 Hiệu suất hoạt độ CPE so với canh trường ban đầu ---------------------------------- 46 4.7 Độ tinh sạch của chế phẩm enzyme protease ------------------------------------------ 47 4.8 Khảo sát nồng độ natri alginate để cố định enzyme ---------------------------------- 47 4.9 Khả năng tái sử dụng của enzyme cố định --------------------------------------------- 48 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.2 Kiến nghị ----------------------------------------------------------------------------------- 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.
Cấu trúc phân tử Natri alginate -------------------------------------------------- 12 Hình 2. Cấu trúc phân tử protease --------------------------------------------------------- 17 Hình 2. Vi khuẩn Bacillus subtilis -------------------------------------------------------- 21 Hình 2. Nấm mốc Penicillium ------------------------------------------------------------- 22 Hình 2.
Xạ khuẩn Streptomyces fradiae -------------------------------------------------- 22 Hình 2. Nấm mốc Aspergillus oryzae----------------------------------------------------- 26 Hình 2. Cấu tạo nấm mốc------------------------------------------------------------------- 26 Hình 3. Giữ giống trên ống nghiệm ------------------------------------------------------- 35 Hình 3.
Erlen chứa sinh khối nấm mốc Aspergillus oryzae---------------------------- 36 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3. Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn albumin --------------------------------- 39 Bảng 3. Số liệu xác định hoạt độ enzyme protease ------------------------------------- 41 Bảng 4. Sự biến đổi giá trị ∆OD theo nồng độ albumin chuẩn------------------------ 44 Bảng 4.
Sự biến đổi giá trị ∆OD theo nồng độ Tyrosin chuẩn ------------------------ 44 Bảng 4. Hàm lượng protein và hoạt độ enzyme protease của dịch lọc enzyme ---- 45 Bảng 4.Hàm lượng protein và hoạt độ enzyme protease của chế phẩm enzyme thô khi tủa bằng cồn 960 --------------------------------------------------------------------------- 46 Bảng 4. Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme protease từ canh trường ------------- 47 Bảng 4. Hiệu suất hoạt độ CPE so với canh trường ban đầu -------------------------- 47 Bảng 4.
Độ tinh sạch của CPE protease -------------------------------------------------- 47 Bảng 4. Khảo sát nồng độ natri alginate để cố định enzyme protease--------------- 48 Bảng 4. Kết quả hoạt độ protease của enzyme cố định--------------------------------- 48 Bảng 4. Hoạt độ enzyme protease qua các lần tái sử dụng --------------------------- 49 DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 4.
Đường chuẩn albumin ----------------------------------------------------------- 44 Đồ thị 4. Đường chuẩn Tyrosin------------------------------------------------------------ 45 Đồ thị 4.3 Nồng độ natri alginate để cố định enzyme protease-------------------------- 48 Đồ thị 4.4 Hoạt độ enzyme protease qua các lần tái sử dụng ---------------------------- 49 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT HđR : Hoạt độ riêng. AU : Độ hấp thu. OD : Optical density.
CPE : Chế phẩm enzyme. TCA : Trichloacetic acid. UI : Đơn vị hoạt tính. CBB : Coomasie Brillant Blue.
PGA : Potato glucose agar. mg Pro : milligram protein. CT : Canh trường. pHopt : pH tối ưu.
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm phomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp. Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật.
Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn (Bacillus subtilis, B.thermorpoteoliticus) và một số giống thuộc chi Clostridium, nấm mốc (Aspergillus Oryzae, A.saitoi, Penicillium chysogenum) và xạ khuẩn (Streptomyces grieus, S. Hiện nay, việc nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme protease cũng luôn được quan tâm. Phương pháp cố định enzyme là một trong những hướng nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme. Bằng cách cố định enzyme trong chất mang không tan trong nước, enzyme có thể được tách ra khỏi cơ chất một cách dễ dàng sau phản ứng.
Thêm vào đó enzyme cố định được tái sử dụng nhiều lần khắc phục tình trạng khan hiếm enzyme như hiện nay. Với những lý do nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tách chiết enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae và cố định lên chất mang natri alginate để nâng cao hiệu suất sử dụng của enzyme. Thu nhận, cố định enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae lên chất mang natri alginate. Thu nhận enzym protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae.
