Chương 1 TONG QUAN 1. Vị trí phân loại: -__ Giới: Bacteria -__ Ngành: Proteobacteria -__ Lớp: Gamma Proteobacteria - Bộ: Enterobacteriales - Họ: Enterobacteriaceae - Chi: Escherichia - Loai: Escherichia coli 1. Lich sử phát hiện, hình thái va đặc điểm phân bố Vi khuẩn E. coli được phát hiện bởi một bác sĩ nhi khoa người Áo gốc Đức, Theodor Escherich (1857 - 1911) vào năm 1885.
Ong đã tiến hành kiểm tra phân su và phân của trẻ bú sữa mẹ với mục đích để hiểu rõ hơn về sự phát triển của hệ vi sinh vật ruột. Trong khi soi một tiêu bản phân dưới kính hiển vi, ông đã quan sát thấy những trực khuẩn ngắn, dài khoảng 1-5um và rộng khoảng 0,3-0,4um. Ong đặt tên cho vi khuân này là Bacterium coli commune. Sau đó ông nuôi cây vi khuẩn này trên đĩa thạch có chứa huyết thanh và máu, vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc màu trắng, làm vón cục sữa, kết quả của sự hình thành acid.
Ông đã chứng minh vi khuẩn này có khả năng lên men. Ông cũng tiến hành nhuộm Gram và nhận thay rằng những vi khuẩn này bat màu tất cả các thuốc nhuộm anilin rất nhanh nhưng bị mất màu sau khi xử lý với lugol. Sau đó, vào năm 1919 vi khuẩn được đổi tên thành Escherichia coli bởi Castellani và Chalmer [74].) thuộc chỉ Escherichia ho vì khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, là trực khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, di động nhờ lông ở quanh thân (peritrichous flagella), hóa dị dưỡng, ky khí tùy nghi, sinh acid từ glucose, có men catalase, không có men oxidase, là loại vi khuẩn ưa nhiệt trung bình. coli là vi khuẩn thường trú phổ biến, nó là một trong những vi khuẩn có mặt đầu tiên trong ruột người sau khi sinh.
coli tồn tại được khi thải ra môi trường và có thé lây lan sang vật chủ mới. coli là một thành phan quan trọng của sinh quyển, nó có mặt trong đất, trong nước, trong thực phẩm [74]. Mặc dù, hầu hết các chủng £. coli là vi khuẩn thường trú, nhiều chủng E.
coli có kha năng gây bệnh. Một số dòng E. coli thích nghỉ cao đã thu được những yếu tố độc lực đặc hiệu giúp chúng tăng khả năng thích nghỉ với những hốc sống mới và cho phép chúng gây ra nhiều bệnh gồm các nhiễm trùng tại ruột và ngoài ruột. Sự đa dạng rộng lớn của loài này là kết qua của sự thu nhận, hoặc mat yếu tô di truyền qua hiện tượng chuyên gen ngang trong suốt quá trình tiến hóa của vi khuẩn [59].
Hình tế bào vi khuẩn E. Dưới kính hiển vi điện tử quét B. Dưới kính hiên vi quang học 1. Tính chất nuôi cấy E.
coli phát triển dé dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp 37°C nhưng có thé phát triển được ở nhiệt độ 5-40°C, pH thích hợp là 7,0-7,2. Trong điều kiện thích hợp, Z. coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20-30 phút. Cấy vào môi trường lỏng (canh thang) sau 3- 4 giờ làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làm đục đều, sau 2 ngày trên mặt môi trường có váng mỏng.
Những ngày sau có thé thấy cặn dưới đáy ống. coli không mọc trên canh thang selenit. Trên môi trường thạch thường sau khoảng 8-10 giờ dùng kính lúp có thể quan sát được khuẩn lạc £. Những ngày sau khuẩn lạc chuyển thành xám xanh, ở giữa đục xám.
