Tổng quan luận án

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS), thường gọi là bệnh lợn tai xanh, là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do virus PRRS gây ra, gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn toàn cầu và tại Việt Nam. Tại Mỹ, thiệt hại do PRRS ước tính khoảng 664 triệu USD mỗi năm (Holtkamp et al., 2013). Ở Việt Nam, virus PRRS thể độc lực cao xuất hiện từ năm 2007 và lây lan diện rộng với chu kỳ bùng phát 2–3 năm một lần; riêng giai đoạn từ tháng 4/2016 đến tháng 11/2016 đã ghi nhận 14 ổ dịch tại 8 huyện thuộc 4 tỉnh (Quảng Trị, Hậu Giang, Nghệ An, Hà Tĩnh) làm 3.433 con lợn mắc bệnh và 1.242 con bị tiêu hủy (Cục Thú y, 2016).

Hiện nay, các loại vaccine phòng PRRS chủ yếu là vaccine vô hoạt và vaccine sống nhược độc. Vaccine vô hoạt an toàn nhưng hiệu lực bảo hộ thấp, trong khi vaccine nhược độc tiềm ẩn nguy cơ đột biến phục hồi độc lực hoặc tái tổ hợp di truyền với các chủng virus thực địa. Do đó, nhu cầu phát triển vaccine thế hệ mới, cụ thể là vaccine tiểu đơn vị dựa trên các kháng nguyên cấu trúc chính như GP5 và M, là vấn đề cấp thiết. Hệ thống biểu hiện gen tạm thời ở thực vật thông qua phương pháp thẩm lọc nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang lại nhiều ưu điểm: thời gian tạo sinh khối nhanh (trong vòng 1 tuần), mức độ tích lũy protein cao, không bị ảnh hưởng bởi vị trí chèn gen trong hệ gen thực vật và an toàn sinh học.

Luận án tiến sĩ sinh học chuyên ngành Hóa sinh học (Mã số: 94 20 116) của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Hằng, thực hiện năm 2018 tại Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Chu Hoàng Hà và TS. Nguyễn Trung Nam, mang tên: "Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium".

Mục tiêu nghiên cứu

  1. Mục tiêu chung: Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM của chủng virus PRRS đang gây bệnh lợn tai xanh ở Việt Nam bằng công nghệ biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá phục vụ cho định hướng phát triển vaccine thế hệ mới.
  2. Mục tiêu cụ thể:
    • Thiết kế được 3 cấu trúc vector chuyển gen mang gen m, gp5optimize (gp5opt) và gp5ecto-m của chủng virus PRRS thể độc lực cao dưới sự điều khiển biểu hiện bởi promoter CaMV 35S.
    • Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá 3 loại kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM của chủng PRRSV thể độc lực cao trong lá cây thuốc lá và tinh sạch được các kháng nguyên tái tổ hợp này từ mô lá.
    • Đánh giá được tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM trên động vật thí nghiệm (chuột và lợn).

Nội dung nghiên cứu

  • Nội dung 1: Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang các gen m, gp5opt và gp5ecto-m mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP và tạo chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector tương ứng.
  • Nội dung 2: Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen m, gp5opt và gp5ecto-m ở lá cây thuốc lá Nicotiana benthamiana. Biểu hiện tạm thời và tinh sạch các kháng nguyên tái tổ hợp.
  • Nội dung 3: Đánh giá tính sinh miễn dịch dịch thể của kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Các đoạn gen mã hóa protein cấu trúc M, GP5 và vùng ngoại bào dung hợp GP5ectoM của chủng virus PRRS thể độc lực cao lưu hành tại Việt Nam; hệ thống vector chuyển gen pRTRA và pCB301; chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens; thực vật chủ Nicotiana benthamiana; động vật thí nghiệm gồm chuột và lợn.
  • Không gian thực hiện: Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Thử nghiệm sinh học thuộc Viện Công nghệ sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương.
  • Thời gian hoàn thành: Luận án bảo vệ năm 2018.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến virus PRRS, cấu trúc kháng nguyên và các nền tảng công nghệ sản xuất vaccine:

