CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật 1. Định nghĩa và đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên thực vật 1. Định nghĩa Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn có nhân thực (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên.
Chúng có mặt tại nhiều môi trường sống khác nhau, đặc biệt là môi trường đất. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân giải chất hữu cơ đặc biệt là các hợp chất carbon (đường, hemicellulose, cellulose). Ngoài ra chúng còn tham gia vào quá trình hình thành các acid hữu cơ, cố định nitơ tự do từ không khí, tổng hợp kháng sinh,… Xạ khuẩn còn là nguồn sản xuất của một loạt các chất chuyển hóa thứ cấp, nhiều chất trong số đó có các ứng dụng hữu ích trong y học, thú y và nông nghiệp. Tới nay có khoảng khoảng 80% các chất kháng sinh được phát hiện có nguồn gốc từ xạ khuẩn, đặc biệt là các loài thuộc chi Streptomyces.
Phần lớn xạ khuẩn từng được cho là sống được trong các môi trường như đất, nước ngọt, nước mặn, tầng sinh quyển và trầm tích ao hồ. Trong đó, đất là nơi chứa mật độ và sự đa dạng của xạ khuẩn lớn nhất, là nguồn gốc chủ yếu và thông thường của các chủng xạ khuẩn (Takizawa, 1993). Trong những năm gần đây, việc tìm ra kháng sinh mới từ Streptomyces phân lập từ đất ngày càng trở nên hiếm và khó khăn, do vậy, việc phân lập các loài xạ khuẩn từ các nguồn đặc biệt khác như thực vật để tìm kiếm hoạt chất mới là rất cần thiết. Vào thế kỷ 19, một số xạ khuẩn đã được chứng minh là có quan hệ mật thiết với thực vật sống, gây ra những ảnh hưởng có lợi hoặc bất lợi cho cây chủ.
Thuật ngữ nội sinh (endophyte) được đưa ra bởi de Bary vào năm 1866. Theo định nghĩa của de Bary, “Vi sinh vật (VSV) nội sinh là những VSV sống bên trong các mô thực vật”. Brunchorst (1886) đã phân lập được các chủng thuộc chi Frankia từ các nốt sần ở rễ không phải cây họ đậu. Các chủng này được chứng minh có vai trò quan trọng trong việc cố định nitơ ở rễ, tương tự như Rhizobium 3 ở cây họ đậu.
Smith và cộng sự (1957) phân lập thành công chủng xạ khuẩn Micromonospora ức chế vi nấm gây bệnh Fusarium oxysporum trên cây cà chua không nhiễm bệnh và cũng đưa ra khái niệm xạ khuẩn nội sinh (XKNS). Năm 1997, Gao và cộng sự định nghĩa rằng “VSV nội sinh là những VSV sống bên trong các mô thực vật mà không gây ra những triệu chứng bệnh”. Tương tự, Schulz và Boyle (2006) định nghĩa rằng “VSV có thể được phát hiện tại một thời điểm nào đó bên trong các mô của một cây chủ khỏe mạnh”. Cuối cùng, định nghĩa được đông đảo các nhà VSV học thừa nhận rộng rãi là của Bacon và White (2000): “VSV nội sinh sinh trưởng trong mô tế bào thực vật và không gây ra hiệu ứng xấu tới cây chủ”.
Định nghĩa này hàm chứa một ý rất quan trọng: VSV nội sinh không những không gây ảnh hưởng mà còn tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, tiêu diệt côn trùng, kích thích hệ thống miễn dịch của cây chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất bậc 1 và bậc 2. Trong VSV nội sinh, XKNS đặc biệt được chú ý bởi khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất bậc hai cũng như enzym, an toàn với người và động vật. Sự đa dạng của xạ khuẩn sinh trong mô thực vật là rất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nhằm phục vụ đời sống con người. Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ XKNS được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như: các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV gây bệnh, tiêu diệt tế bào ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng.Trong nông nghiệp, nghiên cứu sàng lọc XKNS tiềm năng thể hiện hoạt tính kiểm soát sinh học đang là hướng nghiên cứu triển vọng của các nhà khoa học trên thế giới.
Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên thực vật XKNS phân bố khá đa dạng trên thực vật và phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như: địa lý, cây chủ, khí hậu và phương pháp phân lập. Các nhà khoa học Nhật Bản đã lần đầu tiên công bố chi xạ khuẩn mới Actinosynnema được phân lập từ cây lưỡi cỏ (grass blade) (Hasegawa và cs, 1978). Tiếp đó, tổng số 4 246 chủng XKNS được phân lập từ lá cây, trong đó: 97 chủng thuộc chi Streptomyces, 57 chủng thuộc chi Microbispora, 23 chủng thuộc chi Nocardia, 18 chủng thuộc chi Micromonospora, 4 chủng thuộc chi Actinomadura và một số chủng chưa được định danh (Okazaki và cs, 2003). Sau đó, đã có nhiều nghiên cứu công bố rằng XKNS sống ở nhiều loại thực vật khác nhau dưới nhiều hình thức cộng sinh, ký sinh hoặc hoại sinh, hầu hết chúng thuộc các chi Streptomyces và Microbispora (kizuaka và cs, 1998).
Từ các mô rễ đã khử trùng bề mặt của cây lúa mì khỏe mạnh, Coombs và cộng sự (2003) đã phân lập được 38 chủng thuộc chi Streptomyces, Microbispora, Micromonospora và Nocardia. Tương tự, Takahashi và cộng sự (2003) từ lá của 9 chi thực vật bậc cao đã phân lập thành công 32 chủng Streptomyces, 33 chủng Microbispora và 10 chủng xạ khuẩn quý hiếm khác. Rosenblueth và cộng sự (2006) đã liệt kê được 8 chi XKNS gồm Arthrobacter, Curtobacterium, Kocuria, Nocardia, Streptomyces. Gần đây hơn, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra rằng các xạ khuẩn khác nhau phân lập từ các mô thực vật khỏe mạnh có khả năng sinh nhiều chất có hoạt tính sinh học với tác động kích thích sinh trưởng thực vật (Janso và cs, 2010).
Các chi Streptomyces, Nocardiopsis, Pseudonocardia được phát hiện là XKNS trên cây huyết rồng (Dracaena cochinchinensis) (Salam và cs, 2017) (Bảng 1. Đa dạng loài XKNS ở cây trầm (Aquilaria crassna ) hơn hẳn cây huyết rồng (Nimnoi và cs, 2010). Các báo cáo này chứng minh rằng XKNS luôn có mặt ở trong mô tế bào thực vật với mức độ khác nhau. XKNS thực vật được phát hiện và phân bố rộng rãi ở các vùng khí hậu và hệ sinh thái khác nhau.
Trong hệ sinh thái khô cằn, xạ khuẩn nội sinh khá đa dạng. Goudjal và cộng sự (2014) phân lập được cáo 22 chủng Streptomyces từ 5 loài thực vật thích nghi tốt với điều kiện khí hậu khô cằn của sa mạc Algeria. Streptomyces mutabilis IA1 được phân lập từ đất Sahara có khả năng nội sinh trên lớp biểu bì tế bào cây lúa mì (Toumatia và cs, 2016). Bất chấp điều 5 kiện thiếu nước và chất dinh dưỡng, hệ thực vật của vùng khô cằn là nơi sinh sống của nhiều loại XKNS, đặc biệt là chi Streptomyces.
Trong hệ sinh thái rừng ngập mặn, các cây ngập mặn được cho là môi trường lý tưởng để phân lập các chủng xạ khuẩn hiếm và có hoạt tính sinh học cao. Duy nhất chi Micromonospora được phát hiện từ cây chiêu liêu (Terminalia mucronata) (Bảng 1. Đối với cây vẹt (Bruguiera sexangula), chủng xạ khuẩn mới Mangrovihabitans endophyticus thuộc họ Micromonosporaceae lần đầu tiên được phát hiện (Liu SW và cs, 2017). Ở mức độ da dạng cao hơn, 4 chi Streptomyces, Curtobacterium, Mycobacterium, Micrococcus được phân lập từ cây mắm (Avicennia marina).