Nếu nuôi cấy trên môi trường thạch Mac Conkey với nhiệt độ 37°C sau 18 đến 24 giờ thì E. coli cho khuẩn lạc dạng S kích thước 1- 2mm và làm thay đổi màu môi trường thành đỏ hồng do lên men đường lactose [70]. Tính chất hóa sinh E. coli lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrate thành nitrite.
coli với các vi khuẩn đường ruột khác người ta thường dùng thử nghiệm IMViC gồm I: Indol, M: Methyl - red, V: Voges - Proskauer, C: Citrate. Kháng nguyên Cho đến nay các nhà khoa học đã xác định được 186 nhóm kháng nguyên thân O, 53 kháng nguyên lông H và 80 kháng nguyên vỏ K của vi khuẩn E. Kháng nguyên O Kháng nguyên O (hay kháng nguyên thân) là nhóm kháng nguyên bê mặt, vách tế bao vi khuẩn, bền với nhiệt, chịu được nhiệt độ 100°C trong 2-4 giờ, được cấu tạo bởi chuỗi lipopolysacharide (LPS). Kháng nguyên O có khả năng kích thích các cơ quan đáp ứng miễn dịch hình thành các kháng thể đặc hiệu ngưng kết được với kháng nguyên O tương ứng đó.
Nghiên cứu một số đặc điểm huyết thanh học, nhiều tác giả nhận thay có hiện tượng ngưng kết chéo giữa những nhóm kháng nguyên O với nhau. Có 186 loại kháng nguyên O được đánh số từ O1 đến O188 ngoại trừ O31, 047, 067, O72, 094 và O122 không được sử dụng, có 4 nhóm được chia thành các nhóm phụ là O18ab/ac, O28ab/ac, O112ab/ac, and O125ab/ac [36], [70]. Kháng nguyên H Kháng nguyên H là kháng nguyên lông của vi khuẩn. Bằng phương pháp huyết thanh học đã xác định được 53 nhóm kháng nguyên lông H của E.
coli, được đánh số từ H1 đến H56 các số H13, H22 và H50 không sử dụng [94]. Phương pháp phân tử dé phân loại kháng nguyên H dựa trên trình tự gen fliC mã hóa FliC, một protein cầu trúc đoạn lông to (filament) của lông (flagella). Đầu tận N- và C- của FliC có tính bảo tồn rất cao do đó những loại lông H khác nhau là do sự khác nhau của các axit amin trong vùng giữa của FliC, đó là phần kháng nguyên bề mặt của lông. Vì thé, các phương pháp PCR được phát triển dé phân biệt các loại lông H nhắm đến mục tiêu là vùng biến đổi của gen fliC, tuy nhiên vùng này của một số lông H như HI, H12, H25, H28 rất giống nhau làm cho chúng khó được phân biệt.
Tuy nhiên một phương pháp PCR hai bước được phát triển dé phân biệt H1 với H12 [12]. Nhiều phương pháp hiện đại khác cũng được phát triển để phân loại các kháng nguyên H như phép đo khối phổ giải hấp ion hóa bằng ma trận (Matrix-assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight - MALDITOF). Kháng nguyên K Một số chủng E. coli có kháng nguyên K, còn gọi là kháng nguyên vi, kháng nguyên nang hay kháng nguyên vỏ có bản chất hóa học là polysaccharide, tan được trong dung dịch phenol 45%.
Một số kháng nguyên K của E. coli có tính kháng nguyên rất yếu, không kích thích được cơ thể vật chủ đáp ứng miễn dịch. Kháng nguyên K của nhiều chủng Z. coli ngưng kết chéo với nhau.
Một số kháng nguyên K của chủng E. coli này có thể ngưng kết chéo với kháng nguyên O của chủng E. Phân loại bằng định type huyết thanh học Vào thời kỳ trước khi sinh học phân tử ra đời, sự phân loại £. coli dựa trên định nhóm huyết thanh học.
Việc định nhóm huyết thanh học dựa trên các kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên K. Kiểu huyết thanh của E. coli là một phức hợp các kháng nguyên thân O, lông H và ít sử dụng hơn là kháng nguyên nang K. Sự tổ hợp các loại kháng nguyên này trong tự nhiên có thể xảy ra theo nhiều cách khác nhau vì thế cho đến nay đã có từ 50 000 đến 100 000 hoặc hơn các kiểu kháng huyết thanh khác nhau của E.
