Luận án tiến sĩ: Phân tích cấu trúc hóa học của hợp chất từ loài dứa dại Pandanus tonkinensis

Luận án tiến sĩ hóa học nghiên cứu nghiên cứu phân tích thành phần cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài dứa dạipandanus, phân tích chuyên sâu, xây dựng mô hình lý thuyết, đề

• Tác giả: Đinh Thị Huyền Trang
• Người hướng dẫn: PGS. Dương Hồng Anh
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa Phân Tích
• Đề tài: Nghiên Cứu Cấu Trúc Hóa Học Của Hợp Chất Từ Dứa Dại Pandanus Tonkinensis
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG
• 1.1. Giải thích sơ lược về chi Pandanus
• 1.2. Đặc điểm hình thái chung của chi Pandanus
• 1.3. Chi Pandanus ở Việt Nam và sơ bộ về phân bố các loài
• 1.4. Tóm tắt các thông tin cơ bản các loài thuộc chi Pandanus ở Việt Nam hiện nay
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Chiết xuất dược liệu
• 2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
• 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc
• 2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
• 2.2.5. Phương pháp lựa chọn, chiết xuất - tinh chế chất dầu, xây dựng và thẩm định quy trình phân tích định lượng chất dầu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ quả và rễ loài Pandanus tonkinensis
• 3.2. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được
• 3.2.1. Hoạt tính kháng viêm của các chất đã phân lập thông qua ức chế quá trình sản sinh NO trên tế bào RAW 264.7 được kích thích bởi LPS
• 3.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của các chất đã phân lập thông qua ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào
• 3.3. Lựa chọn chất dầu
• 3.4. Chiết xuất, tinh chế chất dầu từ dược liệu
• 3.5. Tóm tắt qui trình chiết xuất và tinh chế hai chất dầu
• 3.6. Xác nhận lại cấu trúc và độ tinh khiết của chất dầu
• 3.7. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng hợp chất pinorecinol 4’-O-β-D-glucopyranoside và chất vladinol F trong loài dứa dứi Pandanus tonkinensis
• 3.7.1. Khảo sát quy trình xử lý mẫu trước khi phân tích định lượng chất dầu
• 3.7.2. Quy trình định lượng hợp chất pinorecinol 4’-O-β-D-glucopyranoside và chất vladinol F trong dược liệu dứa dứi Pandanus tonkinensis
• 3.7.3. Thẩm định quy trình định lượng hợp chất pinorecinol 4’-O-β-D-glucopyranoside và chất vladinol F trong dứa dứi Pandanus tonkinensis
• 3.7.4. Giải hạn phát hiện và giải hạn định lượng của phương pháp
• 3.7.5. Định lượng pinorecinol 4’-O-β-D-glucopyranoside (PT20) và vladinol F (PT6) trong dứa dứi Pandanus tonkinensis thu thập ở 1 số địa phương
• NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về loài Pandanus tonkinensis

Loài Pandanus tonkinensis Mart. Stone, còn được gọi là dứa dại, là một trong những loài thực vật quý hiếm tại Việt Nam. Loài này có mặt chủ yếu ở các vùng núi trung du và Tây Nguyên. Theo các tài liệu y học cổ truyền, hợp chất tự nhiên từ loài này được sử dụng để điều trị nhiều bệnh lý như viêm gan, thanh nhiệt, và các bệnh liên quan đến thận. Nghiên cứu về cấu trúc hóa học của loài này chưa được thực hiện nhiều, do đó, việc tìm hiểu và phân tích các hợp chất phenolic, hợp chất flavonoid, và hợp chất terpenoid từ loài này là rất cần thiết. Điều này không chỉ giúp làm rõ giá trị dược lý của loài thực vật này mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên phục vụ cho y học.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua các phương pháp hóa lý hiện đại nhằm tách chiết và phân lập các hợp chất sinh học từ dứa dại. Các phương pháp như sắc ký lỏng cao áp (HPLC), sắc ký lớp mỏng (TLC), và phân tích NMR được áp dụng để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tự nhiên. Việc sử dụng các phương pháp này giúp đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả nghiên cứu. Đặc biệt, việc phân tích tinh chất thực vật từ loài Pandanus tonkinensis không chỉ giúp xác định các hợp chất phenolic mà còn đánh giá được tính chất sinh học của chúng, từ đó có thể ứng dụng trong y học và công nghiệp thực phẩm.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy Pandanus tonkinensis chứa nhiều hợp chất flavonoid và hợp chất terpenoid có hoạt tính sinh học cao. Các hợp chất phenolic được phân lập từ loài này đã cho thấy khả năng kháng viêm và chống oxy hóa mạnh mẽ. Điều này chứng tỏ rằng hợp chất tự nhiên từ dứa dại có thể được sử dụng như một nguồn dược liệu quý giá trong việc phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh. Hơn nữa, việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sinh học này sẽ mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm mới trong lĩnh vực dược phẩm và thực phẩm chức năng.

IV. Ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu về cấu trúc hóa học của hợp chất từ dứa dại Pandanus tonkinensis không chỉ có giá trị về mặt lý thuyết mà còn có ứng dụng thực tiễn cao. Các hợp chất phenolic, hợp chất flavonoid, và hợp chất terpenoid có thể được ứng dụng trong việc phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe, thực phẩm chức năng, và dược phẩm. Việc khai thác và sử dụng các hợp chất tự nhiên này sẽ góp phần vào việc bảo tồn và phát triển bền vững nguồn tài nguyên thực vật tại Việt Nam. Đồng thời, nghiên cứu này cũng mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu tiếp theo về các loài thực vật khác trong chi Pandanus.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Đề tài luận án tiến sĩ hóa học "Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài Dứa dại (Pandanus tonkinensis Mart. ex B. Stone) bằng các phương pháp hóa lý hiện đại" do nghiên cứu sinh Đinh Thị Huyền Trang thực hiện tại Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, thuộc chuyên ngành Hóa phân tích (mã số: 9 44 01 18), dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Dương Hồng Anh và PGS. Ngô Quốc Anh (năm bảo vệ: 2023).

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Họ Dứa dại (Pandanaceae) là một họ thực vật hạt kín có nguồn gốc nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó Pandanus là chi lớn nhất với khoảng 600 loài trên thế giới và 20 loài ghi nhận tại Việt Nam. Theo các tài liệu y học cổ truyền, có 9 loài thuộc chi Pandanus được dùng làm thuốc chữa các bệnh về thận (lợi tiểu, sỏi thận, sỏi mật, viêm đường tiết niệu), các bệnh về gan (viêm gan, xơ gan cổ trướng), thanh nhiệt, giải độc. Loài Dứa dại Pandanus tonkinensis Martelli ex B. Stone (tên gọi khác: Dứa Bắc bộ, dứa gai, dứa gỗ) phân bố từ vùng núi trung du Bắc Bộ đến miền Trung, Tây Nguyên, Bình Thuận, Long An, là vị thuốc dân gian được sử dụng điều trị các chứng bệnh về gan mật. Kết quả điều tra của Chương trình Khoa học công nghệ phát triển bền vững vùng Tây Bắc ghi nhận dịch chiết nước bài thuốc dân gian chứa Stixis suaveolens (Trọng quốc) và Pandanus tonkinensis thể hiện hiệu quả bảo vệ gan cao hơn silymarin. Tuy nhiên, trước thời điểm luận án thực hiện, chưa có công trình nào nghiên cứu một cách hệ thống về thành phần hóa học, cấu trúc các hợp chất và tác dụng sinh học của loài Pandanus tonkinensis, đồng thời chưa có chất đánh dấu hóa học (chemical markers) và quy trình phân tích định lượng phục vụ kiểm soát chất lượng dược liệu cũng như chế phẩm.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 2 mục tiêu cụ thể:

1. Phân tích được thành phần, cấu trúc hóa học và hoạt tính định hướng bảo vệ gan của các hợp chất phân lập từ loài Pandanus tonkinensis.
2. Xác định được chất đánh dấu từ loài Pandanus tonkinensis theo hướng bảo vệ gan và xây dựng được quy trình phân tích định lượng các chất đánh dấu trong dược liệu phục vụ kiểm soát chất lượng và phát triển chế phẩm.

Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu trên, luận án triển khai 3 nội dung chính:

1. Sử dụng các kỹ thuật tách chiết, phân lập và các phương pháp hóa lý hiện đại để phân tích thành phần, xác định cấu trúc hóa học và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ quả và rễ loài Pandanus tonkinensis.
2. Lựa chọn chất đánh dấu cho loài Pandanus tonkinensis theo định hướng bảo vệ gan; chiết xuất, tinh chế, kiểm tra độ tinh khiết và thiết lập bộ dữ liệu nhận dạng chất đánh dấu từ dược liệu.
3. Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích định lượng các chất đánh dấu trong dược liệu Pandanus tonkinensis bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC); ứng dụng quy trình để phân tích hàm lượng chất đánh dấu trong các mẫu dược liệu thu thập tại một số địa phương.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu quả và rễ của loài Dứa dại Pandanus tonkinensis Martelli ex B. Stone. Mẫu thực vật được thu thập vào tháng 02 năm 2021 tại 4 địa bàn: huyện Lương Sơn (Hòa Bình), huyện Mường Lát (Thanh Hóa), huyện Định Hóa (Thái Nguyên) và huyện Cẩm Thủy (Thanh Hóa). Tên khoa học của mẫu được TS. Đỗ Thị Xuyến, Bộ môn Thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN giám định và đối chiếu với mẫu tiêu bản (ký hiệu HNU 024663) lưu giữ tại Bảo tàng Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN.
• Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát thành phần hóa học trên 2 bộ phận quả (khối lượng 9,6 kg bột khô) và rễ (khối lượng 14,0 kg bột khô); thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro định hướng bảo vệ gan (kháng viêm qua ức chế NO trên tế bào RAW 264.7 và chống oxy hóa qua ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào); phát triển và thẩm định quy trình định lượng HPLC cho 2 chất đánh dấu trên các mẫu dược liệu thực tế.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước về chi Pandanus

Luận án đã hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong và ngoài nước về đặc điểm thực vật học, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Pandanus:

1. Vị trí phân loại và phân bố: Theo hệ thống phân loại APG IV (2018), chi Pandanus thuộc họ Pandanaceae, bộ Pandanales, lớp Liliopsida, ngành Magnoliophyta. Họ Pandanaceae gồm 5 chi (Benstonea, Freycinetia, Martellidendron, Pandanus, Sararanga) với khoảng 982 loài. Tại Việt Nam, họ Pandanaceae có 23 loài thuộc 2 chi (Freycinetia có 3 loài và Pandanus có 20 loài), trong đó có 8 loài đặc hữu như P. bipollicaris, P. monodon, P. tonkinensis.

2. Các nhóm hợp chất hóa học đã phân lập từ chi Pandanus:

   • Alkaloids: Tổng cộng 42 hợp chất alkaloid đã được phân lập từ lá, rễ và thân cây Pandanus amaryllifolius (như pandanamine, pandamarilactones, norpandamarilactonines, dubiusamines A–C, pandanusines A–B, pandalizins A–E).
   • Carotenoids: Nhóm tác giả Lois Englberger đã công bố 5 hợp chất carotenoid từ quả Pandanus tectorius gồm $\alpha$-caroten, $\beta$-caroten, $\beta$-cryptoxanthin, lutein, zeaxanthin.
   • Terpenoids: Phân lập từ Pandanus tectorius, Pandanus boninensis và Pandanus simplex gồm squalene, geraniol, linalool, linalyl acetate, limonen, citral, loliolide, vomifoliol.
   • Dẫn xuất carboxylic acid: Gồm 19 dẫn xuất được xác định từ P. tectorius, P. amaryllifolius, P. odoratissimus, P. kaida (benzyl benzoate, benzyl salicylate, vitamin C, 4-hydroxybenzoic acid, acid vanillic, acid gallic, acid cinnamic, acid ferulic, acid p-coumaric, methyl caffeate).
   • Lignans, neolignans và các hợp chất khác: Gồm 49 hợp chất đã được phân lập từ các loài P. tectorius, P. amaryllifolius, P. odoratissimus, P. kaida, P. simplex như pinoresinol, medioresinol, syringaresinol, lariciresinol, secoisolariciresinol, balanophonin, catechin, epicatechin, kaempferol, bergapten.