  • Dịch tễ và đặc điểm virus PRRS: PRRSV được phát hiện đầu tiên tại Mỹ năm 1987 (Rossow, 1998; Collins et al., 1992) và Canada (Dea et al., 1992a, 1992b). Virus thuộc chi Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales, chia làm hai kiểu gen: type I (châu Âu, đại diện là chủng Lelystad LV) và type II (Bắc Mỹ, đại diện là chủng VR2332) (Snijder & Meulenberg, 1998; Nielsen et al., 2003). Năm 2006, chủng PRRSV thể độc lực cao (HP-PRRSV) bùng phát tại Trung Quốc với đặc điểm mất đoạn 30 axit amin trong protein phi cấu trúc NSP2 (Tian et al., 2007). Tại Việt Nam, dịch xuất hiện từ năm 2007 (Tô Long Thành, 2007; Feng et al., 2008), các phân tích phả hệ cho thấy các chủng lưu hành thuộc dòng Bắc Mỹ type II, tương đồng 99% nucleotide với chủng độc lực cao Trung Quốc (Metwally et al., 2010; Nguyen et al., 2012; Lê Thanh Hòa et al., 2008).
  • Kháng nguyên GP5 và M: Protein GP5 (24–25 kDa, mã hóa bởi ORF5) là glycoprotein vỏ chính, chứa epitope trung hòa tại vị trí axit amin 37–45 (đối với type II) nhưng bị cản trở bởi vị trí glycosyl hóa lân cận (N44, N51) và epitope đánh lạc hướng (aa 27–31) (Oleksiewicz et al., 2002; Ansari et al., 2006; Thaa et al., 2013). Protein M (18–19 kDa, ORF6) là protein màng bảo thủ cao, tương tác với GP5 qua cầu nối disulfide ở vùng ngoại bào tạo heterodimer bản chất cần thiết cho quá trình lắp ráp hạt virus (Wieringa et al., 2003, 2004; Wissink et al., 2005). Kháng thể kháng GP5 và M có hoạt tính trung hòa virus (Yang et al., 2007; Bastos et al., 2004; Trible et al., 2011).
  • Các hệ thống sản xuất vaccine PRRS: Các nghiên cứu trước đây đã thử nghiệm biểu hiện GP5 và M trên E. coli (Wang et al., 2016), nấm men (Zhao et al., 2014), baculovirus trên tế bào côn trùng (Plana Duran et al., 1997; Binjawadagi et al., 2016), adenovirus và poxvirus tái tổ hợp (Jiang et al., 2006a, 2008; Shen et al., 2007; Zheng et al., 2007), cũng như vaccine DNA (Chia et al., 2010; Li et al., 2009). Ở thực vật, chuyển gen ổn định trên chuối, khoai tây, Arabidopsis và thuốc lá đã được thực hiện (Chan et al., 2013; Chen et al., 2013; Piron et al., 2014), nhưng hàm lượng protein tích lũy thấp (0,011% – 0,65% protein hòa tan tổng số - TSP) và thời gian tạo dòng kéo dài.
  • Biểu hiện tạm thời bằng thẩm lọc Agrobacterium: Phương pháp thẩm lọc nhờ A. tumefaciens (agroinfiltration) đưa T-DNA vào khoảng gian bào mô lá mà không tích hợp cố định vào hệ gen, cho phép thu nhận lượng lớn protein chỉ sau 2–5 ngày (Kapila et al., 1997; Voinnet et al., 2003; Rivera et al., 2012). Việc dung hợp với Elastin-like polypeptide (ELP) giúp tăng cường tích lũy protein và hỗ trợ tinh sạch không dùng sắc ký thông qua chu trình chuyển pha nghịch đảo qua màng (mITC) (Scheller et al., 2001; Floss và Conrad, 2012).

Khoảng trống nghiên cứu: Trước thời điểm luận án, tại Việt Nam chưa có công trình nào nghiên cứu tổng thể từ thiết kế vector, tối ưu hóa điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hóa các kháng nguyên M, GP5 và dung hợp GP5ectoM của chủng PRRSV độc lực cao nội địa trong cây thuốc lá N. benthamiana, đến tinh sạch protein tái tổ hợp bằng mITC và kiểm chứng đáp ứng miễn dịch dịch thể trên mô hình động vật thực tế (lợn và chuột).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết

  • Mô hình tương tác kháng nguyên PRRSV: GP5 và M tạo liên kết heterodimer qua cầu nối disulfide ở đầu N. Vùng ngoại bào của GP5 (GP5ecto, chứa epitope trung hòa chính B) khi gắn cộng hóa trị với protein M tạo thành cấu trúc tái tổ hợp GP5ectoM mô phỏng liên kết tự nhiên, khắc phục tính kỵ nước của các vùng xuyên màng trên GP5 hoàn chỉnh, giúp protein dễ biểu hiện và tăng cường kích thích miễn dịch dịch thể.
  • Biểu hiện tạm thời qua promoter CaMV 35S và ức chế câm gen: Promoter 35S từ virus khảm súp lơ (CaMV) đảm bảo phiên mã mạnh liên tục. Để đối phó với hiện tượng câm gen sau phiên mã (PTGS) ở thực vật, các vector hỗ trợ mang gen mã hóa protein ức chế câm gen (protein 2b của CMV hoặc HC-Pro của PVY) được đồng thẩm lọc cùng vector biểu hiện chính.
  • Dung hợp ELP và tinh sạch bằng mITC: Cấu trúc kháng nguyên được gắn thêm đuôi tinh sạch Histag, Cmyc và đoạn lặp 100xELP. ELP có tính chất chuyển pha thuận nghịch theo nhiệt độ và nồng độ muối; khi kết hợp với màng lọc và chất kết tủa PEG 8000 (phương pháp mITC), protein dung hợp ELP kết tụ lại và giữ trên màng ở nhiệt độ cao, sau đó tái hòa tan ở nhiệt độ thấp để thu hồi protein đích sạch.
+-----------------------------------------------------------------------------------------+
| Cấu trúc Cassette biểu hiện trong vector pCB301:                                        |
| [Promoter CaMV 35S] -- [Gen đích: m / gp5opt / gp5ecto-m] -- [Histag] -- [Cmyc]         |
|                     -- [100xELP] -- [Terminator 35S/Nos]                                |
+-----------------------------------------------------------------------------------------+

Phương pháp nghiên cứu

  1. Thiết kế vector chuyển gen:
    • Nhân dòng các đoạn gen m, gp5opt (đã tối ưu hóa codon cho thực vật) và đoạn nối gp5ecto-m.
    • Ghép nối các đoạn gen vào vector tách dòng pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP.
    • Cắt chuyển toàn bộ cassette biểu hiện sang vector nhị phân pCB301 phục vụ chuyển gen vào thực vật. Biến nạp vector vào chủng Agrobacterium tumefaciens và kiểm tra bằng Colony-PCR.
  2. Kỹ thuật thẩm lọc và tối ưu hóa điều kiện biểu hiện trên Nicotiana benthamiana:
    • Thẩm lọc bằng phương pháp tiêm qua vết xước biểu bì hoặc thẩm lọc chân không (lá được ngập trong dịch huyền phù vi khuẩn trong buồng hút chân không).
    • Khảo sát các thông số: vector hỗ trợ (pBI-35S-2bCMV so với pIBT-35S-HC-Pro PVY), nồng độ chất cảm ứng Acetosyringone (AS), mật độ tế bào vi khuẩn ($OD_{600}$), tuổi sinh lý của lá trên cây và tuổi của cây thuốc lá.
  3. Phân tích hóa sinh và tinh sạch protein:
    • Tách chiết protein hòa tan tổng số (TSP).
    • Điện di SDS-PAGE và phân tích lai Western blot sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng Cmyc; định lượng mức độ biểu hiện dựa trên đường chuẩn protein H5-pII.
    • Tinh sạch protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP bằng chu trình mITC kết hợp tối ưu hóa nồng độ PEG 8000.
  4. Đánh giá tính sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm:
    • Thí nghiệm trên chuột: Tiêm phúc mạc các kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP tinh sạch (kèm đối chứng); thu huyết thanh để xác định kháng thể IgG đặc hiệu bằng ELISA và Western blot.
    • Thí nghiệm trên lợn: Tiêm bắp các kháng nguyên tái tổ hợp GP5-ELP, GP5ectoM-ELP (kèm đối chứng âm dịch chiết cây không chuyển gen WT và đối chứng dương vaccine nhược độc); phân tích đáp ứng IgG đặc hiệu bằng ELISA, Western blot và xác định hiệu giá kháng thể bằng xét nghiệm miễn dịch đơn lớp (IPMA - Immunoperoxidase monolayer assay).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết toàn diện lịch sử phát hiện, dịch tễ học của PRRS trên thế giới và tại Việt Nam. Tác giả trình bày chi tiết số liệu thống kê dịch bệnh giai đoạn 2015–2016 theo Cục Thú y, phân loại hai type virus, đặc tính giải phẫu bệnh tích học (viêm phổi hoại tử, phế nang nhăn, đại thực bào bị phá hủy, xuất huyết đa cơ quan).