Một số XKNS được phân lập trên các loại thực vật khác nhau Dạng Tài liệu Tên thực vật Chi xạ khuẩn nội sinh thực vật tham khảo Huyết rồng Streptomyces, Nocardiopsis, Salam và (Dracaena Pseudonocardia cs, 2017 Cây thân cochinchinensis) gỗ Streptomyces,Nonomuraea, Trầm Nimnoi và Actinomadura,Pseudonocardia , (Aquilaria crassna) cs, 2010 Nocardia Streptomycessp., Micromonospora Rau má wenchangensis, Actinoplanes Ernawati và (Centella asiatica) brasiliensis, Couchioplanes, cs, 2016 Cây dược Gordonia otitidis liệu Cẩm chướng Huang và (Psammosilene Allostreptomyces cs, 2017 tunicoides) Chiêu liêu Kaewkla và (Terminalia Micromonospora cs, 2017 mucronata) Tra bồ đề Jiang và cs, (Thespesia Marmoricola Cây ngập 2017 populnea) mặn Vẹt (Bruguiera Liu SW và Mangrovihabitans sexangula) cs, 2017 Mắm (Avicennia Streptomyces, Curtobacterium, Jiang và marina) Mycobacterium, Micrococcus cs, 2018 6 1. Tiềm năng ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh XKNS khá đa dạng ở thực vật, đại diện cho nguồn tài nguyên sinh học dồi dào về hợp chất tự nhiên có tiềm năng khai thác trong lĩnh vực y-dược phẩm và nông nghiệp. Nhiều hợp chất được sản xuất bởi XKNS có hoạt tính sinh học cao, thuộc các nhóm như alkaloid, polyketide, terpenoid, coumarin, flavonoid, quinone, peptide. Rất nhiều thông tin về đa dạng di truyền, cơ chế tương tác và các chất có hoạt tính sinh học khác nhau từ XKNS đã được nghiên cứu trong bốn thập kỷ qua.
Y-dược học XKNS liên quan đến thực vật nói chung, đến cây dược liệu nói riêng trong khoảng thời gian gần đây đã được chứng minh nguồn khai thác các hợp chất có giá trị y dược phẩm cao. Trong ngành công nghiệp dược phẩm, xạ khuẩn là nguồn nguyên liệu sản xuất nhiều loại kháng sinh và chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học như kháng ung thư, kháng khuẩn, chống oxy hoá và tăng cường miễn dịch.000 chất chuyển hóa được sản xuất bởi VSV, trong đó khoảng 11.000 chất (chiếm 50%) có nguồn gốc từ xạ khuẩn với 7.600 chất (76%) được phân lập từ các loài thuộc chi Streptomyces. Một số hợp chất được tách chiết từ xạ khuẩn được công bố, gồm: aminoglycoside, anthracyclin, glycopeptide, β-lactam, macrolides, nucleoside, peptide, polyene, polyeste, polyketide, actinomycin và tetracycline. Hai hợp chất mới cedarmycin A và B được tách chiết từ chủng Streptomyces sp.
TP-A0456 nội sinh trên cây tuyết tùng (Cryptomeria japonica) (Bảng 1. Cedarmycins A cho hoạt tính kháng nấm Candida glabrata gây bệnh trên người với nồng độ ức chế tối thiểu MIC là 0,4 μg/mL (Sasaki và cs, 2001). Castillo và cộng sự (2006) đã phân lập được 2 kháng sinh peptide mới là munumbicins E-4 và E-5 từ chủng Streptomyces sp. NRRL 30562 nội sinh trên cây lõi tiền (Kennedia nigriscans).
Cây lõi tiền được người Aborinal dùng để ngăn chặn nhiễm trùng ở những vết thương hở chảy máu. Những hợp chất này 7 có khả năng kháng nhiều loại nấm và vi khuẩn gây bệnh ở người. Ngoài ra, chủng trên cũng sản sinh ra munumbicins A, B, C và D. Tất cả đều có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với Bacillus anthracis đa kháng thuốc, Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus kháng lại methicillin (MRSA), Glycopeptides intermediate và Staphylococcus aureus và kháng nấm gây bệnh trên thực vật.
Munumbicin A có hoạt tính kháng Enterococcus faecalis kháng vancomycin (VRE). Munumbicin B có hoạt tính kháng Mycobacterium tuberculosis với giá trị IC50 là 10 và 46 ng/mL. Munumbicin C có hoạt tính chống ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với nồng độ IC50 là 6,5 ng/mL so với IC50 của Chloroquine là 7 ng/mL.