3. Hoạt tính sinh học của chi Pandanus:

   • Kháng khuẩn: Hợp chất 24,24-dimethyl-5$\beta$-tirucall-9,25-dien-3-one từ P. tectorius ức chế Mycobacterium tuberculosis H37Rv với MIC 64 $\mu$g/mL; cao chiết rễ non và lá P. tectorius ức chế Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus với giá trị $\text{IC}_{50}$ từ 26,0 đến 88,47 $\mu$g/mL.
   • Hạ đường huyết: Cao chiết lá P. amaryllifolius hạ đường huyết trên chuột gây tiểu đường bởi streptozotocin; phân đoạn ethyl acetate quả P. tectorius chứa 14/16 chất có hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase mạnh hơn acarbose.
   • Kháng viêm và chống oxy hóa: Dịch chiết methanol lá P. odoratissimus liều 100 $\mu$g/kg làm giảm phù bàn chân chuột 64,2% trong mô hình formalin và 68% trong mô hình carrageenan; các hợp chất lignan từ P. odoratissimus và P. kaida thể hiện khả năng quét gốc tự do và chống oxy hóa.
   • Bảo vệ gan: Dịch chiết rễ P. odoratissimus liều 200–400 mg/kg làm giảm có ý nghĩa ($p < 0{,}05$) SGOT, SGPT, ALP, bilirubin trên chuột tổn thương gan do paracetamol; cao chiết bài thuốc chứa Stixis suaveolens và Pandanus tonkinensis làm giảm nồng độ men gan ALT, AST, nồng độ MDA, TNF-$\alpha$, IFN-$\gamma$ trên chuột tổn thương gan do $\text{CCl}_4$.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù chi Pandanus có nhiều nghiên cứu, loài Pandanus tonkinensis Mart. ex B. Stone sinh trưởng phổ biến tại Việt Nam và được sử dụng trong y học dân gian chữa bệnh gan mật nhưng hoàn toàn chưa có nghiên cứu nào công bố về thành phần hóa học, cấu trúc đơn chất và hoạt tính sinh học in vitro tương ứng. Luận án tập trung giải quyết toàn diện khoảng trống này: phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất từ cả quả và rễ của P. tonkinensis, sàng lọc hoạt tính kháng viêm và chống oxy hóa, tìm ra chất đánh dấu và xây dựng quy trình phân tích định lượng đạt chuẩn quốc tế.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Định hướng hoạt tính bảo vệ gan: Tổn thương gan thường đi kèm phản ứng viêm và stress oxy hóa. Trong phản ứng viêm, đại thực bào giải phóng các chất trung gian gây viêm như nitric oxide (NO) do enzyme cảm ứng iNOS tổng hợp, cùng các cytokine tiền viêm (TNF-$\alpha$, IL-1$\beta$, IL-6). Trong stress oxy hóa, sự mất cân bằng giữa các gốc oxy phản ứng (ROS) và hệ thống chống oxy hóa dẫn đến peroxy hóa lipid màng tế bào, tạo sản phẩm cuối là malondialdehyde (MDA). Do đó, luận án sử dụng 2 mô hình thử nghiệm in vitro làm khung sàng lọc hoạt tính bảo vệ gan: (1) ức chế sản sinh NO trên tế bào macrophage RAW 264.7 được kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS); (2) ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào gan chuột.
• Khung lý thuyết về chất đánh dấu (Chemical Marker): Dựa trên hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), USFDA, AOAC, USP và ICH. Chất đánh dấu định lượng cho dược liệu cần thỏa mãn: là thành phần chính có hàm lượng đủ lớn, có hoạt tính sinh học đặc trưng cho hướng điều trị hoặc đặc trưng cho loài, có khả năng phân tách và định lượng ổn định bằng HPLC.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Xử lý và chiết xuất mẫu: Dược liệu quả và rễ được thái lát, phơi trong bóng râm, sấy ở 40–45°C và nghiền thành bột mịn. Chiết xuất hỗ trợ bằng sóng siêu âm sử dụng dung môi methanol (tỷ lệ dược liệu:dung môi là 1:3, chiết 3 lần, mỗi lần 3 giờ). Gom dịch chiết, cô quay chân không thu cao tổng methanol. Cao tổng được phân bố lỏng–lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate và nước.
2. Kỹ thuật phân lập và tinh chế:
   • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60 $\text{F}{254}$ và RP-18 $\text{F}{254\text{s}}$ (Merck), soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, hiện màu bằng dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4$ 10% hơ nóng.
   • Sắc ký cột (CC): Cột pha thuận dùng Silica gel cỡ hạt 0,040–0,063 mm (230–400 mesh); cột pha đảo dùng vật liệu LiChroprep RP-18 (40–63 $\mu$m), YMC (150 $\mu$m) và nhựa trao đổi ion Diaion HP-20.
   • Sắc ký lỏng điều chế (Preparative HPLC): Máy Pure C-850 (Buchi) và hệ thống HPLC trang bị cột bán điều chế/điều chế J'sphere ODS-H80 ($150 \times 20\text{ mm}$, kích thước hạt 4 $\mu$m).
3. Kỹ thuật xác định cấu trúc hóa học:
   • Khối phổ phân giải cao phun mù điện tử (HR-ESI-MS) trên thiết bị SCIEX X500 Q-TOF và Agilent 6530 Accurate Mass Q-TOF LC/MS.
   • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT-90, DEPT-135) và 2D (HSQC, HMBC, $^1\text{H}$-$^1\text{H}$ COSY, NOESY) đo trên máy Bruker Avance NEO 600 MHz và Bruker AM500 FT-NMR với dung môi $\text{CD}_3\text{OD}$, chất nội chuẩn tetramethylsilane (TMS).
   • Phổ lưỡng sắc tròn (CD) đo trên máy Chirascan CD Spectrometer (Applied Photophysics), kết hợp tính toán phổ ECD lý thuyết.
   • Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) trên thiết bị Nicolet Impact 410 và Perkin Elmer; phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) trên máy Shimadzu; góc quay cực riêng ($[\alpha]_\text{D}$) đo trên phân cực kế JASCO P-2000.
4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học in vitro:
   • Ứng chế peroxy hóa lipid màng tế bào gan chuột: Đồng thể hóa mô gan chuột trong đệm phosphat pH 7,4 (tỷ lệ 1:10); tạo gốc tự do bằng hệ Fenton ($\text{FeSO}_4$ 0,1 mM : $\text{H}_2\text{O}_2$ 15 mM); phản ứng tạo phức màu giữa MDA và acid thiobarbituric (TBA 0,8%) ở 100°C trong 15 phút, đo quang ở bước sóng $\lambda = 532\text{ nm}$. Đối chứng dương: Trolox.
   • Ứng chế sản sinh NO trên đại thực bào RAW 264.7: Nuôi cấy tế bào RAW 264.7 ($2 \times 10^5\text{ tế bào/giếng}$), ủ với mẫu thử 2 giờ trước khi kích thích bằng LPS (10 $\mu$g/mL) trong 24 giờ. Đo hàm lượng nitrite bằng bộ thuốc thử Griess (sulfanilamide 1% trong $\text{H}_3\text{PO}4$ 5% và N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride 0,1%) ở bước sóng 540 nm. Đối chứng dương: $N^\text{G}$-Methyl-L-arginine acetate (L-NMMA). Tính $\text{IC}{50}$ bằng phần mềm TableCurve 2Dv4. Đánh giá độ sống sót của tế bào bằng phép thử MTT ở bước sóng 540 nm.
5. Thẩm định quy trình phân tích định lượng HPLC: Theo hướng dẫn của USFDA, AOAC International, USP và ICH với các tiêu chí: tính đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính đường chuẩn, độ lặp lại, độ tái lặp trung gian, độ đúng (hiệu suất thu hồi), giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng quan toàn diện về cơ sở thực vật học, hóa học và dược lý của chi Pandanus và loài Pandanus tonkinensis:

• Trình bày đặc điểm hình thái học, phân loại học theo hệ thống APG IV (2018) và phân bố địa lý của 20 loài thuộc chi Pandanus tại Việt Nam.
• Mô tả chi tiết đặc điểm thực vật, sinh thái và kinh nghiệm sử dụng trong y học cổ truyền của loài Pandanus tonkinensis Martelli ex B. Stone (cây cao 1–2 m, phân nhánh, quả phức kích thước $55 \times 50\text{ cm}$, sinh thái rừng núi độ cao 600–1200 m).
• Tổng thuật 128 hợp chất tự nhiên đã biết từ chi Pandanus (42 alkaloid, 5 carotenoid, 13 terpenoid, 19 dẫn xuất carboxylic acid, 49 lignan và hợp chất khác).
• Tổng quan các nghiên cứu dược lý về tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa, hạ đường huyết và bảo vệ gan in vivo của chi Pandanus.
• Trình bày cơ sở lý thuyết về đáp ứng viêm (vai trò của TNF-$\alpha$, IL-1$\beta$, IL-6, IL-10, COX-2, iNOS, NF-$\kappa$B) và stress oxy hóa (gốc tự do ROS, lipid peroxy hóa, MDA, SOD).
• Phân tích nguyên tắc và tiêu chí lựa chọn chất đánh dấu hóa học kiểm soát chất lượng dược liệu theo chuẩn mực của WHO và các Dược điển quốc tế.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu, hóa chất, thiết bị và quy trình thực nghiệm:

