Chương 1-3, Cơ sở khoa học của đông lạnh trứng 1. Các phương pháp đồng lạnh Đông lạnh trừng à sự bảo quân thành công chức năng bình thưởng của ứng khỉ giảm nhiệt độ dưi mức phân ứng hóa học bình thưởng xây ra 37C, 5:CO; (điễu kiện sinh lý) xuống - 196'€ (nhiệt độ không sinh lý)). Đông lạnh trứng có thể phân loại theo bai cách chung là đông lạnh cân bằng tequiibdum" với phương pháp đồng lạnh chậm (slow fte ving) hay đông lạnh không cân ‘bing “nonequilibrium” vi phuong phip déng lạnh nhanh (rapid freezing) và phương pháp. thủy tỉnh hóa (viuiÑeaion), ty theo tốc độ làm lạnh và chất bảo guản đông lanh sử dụng “Tuy nhin, bản chất của các phương pháp này à giỗng nhau, cụ th là đều có mục đích chung nhằm bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng của tính thể đã nội bào, sự khử nước và thay đổi mạnh mẽ nồng độ chất tan ở cả nhiệt độcao và nhiệt độ thấp -# Phương pháp thủy tỉnh hóa (Vitriicaion) “hủy tỉnh hóa là quá tình lầm lạnh mẫu trứng hoặc phôi với thôi gian rắt nhanh.
“Trong suỗt quá tình hạ nhiệt độ, toàn bộ khối vật chất bên trong và bên ngoài ế bào chuyển thành dạng khối de, wong sut giống như diy inh (glass-like, de biệt không có sự hình thành tỉnh thể đã bên rong mẫu tế bào, cũng như mỗi trường bên ngoài rong quá tình lầm lạnh. [50,5] Phương pháp này loại trừ hạn chế của quả trình đông lạnh chậm là cn thiết bị phức tạp. Một thuận lợi nữa của phương pháp này là khả năng sống của tể bào cao nễu điều kiến tối wu đo không có ỉnh thể đá ngoại bào. Gn đây hơn, những phương pháp thủy tỉnh hóa cải tiến đã được phát tiễn, có khả năng lâm lạnh và làm ẩm cực nhanh nhờ giảm thiểu thể ích của dụng dịch bảo quân.
Phương pháp này hy vọng có khả năng bảo quản tế bào dễ bị tổn thương do đồng ạnh. 4 Chương Trong phương pháp thủy tỉnh hóa, tế bào cẳn được xử lí theo các bước đông lạnh thông thường như cần bing trong dung địch bảo vệ lạnh pha loãng, ngâm trong dung dich đông lạnh nhanh một khoảng thời gian ngắn trước khi được làm lạnh trong ni lòng. Thời gian tiếp xúc trong dung dịch của phương pháp thủy tỉnh hóa không chỉ phụ thuộc vào dung. dịch bảo vệ đông lạnh mà còn phụ thuộc vào nhiệt độ, cả tính thẩm của tế bảo và độc tính của chất bảo quản lạnh chịu ảnh hướng rộng bởi nhiệt độ.
TẾ bảo được huyễn phù trong một dung địch chất bảo quản thấm có nồng độ rất cao ở nhiệt độ phòng. Bởi vì sự hiện diện với nông độ cao các chất bảo quản có khả năng gây độc cho tễ bào nên trứng không được phép giữ lâu tại nhiệt độ này mà thay vào đố chỉ được cân bằng đông lạnh trong khoảng thời gian rắt ngắn trước khi chúng được nhúng trực tiếp vào nitø lỏng. [48] Khác với các phương pháp đông lạnh chậm và đông lạnh nhanh, trong phương pháp. đông lanh cục nhanh, th tích của dung địch đông lạnh nhanh được giảm đến mức tối thiểu sử dung nhiều công cụ khác nhau.
Ví dụ, tế bào được đặt ở đầu loop hay được đặt dính ở ống ‘bdo quin lạnh (cryotube hay eryoloop), Sng mao din mé (cong ra ha “open pulled straw”), hhay đông lạnh không có dụng cụ chứa (vi gigt). Mue đích của phương pháp này lä làm lạnh xà rã đông trúng với thể tích tối thiểu cẫn cho đông lạnh nhanh. Phương pháp đông lạnh cực nhanh cũng được đưa ra để cái tiến sự sống sót của tế bảo sau khi rã đông bởi vì nhiệt độ tối hạn có thể vượt qua nhanh chóng trước khi tế bào bị tổn thương. Tuy nhiền chất bảo quản được dùng tong kỹ thuật này có nổng độ rất cao, có kha năng gây nên những tổn thương về cấu túc di truyền cho tế bào.
