Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ không đều merrf ở người việt nam 14

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ không, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề

Trường đại học

Đại học Quốc gia Hà Nội

Người đăng

Ẩn danh

Thể loại

luận văn thạc sĩ khoa học

2015

100
0
0

Phí lưu trữ

35 Point

Mục lục chi tiết

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA TY THỂ NGƯỜI

1.1.1. Cấu trúc của ty thể

1.1.2. Chức năng của ty thể

1.1.3. Ty thể hoạt động như một nhà máy năng lượng của tế bào

1.1.4. Ty thể và quá trình lão hóa

1.1.5. Ty thể và quá trình tự chết của tế bào

1.1.6. Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể

1.1.6.1. Hệ gen ty thể
1.1.6.2. Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể

1.1.7. Tính chất dị tế bào chất và tốc độ đột biến của ty thể

1.2. ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ VÀ CÁC BỆNH LIÊN QUAN

1.2.1. Các loại đột biến gen ty thể

1.2.2. Đột biến điểm

1.2.3. Đột biến cấu trúc mtDNA

1.2.4. Các bệnh do đột biến gen ty thể

1.2.5. Hội chứng gây ra bởi các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa tRNA

1.2.6. Các hội chứng liên quan đến các đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa protein

1.2.7. Các bệnh liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa rRNA

1.2.8. Bệnh gây nên bởi các đột biến khác trên mtDNA

1.3. HỘI CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẬT CƠ VỚI SỢI CƠ KHÔNG ĐỀU (MERRF)

1.3.1. Các đột biến của hội chứng MERRF

1.3.2. Những tác động của hội chứng MERRF trên người bệnh

1.3.3. Các phương pháp phát hiện đột biến MERRF

1.3.3.1. Phát hiện đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng PCR kết hợp với RFLP
1.3.3.2. Phân tích đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng xác định trình tự gen
1.3.3.3. Kỹ thuật đa dạng cấu hình sợi đơn SSCP (single-stranded conformational polymorphism)
1.3.3.4. Định lượng đột biến gen ty thể bằng phương pháp real-time PCR
1.3.3.5. Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng hệ thống cảm biến sinh học

2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mẫu bệnh phẩm

2.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác

2.3. Máy móc và trang thiết bị

2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1. Tách chiết DN tổng số

2.4.2. Kiểm tra và định lượng DN tách chiết

2.4.3. Nhân bản đoạn gen ty thể bằng kỹ thuật PCR

2.4.4. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn phân cắt giới hạn (PCR-RFLP)

2.4.5. Điện di trên gel agarose

2.4.6. Điện di trên gel polyacrylamide

2.4.7. Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu axit nucleic (LNA-locked nucleic acid)

2.4.8. Giải trình tự đoạn gen chứa đột biến

3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. THU THẬP MẪU MẪU BỆNH NHÂN VÀ TÁCH CHIẾT DN TỔNG SỐ

3.1.1. Một số đặc điểm của mẫu phân tích

3.1.2. Tách chiết DN tổng số của các mẫu

3.2. SÀNG LỌC CÁC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF Ở NGƯỜI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR-RFLP

3.2.1. Sàng lọc đột biến 8344G

3.2.2. Nhân bản đoạn gen từ 8155 - 8366 bằng PCR

3.2.3. Phân tích sự có mặt của đột biến A8344G bằng PCR-RFLP

3.2.4. Sàng lọc đột biến T8356C

3.2.5. Nhân bản đoạn gen từ 8166 - 8358 bằng PCR

3.2.6. Phân tích sự có mặt của đột biến T8356C bằng PCR-RFLP

3.2.7. Sàng lọc đột biến G8363

3.2.8. Nhân bản đoạn gen từ 8342 - 8582

3.2.9. Phân tích sự có mặt của đột biến G8363A bằng PCR-RFLP

3.3. XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG ĐỘT BIẾN 8344G BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR

3.3.1. Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA

3.3.2. Đánh giá tính đặc hiệu của mẫu dò đột biến A8344G

3.3.3. Xây dựng đường chuẩn và đánh giá độ tin cậy của phương pháp real-time PCR để định lượng đột biến 8344G

3.3.4. Định lượng số bản sao của plasmid mang đoạn gen đột biến và không đột biến A8344G