• Nguyên liệu: 9,6 kg quả khô và 14,0 kg rễ khô Pandanus tonkinensis thu thập tại Hòa Bình, Thanh Hóa, Thái Nguyên, được giám định tên khoa học và lưu mẫu tiêu bản HNU 024663.
• Hóa chất và thiết bị: Danh mục chi tiết các dung môi hữu cơ tinh khiết, silica gel, pha đảo RP-18, Diaion HP-20, tế bào RAW 264.7, cùng hệ thống máy móc đo phổ hiện đại (Bruker 600 MHz NMR, SCIEX X500 Q-TOF, Chirascan CD, HPLC-DAD Shimadzu, Pure C-850 Buchi).
• Quy trình chiết tách: Thiết lập sơ đồ chiết siêu âm với MeOH, phân đoạn chiết lỏng–lỏng và các bước sắc ký cột kết hợp HPLC điều chế phân lập đơn chất từ quả và rễ.
• Quy trình thử nghiệm in vitro: Mô tả chi tiết các bước tiến hành định lượng MDA (phản ứng với TBA ở 532 nm) và định lượng NO (thuốc thử Griess ở 540 nm) kết hợp thử độc tính MTT.
• Quy trình thẩm định HPLC: Thiết lập phương pháp chuẩn bị mẫu, điều kiện sắc ký pha động gradient acid formic 0,1% và acetonitrile, phương pháp tính toán các thông số thẩm định theo hướng dẫn ICH.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được của luận án:

1. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học

• Từ quả Pandanus tonkinensis: Phân lập và xác định cấu trúc của 8 hợp chất tinh khiết gồm 4 lignan, 2 neolignan, 1 flavan và 1 polyphenol:

  1. Ficusal (PT1)
  2. Syringaresinol (PT2)
  3. Medioresinol (PT3)
  4. Lariciresinol (PT4)
  5. Secoisolariciresinol (PT5)
  6. Vladinol F (PT6)
  7. Luteoliflavan (PT7)
  8. Isorhapontigenin (PT8)

• Từ rễ Pandanus tonkinensis: Phân lập và xác định cấu trúc của 20 hợp chất, gồm 3 hợp chất mới (PT10, PT25, PT26) và 17 hợp chất đã biết:

  • 3 hợp chất mới:
    1. PT10: (7R)-2,6-dimethoxyphenyl-7,9-propanediol-1-O-$\beta$-D-glucopyranoside (công thức phân tử và cấu hình tuyệt đối được xác định bằng kết hợp phổ HR-ESI-MS, NMR 1D, 2D và so sánh phổ ECD tính toán lý thuyết với phổ CD thực nghiệm).
    2. PT25: cis-cinnamyl alcohol 9-O-(6'-O-$\beta$-L-arabinofuranosyl)-$\beta$-D-glucopyranoside (xác định cấu trúc bằng HR-ESI-MS, $^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, HSQC, HMBC, COSY, NOESY).
    3. PT26: [4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenol $\beta$-D-apiofuranosyl(1$\rightarrow$6)-$\beta$-D-glucopyranoside] (xác định cấu trúc bằng HR-ESI-MS, $^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, HSQC, HMBC, COSY, NOESY).
  • 17 hợp chất đã biết: Dihydrosyringin (PT9), (6S,9S)-roseoside (PT11), 1-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-2-{2,6-dimethoxy-4-[1-(E)-propen-3-ol]phenoxyl}propan-3-ol (PT12), 1-O-($\beta$-D-glucopyranosyl)-2-[2-methoxy-4-($\omega$-hydroxypropyl)-phenoxyl]-propan-3-ol (PT13), benzyl O-$\beta$-L-arabinopyranosyl-(1$\rightarrow$6)-$\beta$-D-glucopyranoside (PT14), 1-O-($\beta$-D-glucopyranosyl)-2-[2,6-dimethoxy-4-($\omega$-hydroxypropyl)-phenoxyl]-propan-3-ol (PT15), (7R,8R)-threo-4,7,9,9'-tetrahydroxy-3,3'-dimethoxyl-8-O-4'-neolignan-4-O-$\beta$-D-glucopyranoside (PT16), (7S,8S)-threo-4,7,9,9'-tetrahydroxy-3,3'-dimethoxyl-8-O-4'-neolignan-4-O-$\beta$-D-glucopyranoside (PT17), pinoresinol-4,4'-di-O-$\beta$-D-glucoside (PT18), isoeucommin A (PT19), pinoresinol 4'-O-$\beta$-D-glucopyranoside (PT20), acanthoside B (PT21), eucommin A (PT22), rourinoside (PT23), (7S,8R)-5-methoxydihydrodehydrodiconiferyl alcohol-4-O-$\beta$-D-glucopyranoside (PT24), kelampayoside A (PT27), urolignoside (PT28).

Nhóm hợp chất	Ký hiệu mã chất	Tên hợp chất	Bộ phận phân lập	Phân loại cấu trúc
Hợp chất từ quả	PT1	Ficusal	Quả	Neolignan
	PT2	Syringaresinol	Quả	Lignan
	PT3	Medioresinol	Quả	Lignan
	PT4	Lariciresinol	Quả	Lignan
	PT5	Secoisolariciresinol	Quả	Lignan
	PT6	Vladinol F	Quả	Neolignan
	PT7	Luteoliflavan	Quả	Flavan
	PT8	Isorhapontigenin	Quả	Polyphenol
Hợp chất mới từ rễ	PT10	(7R)-2,6-dimethoxyphenyl-7,9-propanediol-1-O-$\beta$-D-glucopyranoside	Rễ	Phenylpropanoid glycoside (Hợp chất mới)
	PT25	cis-cinnamyl alcohol 9-O-(6'-O-$\beta$-L-arabinofuranosyl)-$\beta$-D-glucopyranoside	Rễ	Phenylpropanoid glycoside (Hợp chất mới)
	PT26	[4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenol $\beta$-D-apiofuranosyl(1$\rightarrow$6)-$\beta$-D-glucopyranoside]	Rễ	Phenylpropanoid glycoside (Hợp chất mới)
Hợp chất đã biết từ rễ	PT9	Dihydrosyringin	Rễ	Phenylpropanoid glycoside
	PT11	(6S,9S)-roseoside	Rễ	Megastigmane glycoside
	PT12	1-O-$\beta$-D-glucopyranosyl-2-{2,6-dimethoxy-4-[1-(E)-propen-3-ol]phenoxyl}propan-3-ol	Rễ	Phenylpropanoid glycoside
	PT13	1-O-($\beta$-D-glucopyranosyl)-2-[2-methoxy-4-($\omega$-hydroxypropyl)-phenoxyl]-propan-3-ol	Rễ	Phenylpropanoid glycoside
	PT14	Benzyl O-$\beta$-L-arabinopyranosyl-(1$\rightarrow$6)-$\beta$-D-glucopyranoside	Rễ	Benzyl glucopyranoside
	PT15	1-O-($\beta$-D-glucopyranosyl)-2-[2,6-dimethoxy-4-($\omega$-hydroxypropyl)-phenoxyl]-propan-3-ol	Rễ	Phenylpropanoid glycoside
	PT16	(7R,8R)-threo-4,7,9,9'-tetrahydroxy-3,3'-dimethoxyl-8-O-4'-neolignan-4-O-$\beta$-D-glucopyranoside	Rễ	Neolignan glycoside
	PT17	(7S,8S)-threo-4,7,9,9'-tetrahydroxy-3,3'-dimethoxyl-8-O-4'-neolignan-4-O-$\beta$-D-glucopyranoside	Rễ	Neolignan glycoside
	PT18	Pinoresinol-4,4'-di-O-$\beta$-D-glucoside	Rễ	Lignan glycoside
	PT19	Isoeucommin A	Rễ	Lignan glycoside
	PT20	Pinoresinol 4'-O-$\beta$-D-glucopyranoside	Rễ	Lignan glycoside
	PT21	Acanthoside B	Rễ	Lignan glycoside
	PT22	Eucommin A	Rễ	Lignan glycoside
	PT23	Rourinoside	Rễ	Phenolic glycoside
	PT24	(7S,8R)-5-methoxydihydrodehydrodiconiferyl alcohol-4-O-$\beta$-D-glucopyranoside	Rễ	Neolignan glycoside
	PT27	Kelampayoside A	Rễ	Phenylpropanoid glycoside
	PT28	Urolignoside	Rễ	Phenylpropanoid glycoside

2. Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro

• Các hợp chất phân lập được thử nghiệm hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào RAW 264.7 kích thích bởi LPS và hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào gan chuột.
• Kết quả sàng lọc cho thấy các hợp chất nhóm lignan và neolignan thể hiện hoạt tính kháng viêm và chống oxy hóa đáng kể, giải thích cơ sở khoa học cho tác dụng bảo vệ gan của dược liệu.

3. Lựa chọn, chiết xuất và tinh chế chất đánh dấu

• Dựa trên hàm lượng chiết tách lớn, độ ổn định sắc ký và hoạt tính sinh học, luận án đã lựa chọn 2 hợp chất làm chất đánh dấu:
  1. PT20: Pinoresinol 4'-O-$\beta$-D-glucopyranoside
  2. PT6: Vladinol F
• Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế 2 chất đánh dấu đạt độ tinh khiết cao. Xác nhận lại cấu trúc và độ tinh khiết bằng phổ HR-ESI-MS, $^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, HSQC, HMBC, phổ UV và phổ FT-IR.

4. Xây dựng và thẩm định quy trình phân tích định lượng HPLC

• Khảo sát dung môi xử lý mẫu: So sánh hiệu suất chiết giữa ethanol 50% và methanol 50%.
• Điều kiện sắc ký: Cột pha đảo $\text{C}_{18}$, detector DAD, pha động gradient gồm dung dịch acid formic 0,1% và acetonitrile.
• Kết quả thẩm định quy trình theo hướng dẫn ICH, AOAC và USP:
  • Tính đặc hiệu: Thời gian lưu của pic PT20 và PT6 trong mẫu thử trùng khớp với dung dịch chuẩn; phổ tử ngoại (UV) đồng nhất tại mọi điểm trên pic; không có pic tạp chất gây nhiễu tại thời gian lưu phân tích.
  • Độ thích hợp hệ thống: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu qua các lần tiêm lặp lại đều đạt yêu cầu.
  • Khoảng tuyến tính: Đường chuẩn của PT20 và PT6 có hệ số tương quan tuyến tính cao ($R^2 > 0{,}999$).
  • Độ chính xác và độ lặp lại: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của độ lặp lại và độ tái lặp trung gian đều nằm trong giới hạn cho phép.
  • Độ đúng: Tỷ lệ thu hồi (recovery) của phương pháp khi thêm chuẩn đạt yêu cầu theo quy định của AOAC.
  • LOD và LOQ: Xác định được giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng cho cả 2 chất PT20 và PT6.
• Ứng dụng thực tế: Phân tích định lượng đồng thời pinoresinol 4'-O-$\beta$-D-glucopyranoside (PT20) và vladinol F (PT6) trong các mẫu dược liệu Dứa dại Pandanus tonkinensis thu thập tại các địa phương khác nhau (Hòa Bình, Thanh Hóa, Thái Nguyên).

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học lý luận

1. Luận án là công trình khoa học đầu tiên nghiên cứu toàn diện và có hệ thống về thành phần hóa học của loài Dứa dại Pandanus tonkinensis Martelli ex B. Stone tại Việt Nam.
2. Đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 28 hợp chất tinh khiết (8 hợp chất từ quả và 20 hợp chất từ rễ), trong đó có 3 hợp chất mới được công bố lần đầu tiên:
   • (7R)-2,6-dimethoxyphenyl-7,9-propanediol-1-O-$\beta$-D-glucopyranoside (PT10)
   • cis-cinnamyl alcohol 9-O-(6'-O-$\beta$-L-arabinofuranosyl)-$\beta$-D-glucopyranoside (PT25)
   • [4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenol $\beta$-D-apiofuranosyl(1$\rightarrow$6)-$\beta$-D-glucopyranoside] (PT26)
3. Cung cấp bộ dữ liệu phổ hoàn chỉnh (HR-ESI-MS, $^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY, CD/ECD, IR, UV) cho các hợp chất phân lập, bổ sung dữ liệu hóa thực vật học có giá trị cho chi Pandanus và họ Pandanaceae trên thế giới.
4. Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro (kháng viêm qua ức chế sinh NO và chống oxy hóa qua ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào gan) của các hợp chất phân lập, cung cấp luận cứ khoa học giải thích tác dụng bảo vệ gan theo kinh nghiệm y học cổ truyền.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn và giải pháp đề xuất

1. Đã lựa chọn được 2 chất đánh dấu hóa học đặc trưng cho loài Pandanus tonkinensis theo định hướng tác dụng bảo vệ gan là pinoresinol 4'-O-$\beta$-D-glucopyranoside (PT20) và vladinol F (PT6).
2. Xây dựng và chuẩn hóa quy trình chiết xuất, tinh chế 2 chất đánh dấu PT20 và PT6 với độ tinh khiết cao, phục vụ làm chất chuẩn đối chiếu.
3. Thiết lập và thẩm định thành công quy trình phân tích định lượng đồng thời 2 chất đánh dấu trong dược liệu Dứa dại bằng phương pháp HPLC-DAD đạt đầy đủ các tiêu chuẩn thẩm định theo hướng dẫn quốc tế (ICH, AOAC, USP, USFDA).
4. Áp dụng thành công quy trình định lượng để xác định hàm lượng PT20 và PT6 trong các mẫu Dứa dại thu thập thực tế tại một số địa phương, tạo công cụ phân tích kiểm soát chất lượng dược liệu và tiêu chuẩn hóa các sản phẩm bào chế từ loài này.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Các thử nghiệm hoạt tính sinh học định hướng bảo vệ gan mới dừng lại ở quy mô sàng lọc in vitro (mô hình ức chế sản sinh NO trên tế bào đại thực bào RAW 264.7 và mô hình ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào gan chuột), chưa thực hiện thử nghiệm dược lý chuyên sâu in vivo trên từng đơn chất phân lập.
• Số lượng mẫu dược liệu khảo sát hàm lượng chất đánh dấu thực tế mới tập trung tại 4 địa bàn thuộc miền Bắc và Bắc Trung Bộ (Hòa Bình, Thanh Hóa, Thái Nguyên), chưa bao phủ toàn bộ vùng phân bố tự nhiên của loài Pandanus tonkinensis kéo dài vào miền Trung và Tây Nguyên.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Tiếp tục mở rộng khảo sát hàm lượng các chất đánh dấu (PT20, PT6) theo các mùa thu hái trong năm và tại các vùng sinh thái địa lý khác nhau để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng toàn diện cho dược liệu.
• Mở rộng nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử tác dụng bảo vệ gan của các đơn chất lignan/neolignan tiềm năng trên các mô hình tế bào gan người và mô hình động vật in vivo.
• Nghiên cứu quy trình chiết xuất ở quy mô lớn hơn (pilot) nhằm thu hồi các hoạt chất chính phục vụ phát triển các chế phẩm hỗ trợ điều trị bệnh gan mật từ nguồn dược liệu Dứa dại Việt Nam.

---

Giá trị tham khảo

Luận án có giá trị khoa học và thực tiễn chuyên môn đối với nhiều nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Hóa phân tích, Hóa hợp chất thiên nhiên và Dược học: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình chiết tách phân đoạn, kỹ thuật phân lập phối hợp sắc ký cột pha thuận, pha đảo, sắc ký trao đổi ion và HPLC điều chế; phương pháp luận biện giải cấu trúc các hợp chất tự nhiên mới bằng phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS, phổ NMR đa chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) và phổ lưỡng sắc tròn CD/ECD.
• Các viện nghiên cứu, phòng kiểm nghiệm thuốc và cơ quan quản lý dược liệu: Cung cấp quy trình HPLC-DAD đã được thẩm định theo tiêu chuẩn quốc tế (ICH, AOAC, USP) để định tính, định lượng và kiểm soát chất lượng nguyên liệu dứa dại, ngăn ngừa nhầm lẫn hoặc pha trộn dược liệu thuộc chi Pandanus.
• Các nhà sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng: Cung cấp dữ liệu khoa học về thành phần hoạt chất, chất đánh dấu và quy trình chiết xuất tinh chế hoạt chất phục vụ nghiên cứu phát triển các chế phẩm bảo vệ gan mật có nguồn gốc thảo dược.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc được bao nhiêu hợp chất từ loài Pandanus tonkinensis?

Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của tổng cộng 28 hợp chất tinh khiết, trong đó có 8 hợp chất từ quả (PT1 đến PT8) và 20 hợp chất từ rễ (PT9 đến PT28).

2. Có bao nhiêu hợp chất mới được phát hiện trong luận án và cấu trúc của chúng thuộc nhóm nào?

Luận án đã phát hiện và công bố 3 hợp chất mới (tất cả đều phân lập từ rễ), gồm:

1. PT10: (7R)-2,6-dimethoxyphenyl-7,9-propanediol-1-O-$\beta$-D-glucopyranoside (nhóm phenylpropanoid glycoside).
2. PT25: cis-cinnamyl alcohol 9-O-(6'-O-$\beta$-L-arabinofuranosyl)-$\beta$-D-glucopyranoside (nhóm phenylpropanoid glycoside).
3. PT26: [4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenol $\beta$-D-apiofuranosyl(1$\rightarrow$6)-$\beta$-D-glucopyranoside] (nhóm phenylpropanoid glycoside).

3. Những hợp chất nào được lựa chọn làm chất đánh dấu (chemical markers) cho dược liệu Dứa dại và vì sao?

Hai hợp chất được lựa chọn làm chất đánh dấu là pinoresinol 4'-O-$\beta$-D-glucopyranoside (PT20) và vladinol F (PT6). Lý do lựa chọn dựa trên tiêu chí: đây là các thành phần chính có hàm lượng phân lập cao trong dược liệu, có tính ổn định sắc ký tốt trên hệ thống HPLC-DAD, và thể hiện hoạt tính sinh học phù hợp với định hướng tác dụng bảo vệ gan (kháng viêm và chống oxy hóa).

4. Hoạt tính sinh học định hướng bảo vệ gan được đánh giá qua những mô hình thử nghiệm nào?

Hoạt tính được đánh giá thông qua 2 mô hình thử nghiệm in vitro:

• Thử nghiệm ức chế sản sinh nitric oxide (NO) trên tế bào đại thực bào RAW 264.7 kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS), đo bằng thuốc thử Griess ở bước sóng 540 nm (đối chứng dương: L-NMMA), kết hợp kiểm tra độ sống sót tế bào bằng phép thử MTT.
• Thử nghiệm ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào gan chuột gây bởi hệ Fenton ($\text{FeSO}_4/\text{H}_2\text{O}_2$), định lượng hàm lượng malondialdehyde (MDA) qua phản ứng tạo phức màu với thiobarbituric acid (TBA) đo ở bước sóng 532 nm (đối chứng dương: Trolox).

5. Quy trình định lượng HPLC chất đánh dấu được thẩm định theo các tiêu chuẩn nào và khảo sát trên những thông số gì?

Quy trình định lượng HPLC được thẩm định theo các hướng dẫn của ICH, AOAC International, USP và USFDA. Các thông số thẩm định bao gồm: tính đặc hiệu (specificity), độ thích hợp hệ thống (system suitability), khoảng tuyến tính đường chuẩn (linearity), độ lặp lại (repeatability), độ tái lặp trung gian (intermediate precision), độ đúng/hiệu suất thu hồi (accuracy/recovery), giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Đinh Thị Huyền Trang đã thực hiện nghiên cứu chuyên sâu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học định hướng bảo vệ gan của loài Dứa dại Pandanus tonkinensis Martelli ex B. Stone tại Việt Nam. Công trình đã phân lập và xác định cấu trúc 28 hợp chất (gồm 8 chất từ quả và 20 chất từ rễ), trong đó có 3 hợp chất mới thuộc nhóm phenylpropanoid glycoside được công bố lần đầu tiên. Luận án đã lựa chọn thành công 2 chất đánh dấu pinoresinol 4'-O-$\beta$-D-glucopyranoside (PT20) và vladinol F (PT6), tinh chế chất chuẩn đối chiếu và xây dựng quy trình định lượng HPLC-DAD được thẩm định đầy đủ theo chuẩn mực quốc tế. Kết quả của luận án cung cấp cơ sở khoa học giải thích kinh nghiệm sử dụng dược liệu trong dân gian, đồng thời mang lại công cụ kiểm nghiệm phục vụ tiêu chuẩn hóa và phát triển các chế phẩm bảo vệ gan mật từ nguồn tài nguyên thực vật Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

GIÁODĀC BàGIÁO Bà DĀCVÀ VÀĐÀO ĐÀOT¾O T¾O HÀN HÀN VIàN VIàN LÂM LÂM KHOA KHOA HâC HâC VÀ CÔNG VÀ CÔNG NGHà NGHà VIàT VIàT NAM NAM HàC VIàN HàC VIàN KHOA KHOA HàC VÀ CÔNG HàC VÀ CÔNG NGHà NGHà ----------------------------- ----------------------------- ĐINH THÞ HUYÀN TRANG NGHIÊN CĄU PHÂN TÍCH THÀNH PHÄN, CÂU NGHIÊN CĄU PHÂN TÍCH THÀNH PHÄN, CÂU TRÚC HÓA TRÚC HÓA HàC CĂA CÁC HþP CHÂT TĆ LOÀI HàC CĂA CÁC HþP CHÂT TĆ LOÀI DĄA D¾I (Pandanus DĄA D¾IMART.EX tonkinensis (Pandanus tonkinensis B.STONE) CÁC PH¯¡NG PHÁP BÆNG CÁC PH¯¡NG HÓA LÝPHÁP HIàN HÓA Đ¾I LÝ HIàN Đ¾I LUÂN ÁN TI¾N SĨ HÓA HàC Chuyên ngành: Hóa Phân Tích Mã số: 9 44 01 18 LUÂN ÁN TI¾N SĨ HÓA HàC NG¯âI H¯àNG DÀN KHOA HàC PGS. D°¢ng Hßng Anh PGS. Ngô Quốc Anh Hà Nßi - 2023 Hà Nßi - 2023 i LâI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và nghiên cứu. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất.

Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tác giÁ luÃn án NCS Đinh Thß HuyÁn Trang ii LâI CÀM ¡N LuÁn án này đ°ÿc hoàn thành t¿i Phòng thí nghiám trãng điểm Công nghá phân tích phāc vā Kiểm đánh môi tr°ång và an toàn thực phẩm - Tr°ång Đ¿i hãc Khoa hãc tự nhiên - Đ¿i hãc Quác gia Hà Nái, Vián Hóa sinh biển - Vián Hàn lâm Khoa hãc & Công nghá Viát Nam và Tr°ång Đ¿i hãc Vinh. Trong quá trình nghiên cąu, tác giÁ đã nhÁn đ°ÿc sự giúp đỡ quý báu căa các thÅy cô, các nhà khoa hãc, các đßng nghiáp, b¿n bè và gia đình.

Tôi xin bày tß låi cÁm ¢n sâu sÃc, sự cÁm phāc và kính trãng nhÃt tãi PGS. D°¢ng Hßng Anh và PGS. Ngô Quác Anh đã đánh h°ãng, tÁn tâm h°ãng d¿n khoa hãc, đáng viên và t¿o mãi điều kián thuÁn lÿi cho tôi trong suát thåi gian thực hián luÁn án. Tôi xin trân trãng cÁm ¢n Ban lãnh đ¿o Hãc vián Khoa hãc và Công nghá, đßng cÁm ¢n Ban lãnh đ¿o Vián Hóa hãc cùng tÁp thể cán bá căa Vián đã quan tâm, giúp đỡ và t¿o mãi điều kián thuÁn lÿi cho tôi trong suát quá trình hãc tÁp và nghiên cąu.

Tôi xin chân thành cÁm ¢n tÁp thể phòng Nghiên cąu cÃu trúc - Vián Hóa sinh biển đã t¿o điều kián về thåi gian, c¢ sç vÁt chÃt, trang thiÁt bá hián đ¿i cho tôi thực hián luÁn án. Tôi xin trân trãng cÁm ¢n ban lãnh đ¿o Tr°ång Đ¿i hãc Vinh đặc biát là các thÅy cô Khoa Hóa hãc - Tr°ång s° ph¿m - Tr°ång Đ¿i hãc Vinh đã quan tâm giúp đỡ, đóng góp các ý kiÁn quý báu để tôi hoàn thành luÁn án. Tôi xin chân thành cÁm ¢n Phòng thí nghiám trãng điểm cÃp Đ¿i hãc quác gia <Công nghá phân tích phāc vā kiểm đánh môi tr°ång và an toàn thực phẩm= KLATEFOS đặc biát là GS. Ph¿m Hùng Viát đã đóng góp cho tôi nhāng kiÁn thąc quý báu và t¿o điều kián thuÁn lÿi cho tôi thực hián đề tài này.

Tôi xin bày tß lòng biÁt ¢n chân thành và sâu sÃc nhÃt tãi toàn thể gia đình, b¿n bè và nhāng ng°åi thân đã luôn luôn quan tâm, khích lá, đáng viên tôi trong suát quá trình hãc tÁp và nghiên cąu. Xin trân trãng cÁm ¢n! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tác giÁ luÃn án NCS Đinh Thß HuyÁn Trang iii MĀC LĀC LäI CAM ĐOAN. iii DANH MĀC BÀNG.vi DANH MĀC HÌNH.viii DANH MĀC CÁC CHĀ VIÀT TÂT.Giãi thiáu s¢ l°ÿc về chi Pandanus. Đặc điểm hình thái chung căa chi Pandanus.

Chi Pandanus ç Viát Nam và s¢ bá về phân bá các loài. Giãi thiáu về loài Pandanus tonkinensis Martelli ex B. Tình hình nghiên cąu về thành phÅn hóa hãc căa chi Pandanus. Các nghiên cąu về ho¿t tính sinh hãc căa dách chiÁt và các chÃt phân lÁp từ chi Pandanus.

Các ph°¢ng pháp hóa lý dùng để chiÁt tách, phân lÁp, xác đánh cÃu trúc các chÃt tinh khiÁt từ d°ÿc liáu. Ph°¢ng pháp chiÁt m¿u thực vÁt. Ph°¢ng pháp phân lÁp các chÃt tinh khiÁt. Các ph°¢ng pháp phân tích xác đánh cÃu trúc các chÃt phân lÁp đ°ÿc.

Đánh giá ho¿t tính sinh hãc theo đánh h°ãng bÁo vá gan. Viêm và mát sá yÁu tá quan trãng trong phÁn ąng viêm. S¢ l°ÿc về ho¿t tính cháng oxy hóa. ChÃt đánh dÃu hóa hãc và ph°¢ng pháp lựa chãn chÃt đánh dÃu hóa hãc căa d°ÿc liáu.

Tóm tÃt các vÃn đề đề tài luÁn án cÅn giÁi quyÁt. PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU. Hóa chÃt, dāng cā và thiÁt bá nghiên cąu. Ph°¢ng pháp nghiên cąu.

ChiÁt xuÃt d°ÿc liáu. Ph°¢ng pháp phân lÁp các hÿp chÃt. Ph°¢ng pháp xác đánh cÃu trúc. Ph°¢ng pháp đánh giá ho¿t tính sinh hãc.

Ph°¢ng pháp lựa chãn, chiÁt xuÃt- tinh chÁ chÃt đánh dÃu, xây dựng và thẩm đánh quy trình phân tích đánh l°ÿng chÃt đánh dÃu. Phân lÁp các hÿp chÃt. Phân lÁp các hÿp chÃt từ quÁ loài Pandanus tonkinensis. Phân lÁp các hÿp chÃt từ rß loài Pandanus tonkinensis.

KÀT QUÀ VÀ THÀO LUÀN. Xác đánh cÃu trúc hóa hãc các hÿp chÃt phân lÁp từ quÁ và rß loài Pandanus tonkinensis. Xác đánh cÃu trúc hóa hãc các hÿp chÃt phân lÁp từ quÁ loài Pandanus tonkinensis. Xác đánh cÃu trúc hóa hãc các hÿp chÃt phân lÁp từ rß loài Pandanus tonkinensis.

Đánh giá ho¿t tính sinh hãc căa các hÿp chÃt phân lÁp đ°ÿc. Ho¿t tính kháng viêm căa các chÃt đã phân lÁp thông qua ąc chÁ quá trình sÁn sinh NO trên tÁ bào RAW 264,7 đ°ÿc kích thích bçi LPS. Ho¿t tính cháng oxy hóa căa các chÃt đã phân lÁp thông qua ąc chÁ quá trình peroxy hoá lipid màng tÁ bào. Lựa chãn chÃt đánh dÃu.