Phân loại theo nguồn gốc phát sinh loài Vào những năm 1980, điện di enzyme đa locus (MLEE) đã trở thành kỹ thuật phổ biến cho nghiên cứu về sự đa dạng của vi khuẩn. Người ta thấy rằng các chủng E. coli có quan hệ di truyền xa cũng có thé có cùng kiểu huyết thanh và các chủng liên quan di truyền chặt chẽ có thể có kiểu huyết thanh khác nhau. Dựa trên các nghiên cứu MLEE về 38 locus enzyme, các nhà nghiên cứu đã tìm ra 4 nhóm phát sinh loài của các chủng E.
coli gồm: A, BI, B2 và D [43]. chưA @ © [B2 oD [Bl ora ‡ ‡ ‘yaa TapE4. Sơ đồ xác định nhóm phát sinh loài của vi khuẩn E. coli dựa vào kỹ thuật triplex - PCR của Clermont [29] Clermont và cộng sự đã thiết lập một phương pháp nhanh và đơn giản để xác định phân nhóm phát sinh loài của vi khuẩn Z.
coli bằng một phản ứng triplex - PCR. Phương pháp này dựa trên sự khuếch đại 1 đoạn DNA có kích thước 279 bp (gen ChuA), 211 bp (gen yjaA) và một đoạn 152 bp (gen TSPE4.C2), một vùng không mã hóa của bộ gen, sự có mặt hoặc thiếu các tổ hợp 3 sản phẩm khuếch đại này được sử dụng để xếp E. coli vào các nhóm phát sinh loài A, BI, B2 hoặc D (Hình 1. Tuy nhiên, sau đó việc xếp nhóm E.
coli dựa trên cơ sở giải trình tự và các đữ liệu của bộ gen E. coli hoàn chỉnh, các nhóm phát sinh loài E. coli bổ sung đã được công bố. Do đó, số lượng các nhóm phát sinh loài đã tăng lên tám nhóm (A, BI, B2, C, D, E, F và nhóm I) (Hình 1.
Việc xác định nhóm phát sinh loài này dựa trên 2 phản ứng PCR, 1 phản ứng quadruplex PCR có thêm gen arpA. Gen arpA bd sung thêm với 2 mục dich: thứ nhất, nó hoạt động như một gen chứng nội cho chất lượng của DNA của tất cả các nhóm E. coli và nhánh I. Thứ hai, gen arpA cho phép phân biệt các chủng thuộc nhóm F với nhóm D (chuA +, yja4-, TspE4.C2-), vì arpA có mặt trong tat cả các nhóm E.
coli ngoại trừ nhóm B2 và F. Gen arpA cũng không xuất hiện ở các chủng nhánh II, II, IV, V va Escherichia albertii và Escherichia fergusonii. Sau đó, các tác giả đã sử dụng hai cặp mỗi PCR đặc hiệu alen dé xác định các chủng thuộc nhóm C và E. Phương pháp này xác định đúng nhóm phát sinh loài #.
coli trên 95% các chủng phân tích [28]. N x x X X “ 9 © @ © Se@® @ ỳ Y Ỳ Ỳ vv Ỳ Lu] | em | Dor] [ma |[ t vor) [at a | | m ]|[m] [r |[u ] [œs|[u ñ Hình 1. Sơ đồ nhóm phát sinh loài của E. coli bằng kỹ thuật quadruplex PCR của Clermont [28] U: nhóm chưa xác định được 1.
coli hội sinh, E. coli gây bệnh và các yếu tố độc lực 1. coli hội sinh E. coli là một trong những vi khuẩn chiếm đóng đầu tiên ở ruột, vi khuẩn này giúp thiết lập một môi trường ky khí ở ruột tạo điều kiện cho những vi khuẩn ky khí khác tiếp tục chiếm đóng ở ruột.
Sau sự xâm lấn của E. coli, thường thì vật chủ và E. coli cùng ton tại trong mối quan hệ cùng có lợi. coli nhận được thức ăn va nơi trú an từ vật chủ, vật chủ nhận được vitamin K do #.
coli sản xuất và sự kháng khuẩn. Sự kháng khuẩn của vật chủ là hiện tượng vật chủ được E.