Chỉ tiêu so sánh tình hình dịch PRRS Năm 2015 Năm 2016
Số xã có dịch 19 14
Số huyện có dịch 11 08
Số tỉnh có dịch 06 04
Số gia súc mắc bệnh (con) 1.488 3.433
Số gia súc bị tiêu hủy (con) 1.488 1.242

Chương 1 đi sâu phân tích hệ gen PRRSV gồm 9 ORF, chức năng của 14 protein phi cấu trúc (NSP1–12) và các protein cấu trúc (GP2a, GP2b, GP3, GP4, GP5, M, N). Đồng thời, tác giả đánh giá chi tiết cơ chế miễn dịch của vật chủ, các hạn chế kỹ thuật của vaccine nhược độc (nguy cơ phục hồi độc lực, đào thải virus qua tinh dịch, an toàn kém trên lợn nái mang thai) và vaccine vô hoạt (không kích thích đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, hiệu lực bảo hộ thấp). Cuối cùng, chương luận giải ưu thế của công nghệ biểu hiện tạm thời ở thực vật nhờ A. tumefaciens, vai trò của promoter CaMV 35S và cơ sở ứng dụng cây thuốc lá N. benthamiana.

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc chủng vi khuẩn, các cặp mồi chuyên biệt dùng để nhân dòng và giải trình tự gen m, gp5opt, gp5ecto-m (Bảng 2.2). Tác giả thiết lập quy trình phản ứng ghép nối các đoạn gen vào vector pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP và vector nhị phân pCB301 (Bảng 2.3 và 2.4). Chương này trình bày chi tiết sơ đồ gây miễn dịch trên chuột (Hình 2.2) và trên lợn (Hình 2.3), các bước thẩm lọc hút chân không (Hình 2.1), phương pháp tách chiết TSP, SDS-PAGE, Western blot với protein chuẩn H5-pII, quy trình tinh sạch qua màng mITC và các kỹ thuật đo lường miễn dịch học (ELISA, IPMA).

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

  1. Thiết kế vector và tạo chủng vi khuẩn:
    • Xây dựng thành công 3 vector chuyển gen nhị phân: pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP, pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP, và pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP. Biến nạp và xác nhận chủng A. tumefaciens mang vector bằng Colony-PCR.
  2. Tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện tạm thời:
    • Vector hỗ trợ: Đồng thẩm lọc với vector mang gen ức chế câm gen pBI-35S-2bCMV hoặc pIBT-35S-HC-Pro PVY làm tăng rõ rệt mức độ tích lũy protein tái tổ hợp so với không dùng vector hỗ trợ.
    • Nồng độ Acetosyringone (AS), mật độ vi khuẩn ($OD_{600}$), tuổi lá và tuổi cây: Xác định được các ngưỡng tối ưu tương ứng để đạt hàm lượng biểu hiện protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP cao nhất trong lá N. benthamiana.
    • So sánh mức độ biểu hiện: Đánh giá mức độ biểu hiện tạm thời của 3 protein tái tổ hợp trong điều kiện tối ưu thông qua lai miễn dịch dựa trên protein chuẩn H5-pII (Bảng 3.1).
  3. Tinh sạch protein tái tổ hợp:
    • Xác định được nồng độ PEG 8000 thích hợp nhất cho từng loại protein trong chu trình mITC (Hình 3.19, 3.20, 3.21).
    • Đánh giá độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi của M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP sau khi mITC bằng SDS-PAGE nhuộm Coomassie blue và lai miễn dịch (Bảng 3.2).
  4. Tính sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm:
    • Trên chuột: Cả 3 kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP đều kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV, phát hiện rõ qua ELISA và Western blot.
    • Trên lợn: Kháng nguyên GP5-ELP và GP5ectoM-ELP kích thích cơ thể lợn sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV; hiệu giá kháng thể được xác nhận qua phản ứng ELISA, Western blot và xét nghiệm IPMA trên tế bào đơn lớp (Hình 3.35–3.40).