Có lẽ đây là lý do ti sao phôi sau trữ lạnh có cấu trúc và phát triển rắt tốt khí nuôi trong éng nghiệm nhưng tỷ lệ thụ thai sau chuyển phối vẫn còn rất thấp. Người ta cho rằng thành công của phương pháp phụ thuộc vào loại và cách dùng chất bảo. quản lạnh, cũng như thời gian tiếp xúc với chất bảo quản lạnh trước khi chuyển thành dạng kính. Qui trình rã đông cũng phải thực hiện thật nhanh để hạn chế hiện tượng chuyển dạng từ kính sang nước đá.
Hiện tại tuy chưa thể áp dụng kỹ thuật này vào thực. 15 Chương tổ những tiềm năng của nó ắtlớn vinh đơn giản và những ưu điểm so với kỹ thuật làm lạnh chậm dang duge sit dung. Chat bio qui lank (Cryoprotective Adlitive CPA) “Các chất bảo quản lạnh được sử dựng trong kỹ thuật thủy tính hóa gằn giống như trong kỹ thuật đồng lạnh chậm trước đây, nhưng nồng độ sử dụng cao hơn. Trong một dung dịch đồng để thủy tính hóa luôn bao gồm một boặc bá chất bảo quản lạnh có khả năng thâm «qua mang té bào (permeable cryoprotectan) để khử nước bên tong tẾbào và một chất bảo vệ đồng lạnh không có khả năng thắm qua màng tế bào (non-permeable cryoprotectant) lim bi trọng, giúp quá trình khử nước bên trong tế bào xảy ra nhanh hơn.
Các chất bảo quản thường sử dụng cho phương pháp thủy tình hóa “+ Chit bio quản lạnh có khả năng thẳm thấu qua màng tế 10: ethylene glycol (duge sử dụng phd bién nit), propylene glycol, acetamid, glycerol, raffinose, dimethylsulphoxide (DMSO) va 1,2 - propanediol (PrOH). + Ethylene glycol (EG): Phd bidn nhit va al due sr dung tong guy tinh thy nh hóa. Chất này ít ảnh hưởng bởi nhiệt trong cơ chế vận chuyển qua mang, de xuất hiện vào khoảng 380C. EG có độc tính thấp với phôi chuột, đặc biệt là phí Xhuch tấn nhanh, cân bằng nhanh chống với ế bào gua màng trong suốt và màng tẾ bào, Sam Xhi đông lạnh trừng và phi bằng phương pháp thủy tỉnh hóa bằng EG đã cổ sự mang tha binh thường trên động vật và người.
[TT + Dimethyl sulf0xide (DMSO): DMSO được phát hiện vào năm 1959 như là một chất bảo quân higu quả. Chất này xuyên qua màng dễ đăng hơn glycrol nhưng tính độc của ổ li ao hơn ở nhiệt độ cao. + Propylene glycol (PG): cingla mot chi ‘ong ty nhu glycerol, nhung nồng độ của 1 duge yéu cu thi ham rong chất đông lạnh, và độc om glycerol. 16 Chương -# Chất bảo quản lạnh không có khả năng thắm qua màng té bao: sucrose, trehalose, lueose và galaetose.
Các saeehaide khác nhau thường được sử dụng, bao gồm mono, di: và trisaccharides. Cac monosaccharide gdm fructose, glucose, va galactose, Cae disaccharide như suerose, wehalose vi lactose. Những suerose không thẩm cũng tỏ ra là một chất đệm thấm lọc để giảm bớt sốc thẩm thấu, giúp đẫy nước ra khỏi t bào. Người ta đã chứng minh được nồng độ suerose cao (1mol/ií) thực sự không gây độc cho phôi và trứng (Kuleshova và ces, 1999) (37], Trahelose đã được xem là chất bổ sung của chất bảo quin đông lạnh rắt có hiệu qua (Begin va cs.