3.3.5. Kết quả xây dựng đường chuẩn đột biến A8344G. Th nghiệm khả năng phát hiện và định lượng đột biến 8344G

3.4. SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN THUỘC HỘI CHỨNG MERRF BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP

3.4.1. Phân tích trình tự vùng gen mang đột biến MERRF 8155-9292 trên hệ gen ty thể

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về đột biến MERRF ở người Việt Nam

Hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều (MERRF) là một trong những bệnh lý di truyền phức tạp liên quan đến đột biến gen ty thể. Đột biến này ảnh hưởng đến chức năng của ty thể, dẫn đến nhiều triệu chứng nghiêm trọng. Tại Việt Nam, nghiên cứu về MERRF còn hạn chế, nhưng ngày càng có nhiều nỗ lực nhằm phát hiện và định lượng các đột biến này. Việc hiểu rõ về MERRF không chỉ giúp nâng cao nhận thức mà còn hỗ trợ trong việc chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân.

1.1. Định nghĩa và triệu chứng của bệnh MERRF

MERRF là hội chứng gây ra bởi đột biến gen MT-TK, dẫn đến các triệu chứng như động kinh, mất điều hòa vận động, và suy nhược cơ thể. Triệu chứng thường xuất hiện ở trẻ em sau giai đoạn phát triển bình thường, gây ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống.

1.2. Tình trạng nghiên cứu MERRF ở Việt Nam

Mặc dù có nhiều nghiên cứu trên thế giới về MERRF, nhưng tại Việt Nam, việc nghiên cứu về đột biến MERRF vẫn còn mới mẻ. Các nghiên cứu hiện tại chủ yếu tập trung vào việc phát hiện và định lượng đột biến gen, nhằm cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu đột biến MERRF

Nghiên cứu về đột biến MERRF gặp nhiều thách thức, bao gồm sự phức tạp trong biểu hiện lâm sàng và khó khăn trong việc chẩn đoán. Các triệu chứng của MERRF có thể tương tự như nhiều bệnh lý khác, dẫn đến việc chẩn đoán sai. Hơn nữa, việc phát hiện đột biến gen ty thể cũng đòi hỏi các phương pháp kỹ thuật cao và chi phí cao.

2.1. Khó khăn trong chẩn đoán lâm sàng

Chẩn đoán MERRF thường gặp khó khăn do triệu chứng không đặc hiệu. Nhiều bệnh nhân có thể không được phát hiện kịp thời, dẫn đến tình trạng bệnh trở nên nghiêm trọng hơn.

2.2. Thiếu phương pháp phát hiện hiệu quả

Việc phát hiện đột biến gen ty thể cần các phương pháp hiện đại như PCR và giải trình tự gen. Tuy nhiên, không phải cơ sở y tế nào cũng có đủ trang thiết bị và chuyên môn để thực hiện.

III. Phương pháp nghiên cứu đột biến MERRF hiệu quả

Để nghiên cứu đột biến MERRF, các phương pháp hiện đại như PCR, RFLP và real-time PCR được áp dụng. Những phương pháp này giúp phát hiện và định lượng các đột biến gen một cách chính xác. Việc áp dụng các công nghệ mới trong nghiên cứu sẽ giúp nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân.

3.1. Phương pháp PCR trong phát hiện đột biến

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) cho phép nhân bản đoạn gen mang đột biến, từ đó giúp phát hiện sự hiện diện của các đột biến gen MERRF một cách nhanh chóng và chính xác.

3.2. Kỹ thuật real time PCR trong định lượng đột biến

Real-time PCR là một kỹ thuật tiên tiến cho phép định lượng chính xác số lượng bản sao của gen mang đột biến. Kỹ thuật này giúp theo dõi sự phát triển của bệnh và hiệu quả điều trị.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu MERRF

Nghiên cứu về đột biến MERRF không chỉ giúp phát hiện bệnh mà còn hỗ trợ trong việc điều trị và tư vấn di truyền cho bệnh nhân và gia đình. Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời có thể cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

4.1. Kết quả nghiên cứu về đột biến MERRF

Các nghiên cứu đã phát hiện nhiều đột biến gen khác nhau liên quan đến hội chứng MERRF ở người Việt Nam. Những phát hiện này cung cấp thông tin quý giá cho việc chẩn đoán và điều trị.

4.2. Ứng dụng trong điều trị và tư vấn di truyền

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng trong việc tư vấn di truyền cho các gia đình có tiền sử bệnh MERRF, giúp họ hiểu rõ hơn về nguy cơ và các biện pháp phòng ngừa.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu MERRF

Nghiên cứu về đột biến MERRF ở người Việt Nam đang trong giai đoạn phát triển. Cần có thêm nhiều nghiên cứu sâu hơn để hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh lý và tìm ra các phương pháp điều trị hiệu quả. Tương lai của nghiên cứu MERRF hứa hẹn sẽ mang lại nhiều hy vọng cho bệnh nhân và gia đình họ.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Việc tiếp tục nghiên cứu về MERRF sẽ giúp phát hiện thêm nhiều đột biến mới và hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh lý, từ đó cải thiện khả năng chẩn đoán và điều trị.

5.2. Hướng đi mới trong điều trị MERRF

Các nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc phát triển các phương pháp điều trị mới, bao gồm liệu pháp gen và các phương pháp điều trị hỗ trợ khác nhằm nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

16/08/2025
Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh giật cơ với sợi cơ không đều merrf ở người việt nam 14

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu (procaspase-9), từ đó hoạt hóa dòng caspase sát thủ để điều dẫn sự chết tế bào. Bcl-2 điều hòa con đƣờng apoptosis nội bào bằng cách kiểm soát sự phóng thích Cyt c và các protein khác từ khoảng gian màng của ty thể vào tế bào chất. Bcl-2 có hai loại: pro-apoptosis Bcl-2 gia tăng sự giải phóng Cyt c và kích thích sự chết của tế bào; anti-apoptosis Bcl-2 có tác dụng ngƣợc lại, ức chế sự giải phóng Cyt c từ đó kìm h m sự chết của tế bào [32, 60]. Nồng độ Ca2+ trong ty thể cũng quyết định đến sự sống còn của tế bào.

Sự kích hoạt nhóm protein pro-apoptosis Bcl-2 đòi hỏi nồng độ ion Ca2+ trong ty thể phải đủ lớn, từ đó dẫn đến các rối loạn về chức năng của ty thể, kích thích giải phóng Cyt c 9 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com và hoạt hóa caspase. Mặt khác, khi một lƣợng lớn Ca2+ tích tụ trong ty thể, sẽ tƣơng tác với cyclophilin D để kích thích mở lỗ bán thấm trên màng trong của ty thể làm chất nền bị trƣơng lên làm vỡ màng ty thể và phát tán Cyt c. Hơn nữa, Ca2+ còn kích thích sự tổng hợp các gốc tự do có hoạt tính cao (ROS). Sự dƣ thừa ROS trong ty thể hoạt động nhƣ chất trung gian của các con đƣờng truyền tín hiệu chết theo chƣơng trình [34].

Những rối loạn chức năng của ty thể gây ra bởi sự sai hỏng DNA và các yếu tố làm tổn thƣơng gen dẫn đến một kết quả chắc chắn là sự chết tế bào theo chƣơng trình. Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể 1. Hệ gen ty thể Ty thể là bào quan có hệ gen riêng, nhân bản độc lập với gen nhân. DN ty thể ngƣời tồn tại ở dạng mạch vòng kép, có kích thƣớc 16.569 bp, gồm 37 gen m hóa cho 2 phân t RN ribosome, 22 phân t RN vận chuyển và 13 phân t protein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp.

Hệ gen ty thể [11] 10 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ND1-ND6 và ND4L m hóa 7 tiểu đơn vị của phức hợp (N DH-ubiquinone oxidoreductase), Cyt b là tiểu đơn vị phức hợp III chỉ đƣợc m hóa bởi mtDN (ubiquinol cytochrome c oxidase reductase), COX 1-3 m hóa cho 3 tiểu đơn vị của phức hợp V ( TP synthase). Các phân t protein còn lại của chuỗi hô hấp đƣợc m hóa bởi gen nhân, đƣợc dịch m trong tế bào chất, sau đó đƣợc vận chuyển vào bên trong ty thể [59]. Đặc biệt, so với hệ gen nhân, hệ gen ty thể chứa rất ít trình tự không m hóa Phe xen kẽ với vùng m hóa. D-loop nằm giữa gen tRN (gen MT-TK) và tRNAPro (gen MT-TP) là vùng không m hóa lớn nhất và có vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình sao chép và phiên m của hệ gen ty thể, chứa promoter cho sự phiên m chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L), chứa điểm khởi đầu của quá trình tái bản.

Hai gen mã hóa cho rRNA (12S và 16S rRNA) và 22 gen mã hóa cho 22 tRNA đƣợc nằm giữa các gen m hóa cho protein. Các gen này cung cấp các RN cần thiết cho sự tổng hợp protein bên trong ty thể [11]. Hệ gen ty thể sao chép độc lập với hệ gen nhân bằng một hệ thống riêng trong ty thể nhƣng các enzyme cho quá trình tái bản lại do hệ gen nhân m hóa. Quá trình phiên m và dịch mã của DN ty thể lại đƣợc điều khiển bởi gen nhân.

Hệ gen ty thể đƣợc phiên m từ một điểm khởi đầu nằm trên vùng D-loop, bản phiên m sau đó đƣợc endonuclease phân cắt để hình thành nên phân t rRNA 12S và 16S, tRNA và mRNA tiền thân. Phân t mRN hoàn thiện của ty thể không đƣợc gắn mũ nhƣng có đuôi poly. Mô hình phiên m trên có nhiều điểm giống với một operon của vi khuẩn [11, 59]. Các tế bào ngƣời có thể chứa tới hàng ngàn bản sao mtDN trong một tế bào và có số lƣợng dao động tùy thuộc vào nhu cầu s dụng năng lƣợng của từng loại tế bào.

Số bản sao mtDN giảm nhiều lần trong quá trình tạo tinh trùng nhƣng dƣờng nhƣ tăng đột ngột trong quá trình tạo trứng. Số lƣợng bản sao mtDN thay đổi rất lớn ở các mô khác nhau và đƣợc kiểm soát nghiêm ngặt trong thời kỳ đầu của quá trình phát triển của động vật. Số bản sao mtDN tăng khi quá trình trao đổi chất tăng [46]. 11 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.

Đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể Sự di truyền của các gen trên mtDN là sự di truyền qua tế bào chất. Giống nhƣ các DN ngoài nhân, DN ty thể đƣợc di truyền theo dòng mẹ, ngƣời mẹ truyền gen ty thể cho các con, nhƣng chỉ con gái của bà mới có thể truyền các kiểu gen này cho thế hệ tiếp theo. Cơ chế di truyền này đƣợc lý giải bởi tế bào trứng của ngƣời phụ nữ trung bình chứa khoảng 100.000 phân t DN ty thể, trong đó một tinh trùng khỏe mạnh chỉ chứa trung bình 100 - 1500 phân t , mặt khác sự suy thoái của mtDN trong đƣờng sinh dục nam và sự phá hủy mtDN của tinh trùng khi vào tế bào trứng là rất rõ ràng nên mtDN trong tế bào hợp t thƣờng chỉ đƣợc thừa hƣởng từ trứng [29, 61]. Đối với các gen nằm trong nhân của tế bào sinh vật nhân chuẩn, chúng tuân theo các quy luật hoạt động của nhiễm sắc thể trong các cơ chế phân bào.

Nhƣng hệ gen ty thể lại không tuân theo những quy luật đó mà các tính trạng do chúng xác định có những kiểu di truyền riêng đặc trƣng cho chúng. Đột biến mtDN đƣợc truyền từ mẹ sang con nhƣng tỷ lệ số bản sao mang đột biến ở mẹ và con khác nhau, các cá thể mang đột biến trong một phả hệ gia đình cũng có sự thay đổi về tần suất đột biến vì vậy mức độ biểu hiện bệnh ở mẹ và các con có thể rất khác nhau [29, 46]. Một đặc điểm khác biệt nổi bật về tính di truyền gen ty thể là tần số xuất hiện của gen đột biến giữa mẹ và con cái. Ví dụ, một ngƣời mẹ khỏe mạnh mang đột biến mtDN có thể sinh ra hai ngƣời con với tần suất mang gen đột biến hoàn toàn khác nhau, một ngƣời con khỏe mạnh và một ngƣời con có biểu hiện bệnh trầm trọng ngay từ khi còn nhỏ.

Kiểu di truyền này đƣợc gọi là “nút cổ chai”, theo đó tần suất mang mtDN đột biến của các thế hệ con cháu khác nhau đáng kể và cũng khác với mẹ [14, 46, 50]. Tính chất không đồng nhất và tốc độ đột biến của ty thể Mỗi tế bào có thể chứa hàng ngàn bản sao DN. Vì vậy, khi xuất hiện đột biến thì trong cùng một mô có thể có cả mtDN bình thƣờng và mtDN đột biến, hiện 12 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com tƣợng này đƣợc gọi là tính không đồng nhất (Heteroplasmy). Nếu các bản sao của mtDN đều giống nhau thì đƣợc gọi là đồng nhất giữa các bản sao ty thể (Homoplasmy).

Số bản sao mtDN đột biến so với tổng lƣợng mtDN của tế bào sẽ xác định mức độ heteroplasmy, là một nhân tố quyết định mức độ nghiêm trọng của bệnh. Đa số các đột biến mtDN gây bệnh đều tồn tại ở dạng heteroplasmy. Những hiểu biết về mức độ dị plasmid của ngƣời mang đột biến là thông số quan trọng để có thể tiên lƣợng đƣợc tình trạng bệnh lý và sự di truyền của đột biến gen ty thể [14]. mtDNA có tốc độ đột biến cao gấp 10 - 20 lần so với DN trong nhân, do hệ gen ty thể ở dạng trần (không liên kết với các protein bảo vệ kiểu histone nhƣ hệ gen nhân), không chứa trình tự intron, hệ gen ty thể dễ tiếp xúc với các gốc tự do [54].

Ngoài ra, ty thể không có cơ chế s a chữa DN hiệu quả nhƣ với DNA trong nhân. Hiện nay, đ có nhiều đột biến gen ty thể gây bệnh đƣợc phát hiện và nghiên cứu. Các đột biến gen ty thể này thƣờng gây ra các triệu chứng khác nhau, tuy nhiên chủ yếu tập trung vào cơ, thần kinh và các chuyển hóa của cơ thể. ĐỘT BI GE TY THỂ V B H IÊ QU 1.

ác loại đột biến gen ty thể Bộ gen ty thể có tỷ lệ đột biến rất cao, cao hơn từ 10 đến 20 lần so với đột biến DNA trong nhân. Hầu hết những thay đổi trên DN ty thể là đa hình và có vai trò quan trọng trong việc theo dõi sự di cƣ của con ngƣời. Những đột biến mtDN gây bệnh đầu tiên đ đƣợc xác định vào năm 1988. Kể từ đó, hơn 250 đột biến mtDNA gây bệnh đ đƣợc phát hiện và nghiên cứu, bao gồm hai loại đột biến chính là đột biến điểm và đột biến cấu trúc.

Các đột biến mtDN có tính không đồng nhất về biểu hiện lâm sàng và tuổi khởi phát bệnh, do đó việc xác định tỷ lệ của bệnh đột biến gen ty thể là rất khó khăn. Ƣớc tính ở phía Đông Bắc nƣớc nh có tỷ lệ 1/10.000 ngƣời đ có biểu hiện lâm sàng bệnh ty thể và 1/6000 ngƣời có nguy cơ mắc bệnh. Một nghiên cứu gần đây đ cho thấy tần số đột biến là 0,14% 13 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com đối với đột biến 3243G và 0,2% đối với đột biến 1555G liên quan đến MT- RNR1 aminoglycoside gây ra mất thính giác, điều này chứng tỏ rằng những hiểu biết về đột biến gen ty thể còn nhiều hạn chế [31, 56]. Đột biến điểm Đột biến điểm là đột biến thay thế, mất hoặc thêm một nucleotide xảy ra trong cấu trúc của gen tại một điểm trên phân t DN.

Hơn 250 đột biến điểm gây bệnh đ đƣợc xác định trên gen ty thể qua các bệnh nhân với hàng loạt các rối loạn khác nhau (http://mitomap.org/MITOMAP), thƣờng di truyền từ mẹ sang con và liên quan đến nhiều hệ thống cơ quan. Đột biến điểm trên mtDN có thể xảy ra trên gen m hóa tRN , rRN hay protein, tuy nhiên hơn một n a trong số các đột biến điểm đƣợc báo cáo liên quan đến gen tRNA của ty thể [31]. tRN ty thể có cấu trúc ngắn hơn và khác biệt với tRN trong tế bào chất (mã hóa bởi gen nhân) nên sự sai khác về 1 nucleotide dẫn đến thay đổi dạng hình L của tRN , ảnh hƣởng đến cấu trúc bậc ba của chúng. Một số đột biến trên tRN ty thể dẫn đến những khiếm khuyết trên phức hợp OXPHOS.

Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