ChiÁt xuÃt, tinh chÁ chÃt đánh dÃu từ d°ÿc liáu. Tinh chÁ chÃt đánh dÃu. Tóm tÃt qui trình chiÁt xuÃt và tinh chÁ hai chÃt đánh dÃu. Xác nhÁn l¿i cÃu trúc và đá tinh khiÁt căa chÃt đánh dÃu.

Xây dựng và thẩm đánh quy trình đánh l°ÿng hÿp chÃt pinorecinol 4’-O-³- D-glucopyranoside và chÃt vladinol F trong loài dąa d¿i Pandanus tonkinensis 81 3. KhÁo sát quy trình xÿ lý m¿u tr°ãc khi phân tích đánh l°ÿng chÃt đánh dÃu. Quy trình đánh l°ÿng hÿp chÃt pinorecinol 4’-O-³-D-glucopyranoside và chÃt vladinol F trong d°ÿc liáu dąa d¿i Pandanus tonkinensis. Thẩm đánh quy trình đánh l°ÿng hÿp chÃt pinorecinol 4’-O-³-D- glucopyranoside và chÃt vladinol F trong dąa d¿i Pandanus tonkinensis.

Giãi h¿n phát hián và giãi h¿n đánh l°ÿng căa ph°¢ng pháp. Đánh l°ÿng pinorecinol 4’-O-³-D-glucopyranoside (PT20) và vladinol F (PT6) trong dąa d¿i Pandanus tonkinensis thu thÁp ç 1 sá đáa ph°¢ng. 97 NHĀNG ĐÓNG GÓP MâI CĂA LUÀN ÁN. 100 CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐÀN LUÀN ÁN.

101 TÀI LIàU THAM KHÀO. 102 vi DANH MĀC BÀNG Bảng 1. Tóm tÃt các thông tin c¢ bÁn các loài thuác chi Pandanus. 4 ç Viát Nam hián nay.

Các hÿp chÃt alkaloids phân lÁp từ loài Pandanus amaryllifolius. Các hÿp chÃt carotenoid phân lÁp từ loài Pandanus tectorius. Các hÿp chÃt terpenoid phân lÁp từ chi Pandanus. Các hÿp chÃt d¿n xuÃt carboxylic acid từ chi Pandanus.

Lignan và các hÿp chÃt khác từ chi Pandanus. Sá liáu phá NMR căa hÿp chÃt mãi PT10 và chÃt so sánh (7R)-2,6- dimethoxyphenyl-7,9- propanediol-1-O-³-D-glucopyra noside. Sá liáu phá NMR căa hÿp chÃt mãi PT25 và chÃt so sánh cis-cinnamyl alcohol 9-O-(6’-O-³-L-arabinofuranosyl)-³-D-glucopyranoside. Sá liáu phá NMR căa hÿp chÃt mãi PT26 và chÃt so sánh [4-(3- hydroxypropyl)-2-methoxyphenol ³-D-apiofuranosyl(146)-³-D- glucopyranoside.

Ho¿t tính ąc chÁ sÁn sinh NO căa các chÃt phân lÁp từ dąa d¿i Pandanus tonkinensis. Ho¿t tính ąc chÁ peroxy hóa lipid màng tÁ bào căa các chÃt phân lÁp từ dąa d¿i Pandanus tonkinensis. Ch°¢ng trình pha đáng acid formic 0,1% / acetonitrile&&&&&& 61 Bảng 3. Ch°¢ng trình pha đáng acid formic 0,1% / acetonitrile&.

Sá liáu phá NMR căa hÿp chÃt PT2B1A và chÃt so sánh pinorecinol 4’-O-³-D-glucopyranoside. Sá liáu phá NMR căa hÿp chÃt PT2D1A và chÃt so sánh vladinol F. KÁt quÁ xác đánh đá tinh khiÁt căa hÿp chÃt PT20 - pinorecinol 4’-O- ³-D-glucopyranoside. KÁt quÁ xác đánh đá tinh khiÁt căa hÿp chÃt PT6 3 vladinol F.

KÁt quÁ dián tích các chÃt đánh dÃu trong Dąa d¿i Pandanus tonkinensis chiÁt bằng ethanol 50%. KÁt quÁ dián tích các chÃt đánh dÃu trong dąa d¿i Pandanus tonkinensis chiÁt bằng methanol 50%. KÁt quÁ dián tích các chÃt đánh dÃu trong dąa d¿i Pandanus tonkinensis chiÁt bằng ethanol 50% và methanol 50%. Ch°¢ng trình pha đáng đánh l°ÿng PT20 và PT6 trong d°ÿc liáu dąa d¿i Pandanus tonkinensis.

So sánh thåi gian l°u căa các pic trên sÃc ký đß căa dung dách chuẩn hßn hÿp, dung dách thÿ và m¿u trÃng. KÁt quÁ pic PT20, PT6 thu đ°ÿc trên sÃc ký đß dung dách chuẩn hßn hÿp (1) và dung dách chuẩn hßn hÿp (2). KÁt quÁ khÁo sát khoÁng đ°ång chuẩn để đánh l°ÿng PT20 và PT6 90 Bảng 3. KÁt quÁ khÁo sát đá lặp l¿i.

KÁt quÁ khÁo sát đá tái lặp căa ph°¢ng pháp. KÁt quÁ đánh giá đá đúng căa ph°¢ng pháp. KÁt quÁ đánh l°ÿng pinoresinol 4-O-beta-D-glucopyranoside (PT20) và vladinol F (PT6) trong dąa d¿i Pandanus tonkinensis lÃy t¿i mát sá đáa ph°¢ng. 96 viii DANH MĀC HÌNH Hình 1.

Hình Ánh mát sá loài thuác chi Pandanus [12]. M¿u tiêu bÁn quÁ Pandanus tonkinensis Mart. S¢ đß phân lÁp các hÿp chÃt từ quÁ Pandanus tonkinensis. S¢ đß phân lÁp các hÿp chÃt từ rß Pandanus tonkinensis.

CÃu trúc hóa hãc các hÿp chÃt đ°ÿc phân lÁp từ quÁ Pandanus tonkinensis. CÃu trúc hóa hãc các hÿp chÃt đ°ÿc phân lÁp từ rß Pandanus tonkinensis. CÃu trúc hóa hãc và t°¢ng tác HMBC căa hÿp chÃt PT10&&&&&. Phá ECD đ°ÿc tính toán lý thuyÁt căa 2 đßng phân lÁp thể có thể có và CD thÿ nghiám cho hÿp chÃt PT10.

Phá HR-ESI-MS căa hÿp chÃt PT10. Phá 1H NMR căa hÿp chÃt PT10. Phá 13C NMR căa hÿp chÃt PT10. Phá HMBC căa hÿp chÃt PT10.

Phá HSQC căa hÿp chÃt PT10. Phá CD căa hÿp chÃt PT10. CÃu trúc hóa hãc và t°¢ng tác HMBC căa hÿp chÃt PT25. Phá HR-ESI-MS căa hÿp chÃt PT25.

Phá 1H NMR căa hÿp chÃt PT25. Phá 13C NMR căa hÿp chÃt PT25. Phá HMBC căa hÿp chÃt PT25. Phá HSQC căa hÿp chÃt PT25.

Phá COSY căa hÿp chÃt PT25. Phá NOESY căa hÿp chÃt PT25. CÃu trúc hóa hãc và t°¢ng tác HMBC căa hÿp chÃt PT26. Phá HR-ESI-MS căa hÿp chÃt PT26 .