Cố định enzyme protease trên chất mang natri alginate và khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cố định. 2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về enzyme.1 Định nghĩa enzyme. Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp.2 Bản chất enzyme.1 Bản chất sinh học. Enzyme là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng sinh học.
Như vậy, bản chất sinh học của enzyme là sản phẩm của các quá trình sinh học và thực hiện các phản ứng sinh hóa trong và ngoài tế bào vi sinh vật. Các loại enzyme đều có những đặc tính sinh học chung như sau: - Enzyme được tạo ra trong tế bào sinh vật. - Enzyme tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi enzyme được tách khỏi tế bào sống. - Enzyme tham gia phản ứng trong điều kiện ôn hòa.
- Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học. - Enzyme có thể được thực hiện một phản ứng. - Phản ứng enzyme là những phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. - Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng.2 Bản chất hóa học enzyme.
Bản chất hóa học của enzyme là protein. Dựa vào thành phần hóa học của enzyme, người ta chia enzyme thành hai nhóm lớn: Enzyme một cấu tử: là enzyme trong thành phần cấu tạo chỉ có protein. Các enzyme đơn cấu tử thường gặp như: urease, pepsin, amylase… Enzyme hai cấu tử: là enzyme trong thành phần của nó ngoài protein còn có một phần phi protein gọi là nhóm ngoại. Người ta gọi phần protein là “feron” hay “apoenzym”, phần nhóm ngoại là “agon” hay “coenzyme”.
Về bản chất hóa học của nhóm ngoại enzyme rất phong phú và đa dạng. Thường nhóm ngoại enzyme là dẫn 3 xuất của vitamin, các kim loại, nucleotide…Các enzyme hai cấu tử như: catalase, peroxydase, xitocrom… 2.3 Trung tâm hoạt động của enzyme. Không phải toàn bộ enzyme tham gia trực tiếp liên kết với cơ chất, quyết định hoạt tính xúc tác của enzyme mà chỉ có một phần (thường kích thước rất nhỏ so với toàn bộ phân tử enzyme), phần này được gọi là “ trung tâm hoạt động của enzyme ”. Số trung tâm hoạt động của phân tử enzyme có thể là một hay nhiều hơn.
Với enzyme một cấu tử thì trung tâm hoạt động gồm một số nhóm chức của acid amin liên kết lại với nhau…Nhờ có cấu trúc bậc 3, bậc 4 các nhóm này tuy nằm các xa nhau trong mạch polypeptide, nhưng do xoắn cuộn mạch mà được gần nhau. Với enzyme hai cấu tử ngoài một số nhóm chức của acid amin còn có nhóm ngoại tham gia trung tâm hoạt động enzyme (- SH, - OH, -NH2, α –COOH,…).3 Tính chất của enzyme.1 Cơ chế tác dụng của enzyme. Enzyme có cường lực xúc tác mạnh hơn rất nhiều lần so với xúc tác vô cơ nghĩa là lượng enzyme cần rất ít nhưng chuyển hóa một lượng cơ chất rất lớn trong một thời gian rất ngắn. Xúc tác phản ứng của enzyme cũng như xúc tác thông thường khác, nghĩa là có giai đoạn tạo thành phức chất trung gian (ES) bền vững giữa cơ chất (S) và enzyme (E).
Khi tạo thành phức (ES), dưới tác dụng của enzyme, cấu tạo (S) bị thay đổi, phân tử cơ chất (S) bị phân cực, các điện cực được phân phối lại, do đó làm thay đổi sự phân bố điện tích, giảm độ bền các liên kết trong phân tử của (S) điều đó dẫn đến làm giảm năng lượng hoạt hóa, làm tăng tốc độ phản ứng.2 Tính đặc hiệu xúc tác của enzyme. Khác với xúc tác vô cơ, enzyme chỉ tác dụng lên một loại cơ chất nhất định hoặc chỉ một cơ chất duy nhất hoặc chỉ xúc tác một kiểu phản ứng hóa học nhất định. Tính chất này gọi là tính đặc hiệu hay là tính chuyên biệt cơ chất của enzyme, đây là một trong những tính chất đặc trưng của enzyme khác so với xúc tác thông thường.4 Các yếu tố ảnh hưởng vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất. Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng sẽ phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất.