MỞ ĐẦU Ty thể là bào quan có mă ̣t trong h ầu hết các tế bào nhân chu ẩn với chức năng chính là sản xuất năng lƣợng dƣới dạng ATP cho các hoạt động của tế bào. Hệ gen ty thể có cấu trúc sợi đôi, DNA mạch vòng với kích thƣớc 16.569 bp, gồm 37 gen mã hóa cho 13 protein, 22 RNA vận chuyển (tRNA) và 2 RNA ribosome (rRNA). Gần nhƣ tất cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lƣợng ổn định do ty thể cung cấp, do đó những sai hỏng trong DNA của ty thể có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống, ảnh hƣởng đến nhiều loại tế bào, mô và tổ chức khác nhau chủ yếu tập trung ở cơ, thần kinh và chức năng chuyển hóa của cơ thể. Giống nhƣ tất cả DNA ngoài nhân, mtDNA đƣợc di truyền theo mẹ, tƣ́c là mẹ truyền hệ gen ty thể cho các ngƣời con và chỉ có những ngƣời con gái mới truyền hệ gen đó cho thế hệ tiếp theo.
Đột biến mtDNA đƣợc truyền từ mẹ sang con nhƣng tỷ lệ số bản sao mang đột biến ở mẹ và con khác nhau, các cá thể mang đột biến trong một phả hệ gia đình cũng có sự thay đổi về tần suất đột biến vì vậy mức độ biểu hiện bệnh ở mẹ và các ngƣời con khác nhau có th ể rất khác nhau. Bệnh do đột biến gen ty thể có tác động lâm sàng phức tạp. Do đó rất khó để phát hiện thông qua việc chẩn đoán lâm sàng. Hiện nay phân tích DNA là phƣơng pháp hiện đại nhất cho phép hiện nhanh chóng và chính xác các đột biến điểm gây bệnh.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về đột biến gen ty thể, cho đến nay trên 250 đột biến điểm đã đƣợc phát hiện liên quan đến các bênh hay hội chức khác nhau. Ở Việt Nam, nghiên cứu về đột biến gen ty thể chỉ mới đƣợc quan tâm khoảng 10 năm gần đây, qua đó khoảng 20 loại đột biến khác nhau đã đƣợc nghiên cứu và điều tra trên các bệnh nhân nhi nghi bị bệnh ty thể. PCR-RFLP và real-time là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến để sàng lọc các đột biến gen ty thể. PCR- RFLP có ƣu điểm giá thành rẻ, dễ sử dụng, tuy nhiên nó có nhƣợc điểm độ nhạy không cao đồng thời không định lƣợng chính xác đƣợc tỷ lệ đột biến.
Trong khi đó, real-time PCR là kỹ thuật phát hiện các đột biến gen ty thể có độ nhạy cao đồng thời có thể định lƣợng chính xác tỷ lệ đột biến gen gây bệnh thông qua việc sử dụng 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com các mẫu dò khác nhau. Ngoài ra, phƣơng pháp không cần thao tác sau PCR dẫn tới việc rút ngắn thời gian phân tích mẫu. Do đó trong nghiên cứu này, trên cơ sở kết quả nghiên của GS. Phan Tuấn Nghĩa và tập thể đã có trƣớc đó, chúng tôi t ập trung hoàn thiện cách thức phát hiện và định lƣợng cùng một lúc 6 đột biến điểm có tần suất xuất hiện cao trong các hội chứng bệnh ty thể điển hình bao gồm: A3243G, G3380A (thuô ̣c hô ̣i chƣ́ng MELAS), G11778A (thuô ̣c hô ̣i chƣ́ng LHON ), A8344G (thuô ̣c hô ̣i chƣ́ng MERRF), T8993G/C (thuô ̣c hô ̣i chƣ́ng Leigh) bằng real-time PCR nhằm góp phần vào việc chẩn đoán và hỗ trợ điều trị bệnh ty thể.
Nghiên cứu đƣợc thực hiện với nội dung nhƣ sau 1. Tạo các mẫu đối chứng cho real-time PCR phát hiện và định lƣợng 6 đột biến gen ty thể phổ biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A. Tạo hỗn hợp phản ứng master mix cho real-time PCR 3. Xác định thành phần thích hợp cho master mix 4.
Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, xác định thời gian bảo quản master mix 5. Điều tra sự có mặt của 6 đột biến A3243G, G3380A, A8344G, G11778A, T8993G, T8993C ở các bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể sử dụng master mix đƣợc tạo ra. Phân tích các thành viên trong gia đình bệnh nhân dƣơng tính với một hoặc nhiều đột biến trong 6 đột biến quan tâm. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về ty thể 1. Cấu trúc và chức năng của ty thể Ty thể là bào quan có ở hầu hết các tế bào nhân thật, hình dạng đặc trƣng của ty thể là thon dài với đƣờng kính 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm. Phụ thuộc vào trạng thái tế bào hay loại tế bào mà ty thể có hình dạng và kích thƣớc khác nhau (Hình 1.
Ty thể có khả năng thay đổi kích thƣớc, hình dạng, có thể liên kết với nhau tạo ra những cấu trúc dài hơn hoặc phân ra thành những cấu trúc ngắn hơn. Ngoài ra, ty thể có khả năng di chuyển để phản ứng với những thay đổi sinh lý trong tế bào [15]. Hình dạng bình thƣờng (trái) và dạng biến đổi (phải) của ty thể [15]. Ty thể có cấu trúc gồm hai lớp màng lipoprotein, màng ngoài và màng trong, tƣơng tự nhƣ màng sinh chất.
Hai lớp màng này bao lấy chất nền ở phía trong, khoang giữa hai màng đƣợc gọi là xoang gian màng. Màng trong ty thể ăn sâu vào chất nền tạo thành các cấu trúc mào răng lƣợc (Hình 1. 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Cấu trúc ty thể [16].
Màng ngoài ty thể có độ dày 6 nm, trong đó protein chiếm khoảng 60% và lipid chiếm khoảng 40%. Màng có nhiều protein lỗ cho phép các chất, các ion di chuyển tự do từ ngoài nguyên sinh chất vào xoang gian màng và ngƣợc lại. Màng ngoài ty thể còn chứa nhiều enzyme quan trọng nhƣ các transferase, kinase, cytochrome-reductase, acyl CoA synthetase. Màng trong của ty thể cũng là màng lipoprotein, protein chiếm 80%, lipid chiếm 20%, và một lƣợng nhỏ cholesterol.
Màng trong ăn sâu vào chất nền tạo nên các cấu trúc mào răng lƣợc. Cấu trúc “mào” làm tăng diện tích bề mặt của màng trong so với màng ngoài và điều này liên quan đến chức năng của nó là tăng cƣờng vận chuyển điện tử và tổng hợp ATP. Màng trong chứa nhiều protein vận chuyển chủ động ATP, ADP, acid béo và các protein kênh vận chuyển các ion Na+, K+, Ca2+ và H+. Màng trong là nơi bám của 5 phức hợp thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận chuyển điện tử: phức hợp I (NADH ubiquinone reductase), phức hệ II (Succinate dehydrogenase), phức hệ III (Ubiquinol-cytochrome c reductase), phức hệ IV (Cytochrome c oxidase), phức hệ 5 (ATP synthase còn gọi là F1F0-ATPase) và adenine nucleotide translocase (ANT) (Hình 1.
4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Cấu trúc màng trong ty thể [13]. I, II, III, IV, V phức hệ trong chuỗi vận chuyển điện tử Xoang gian màng (khoang hẹp giữa màng ngoài và màng trong ty thể) là nơi trung chuyển các chất giữa hai màng. Xoang gian màng chứa nhiều ion H+ từ chất nền đi ra do hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử.