Ca sucrose va trehalose ite ché ming té bào bị biển đổi bởi nhiệt độ, ôn định độ bên của enzymme và ming té bio, Trong mot sé trudng hop, trehalose còn là một chất bảo vệ tốt hơncả suerose. |LI] "Để đạt tỷ lệ đông lạnh cao, đôi hồi sử dụng chất bảo quản đông lạnh nông độ cao để làm giảm tỉnh thể đá, Kết quả là với nông độ cao có thể dẫn đến sắc thẩm thấu và gây độc hóa học. Hai cách để làm giảm độc tính đến mức thấp nhất ở nông độ cao: ì) Giảm bớt chất "báo quản đồng lạnh, (i) Tăng tốc độ làm lạnh và rã đồng. [54] “Trong thành phần môi trường thủy tính hóa hiện nay, người ta thường sử dụng ethylene glyeol và một chất bảo vệ đông lạnh khác cũng có khả năng thắm qua màng tế bào (hưởng là DMSO hoặc POH) kết hợp với sucrose.
Sự kết hợp này vừa bảo đảm được khả năng thắm thấu qua màng tế bào cao hơn so với khi chỉ sử dụng từng chất riêng lẻ, vừa giảm cđược độc tính của từng thành phần riêng lẻ tác động lên tế bào khi sử dụng chúng ở nồng độ cao. Dung dich dém và các đại phân từ Dung dich chất bảo quản chứa nhiễu hợp chất khác nhau có tác dụng bảo vệ tế bào trong suốt quá trình đồng lạnh và rã đông. Chẳng hạn như những hợp chất gồm citrate, noãn hoàng trừng, Dung dich bảo quản đông lạnh thường được ” Chương tạo bằng cách thêm vào một lượng các hợp chất làm thành dung dịch sinh lý giống với môi trường cấy giao từ và phôi. + Dung dich dm Dung địch thủy tỉnh hóa là dung địch chất bảo quản dông lạnh mà không bị đông đá khi làm lạnh đến nhiệt độ rất thấp với ốc độ làm lạnh cao.
Vì vậy môi trường đệm cơ bản sử cdụng cho thủy tình hóa là đệm muỗi photphat hay đệm HEPBS. -# Các đại phân tử. Các hợp chất đại phân từ được thêm vào dung dịch chất bảo guản đông lạnh polyeinylpirrolidone (PVP) nhưng không thành công trong trong đông lanh phôi và gây độc cao đối với phôi (Wilmat và Rowson, 1973). Polyethylene giycol (PEG) cũng được sử dụng như chất bổ sung (Rall va Fahy, 1985), hydroxyethyl starch (HES), EieolL.
Ngoài ra, còn có các protein lớn gồm aIbumin huyết thanh bồ - Bovine Serum Albumin (BSA) hay huyết thanh bò mang thai -Fetal Bovine Serum (FBS). Một loại ít phổ biển khác là các protein giảm nhiệt “Thermal Hysteresis Proteins(THP). |55, 66, 86] “Trong tự nhiên những tế bào chứa hàm lượng protein cao sẽ hữu ích trong quá trình thủy tỉnh hóa. Thủy tỉnh hóa ngoại bào cần nông độ chất bảo quản cao hơn nội bào.
Việc thêm polymer có phân tử khối lớn: PVP, polyethylene glycol (PEG) hoặc Eicoll có khả năng diy mạnh thủy tỉnh hóa ngoại bào với nông độ chất bảo quản đông lanh giỗng như thủy tỉnh "hóa nội bảo. Hơn nữa, các polymer có thể tạo rã chất nền nhớt trong trứng (viscous matrix), ngăn cản sự hình thành tỉnh thể đá trong suốt quả trình đông lạnh và rã đông.Vì th, các đại phân từ hoạt động như chất thay thể ngoại bảo để làm tăng chất bảo quản đông lạnh bên ngoài, từ đó lâm giảm độc cho tế bào. Các âu ổ ảnh hướng dẫn chất lượng trúng sau Khi bo quản bằng phương pháp thủy tỉnh hóa. “Quá trình đông lạnh gây ra nhiễu tổn thương trong cu trúc và chúc năng của trứng “Trong đó, ôn thương lạnh và độc ính của các chất bảo quản là những bắt lợi chính quyết định đến sự bảo quản rồng thành công, Do đồ, để ống sau đông lạnh, rồng phải tri qua một chuỗi có và giãn nỡ thể tích.