Chương 4. Bàn luận kết quả nghiên cứu

Chương bàn luận phân tích cơ chế và hiệu quả của hệ thống biểu hiện tạm thời nhờ Agrobacterium. Tác giả luận giải việc dung hợp ELP không chỉ nâng cao tính ổn định và mức tích lũy protein trong mô lá mà còn tạo điều kiện tinh sạch đơn giản bằng mITC, không phụ thuộc vào hệ thống sắc ký phức tạp. Bàn luận tập trung làm rõ tính ưu việt của cấu trúc dung hợp GP5ectoM: việc kết hợp vùng ngoại bào GP5ecto (chứa epitope trung hòa) với protein màng M giúp tái tạo liên kết dimer tự nhiên của virus, nhờ đó kháng nguyên GP5ectoM-ELP kích thích đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu cao hơn và đồng đều hơn so với các kháng nguyên đơn lẻ M-ELP hoặc GP5-ELP trên mô hình động vật thí nghiệm.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

  1. Tính tổng thể và hệ thống: Luận án là công trình nghiên cứu thành công đầu tiên tại Việt Nam thực hiện trọn vẹn quy trình từ thiết kế vector chuyển gen thực vật, biểu hiện tạm thời các gen m, gp5opt, gp5ecto-m mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP của chủng virus PRRS thể độc lực cao đang lưu hành tại Việt Nam trong lá cây thuốc lá Nicotiana benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium.
  2. Bằng chứng về tính sinh miễn dịch: Đã chứng minh thực nghiệm cả 3 loại protein tái tổ hợp M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP sản xuất từ thực vật đều có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể, sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng virus PRRS trên chuột và lợn.
  3. Xác định ứng viên vaccine tiềm năng: Kháng nguyên dung hợp GP5ectoM-ELP có khả năng kích thích đáp ứng kháng thể đặc hiệu vượt trội so với việc sử dụng từng kháng nguyên đơn lẻ M-ELP hoặc GP5-ELP. Luận án đã xác lập hai kháng nguyên GP5ectoM-ELP và GP5-ELP là những ứng viên triển vọng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng chống PRRSV độc lực cao tại Việt Nam.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Sử dụng các cấu trúc vector chuyển gen (pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP, pCB301 35S-gp5ecto-m-Histag-Cmyc-100xELP) và các chủng vi khuẩn A. tumefaciens tương ứng đã tạo ra để tiếp tục phục vụ các nghiên cứu phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng bệnh lợn tai xanh.
  • Ứng dụng quy trình biểu hiện gen tạm thời và tinh sạch mITC đã được tối ưu hóa để sản xuất sinh khối kháng nguyên tái tổ hợp GP5-ELP, GP5ectoM-ELP hoặc mở rộng cho các protein tái tổ hợp y dược học khác trên hệ thống thực vật.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Nghiên cứu mới dừng lại ở việc đánh giá tính sinh miễn dịch dịch thể (nồng độ và hiệu giá kháng thể IgG đặc hiệu qua ELISA, Western blot, IPMA) trên động vật thí nghiệm; chưa thực hiện được thử nghiệm thử thách công cường độc (challenge test) với virus PRRS sống trên đàn lợn để kiểm chứng tỷ lệ bảo hộ sống sót thực tế.
  • Quá trình biểu hiện tạm thời và tinh sạch kháng nguyên mới được tiến hành ở quy mô phòng thí nghiệm trên lá cây thuốc lá N. benthamiana, chưa mở rộng sang quy mô bán công nghiệp.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Tiến hành thử nghiệm thử thách bảo hộ trực tiếp bằng chủng PRRSV cường độc trên lợn đã được tiêm phòng kháng nguyên tái tổ hợp GP5ectoM-ELP và GP5-ELP nhằm xác định hiệu lực bảo hộ lâm sàng và khả năng giảm tải lượng virus trong máu/mô.
  • Tối ưu hóa công thức phối trộn tá dược miễn dịch phù hợp cho kháng nguyên nguồn gốc thực vật để kéo dài thời gian tồn lưu miễn dịch.
  • Mở rộng quy mô nuôi trồng và thẩm lọc chân không trên diện tích lớn để nâng cao sản lượng thu hồi kháng nguyên.