Chất nền (matrix) của ty thể chứa các enzyme của chu trình Krebs, các enzyme của quá trình oxy hóa acid béo, acid amin và vật chất di truyền riêng của ty thể. Nhƣ vậy, ở tế bào động vật, thực vật và ngƣời ngoài hệ gen nhân, còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể. Ty thể thực hiện các chức năng sinh hóa cần thiết cho nội cân bằng tế bào cũng nhƣ nhân tố quan trọng quyết định sự sống còn của tế bào. Ở sinh vật nhân chuẩn, ty thể sản xuất ra năng lƣợng dƣới dạng ATP thông qua quá trình oxi hóa các chất hữu cơ bao gồm carbohydrate, chất béo và protein đƣợc lấy từ thức ăn, trong đó chủ yếu là carbohydrate thông qua hai bƣớc chính: 1) oxy hóa NADH hoặc FADH2 đƣợc sinh ra trong quá trình đƣờng phân, chu trình Krebs hoặc β- oxy hóa các axit béo và 2) phosphoryl hóa oxy hóa tạo ra ATP.
Tất cả các quá trình này đƣợc kiểm soát bởi các hệ nhân tố phiên mã trong ty thể [9]. Chuỗi vận chuyển điện tử bao gồm 5 đơn vị phức hợp enzyme: I, II, III, IV và V nằm trên màng trong của ty thể, hai phân tử vận chuyển điện tử giữa các phức hệ là coenzyme ubiquinone (CoQ) và Cyt c. Các Coenzyme, NADH và FADH2 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com trong chu trình Krebs là nguồn cung cấp electron. Các electron đƣợc chuyển sang các thành phần của chuỗi vận chuyển ở phức hệ I (NADH ubiquinone reductase) hoặc phức hệ II (Succinate dehydrogenase), Phức hệ I và II xúc tác cho sự nhận điện tử của CoQ từ NADH và succinate.
Phức hệ III (Ubiquinol-cytochrome c reductase) xúc tác cho quá trình chuyển điện tử từ CoQ đến Cyt c. Cuối cùng phức hệ IV (Cytochrome c oxidase) xúc tác sự vận chuyển điện tử từ Cyt c tới chất nhận cuối cùng là oxy phân tử [3]. Ở mỗi bƣớc, điện tử đi qua các phức hệ, năng lƣợng đƣợc giải phóng ra kèm theo việc bơm các proton (H+) từ chất nền qua màng trong ra xoang gian màng và làm xuất hiện điện thế màng và gradient proton. Nhờ thế, hệ thống ATP synthase hoạt động và tổng hợp ATP từ ADP và phosphate vô cơ (Pi) (Hình 1.
Ty thể và quá trình trao đổi năng lƣợng trong tế bào [19]. Ty thể hoạt động liên tục để chuyển hóa oxy và tạo ra gốc tự do chứa oxy phản ứng (ROS). Tuy nhiên, dù là ngẫu nhiên hay vì một nguyên nhân nào đó, quá trình vận chuyển điện tử vẫn còn sai sót, dẫn tới việc sản xuất các gốc tự do chứa 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com oxy nhƣ anion superoxide (•O2-) là một trong các gốc tự do chính. Các anion superoxide tiếp tục tƣơng tác với nhiều hợp chất khác và tạo ra các gốc tự do thứ cấp.
Trƣớc đó, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng tƣơng tác của gốc tự do hydroxyl (•OH) với phân tử DNA gây tổn hại đến các bazơ nitơ purine, pyrimidine và khung xƣơng đƣờng của DNA [34]. Ngoài ra, việc tạo ra quá nhiều gốc tự do sẽ phá hủy các protein/các enzyme, màng, và DNA của ty thể, làm cho sự hình thành ATP và các chức năng thiết yếu khác trong ty thể bị gián đoạn. Bên cạnh anion superoxide và các gốc hydroxyl, chuỗi vận chuyển điện tử cũng tạo ra các phân tử hoạt động khác nhƣ nitơ oxit (NO) và các loại nitơ phản ứng (RNS). Hầu hết các protein của tế bào và glutathione đều bị ảnh hƣởng bởi sự nitrat hóa do RNS gây ra.