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo chuyên môn đối với các nhóm đối tượng và lĩnh vực sau:

  • Nghiên cứu sinh, học viên và giảng viên: Chuyên ngành Hóa sinh học, Công nghệ sinh học, Di truyền học và Thú y học; cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp thiết kế cassette dung hợp ELP, kỹ thuật chuyển gen tạm thời vào thực vật và các phương pháp phân tích miễn dịch chuyên sâu (IPMA, Western blot định lượng).
  • Các nhà nghiên cứu công nghệ protein tái tổ hợp (Molecular Farming): Cung cấp các thông số kỹ thuật tối ưu chi tiết về nồng độ chất cảm ứng Acetosyringone, mật độ vi khuẩn $OD_{600}$, việc sử dụng vector hỗ trợ chống câm gen (pBI-35S-2bCMV, pIBT-35S-HC-Pro PVY), cũng như kỹ thuật tinh sạch mITC sử dụng PEG 8000 không cần dùng cột sắc ký ái lực tốn kém.
  • Các đơn vị nghiên cứu và sản xuất vaccine thú y: Cung cấp dữ liệu tiền lâm sàng quan trọng và định hướng thiết kế kháng nguyên dung hợp GP5ectoM phục vụ phát triển các dòng vaccine thế hệ mới phòng chống chủng PRRSV độc lực cao tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao luận án lựa chọn vùng ngoại bào GP5ecto dung hợp với protein M thay vì sử dụng toàn bộ phân tử GP5?

Phân tử GP5 hoàn chỉnh chứa các vùng xuyên màng kỵ nước mạnh (axit amin 64–129), gây khó khăn lớn cho việc biểu hiện và cuộn gập protein trong nhiều hệ thống tế bào (như E. coli). Vùng ngoại bào GP5ecto (aa 33–63) chứa epitope trung hòa chính của virus. Khi dung hợp GP5ecto với protein M (GP5ectoM), cấu trúc tái tổ hợp vừa loại bỏ được các đoạn kỵ nước cản trở biểu hiện, vừa mô phỏng lại liên kết heterodimer tự nhiên giữa GP5 và M qua cầu nối disulfide, giúp kháng nguyên ổn định và tăng cường khả năng kích thích miễn dịch dịch thể.

2. Vai trò của việc dung hợp đoạn polypeptide 100xELP vào cấu trúc kháng nguyên là gì?

Đoạn lặp Elastin-like polypeptide (ELP) giúp tăng cường mức độ tích lũy protein tái tổ hợp trong tế bào lá thuốc lá. Đồng thời, ELP cho phép tinh sạch kháng nguyên nhanh chóng và hiệu quả thông qua chu trình chuyển pha nghịch đảo qua màng (mITC) kết hợp với chất làm kết tủa PEG 8000, giúp tách protein đích ra khỏi dịch chiết thô thực vật mà không cần sử dụng hệ thống cột sắc ký đắt tiền.

3. Những yếu tố nào đã được tối ưu hóa để đạt hiệu suất biểu hiện tạm thời cao nhất trong lá cây thuốc lá?

Luận án đã tối ưu hóa 5 yếu tố công nghệ chính: (1) Đồng thẩm lọc với vector hỗ trợ mang gen ức chế câm gen (pBI-35S-2bCMV hoặc pIBT-35S-HC-Pro PVY); (2) Nồng độ chất cảm ứng Acetosyringone (AS); (3) Mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens ($OD_{600}$); (4) Tuổi sinh lý của lá trên cây thuốc lá; và (5) Độ tuổi sinh trưởng của cây thuốc lá Nicotiana benthamiana.

4. Kết quả đáp ứng miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm thể hiện như thế nào?

Thử nghiệm trên chuột cho thấy cả 3 kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP đều kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV được phát hiện qua ELISA và Western blot. Trên mô hình lợn thí nghiệm, kháng nguyên dung hợp GP5ectoM-ELP kích thích tạo đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu mạnh hơn và đồng đều hơn so với các kháng nguyên riêng lẻ, được xác nhận qua ELISA, Western blot và xét nghiệm miễn dịch đơn lớp IPMA.

Kết luận

Luận án của NCS. Nguyễn Thị Minh Hằng đã giải quyết thành công mục tiêu nghiên cứu biểu hiện tạm thời các kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM của virus PRRS thể độc lực cao trong lá cây thuốc lá Nicotiana benthamiana nhờ Agrobacterium tumefaciens. Công trình đã tối ưu hóa các thông số kỹ thuật biểu hiện, thiết lập quy trình tinh sạch kháng nguyên qua màng mITC nhờ dung hợp ELP và chứng minh được tính sinh miễn dịch dịch thể của các protein tái tổ hợp trên chuột và lợn. Kết quả nghiên cứu xác lập hai ứng viên tiềm năng GP5ectoM-ELP và GP5-ELP, cung cấp nền tảng khoa học và thực tiễn vững chắc cho định hướng phát triển vaccine tiểu đơn vị phòng bệnh lợn tai xanh tại Việt Nam.