Luận văn thạc sĩ hay nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong bacillus subtilis ứng dụng trong công nghiệp xử lý vải bông

Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong Bacillus subtilis, ứng dụng trong công nghiệp xử lý vải bông, mang lại giải pháp hiệu quả.

• Tác giả: Lê Trọng Tài
• Người hướng dẫn: Ts. Lê Văn Trường
• Trường học: Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật
• Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong Bacillus subtilis nhằm ứng dụng trong công nghiệp xử lý vải bông
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis
• 1.2. Hệ biểu hiện Bacillus subtilis
• 1.3. Khái niệm pectinase
• 1.4. Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase
• 1.5. Pectinase của Bacillus subtilis
• 1.6. Ứng dụng của pectinase kiềm
• 1.7. Cấu tạo sợi bông tự nhiên
• 1.8. Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông
• 1.9. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy
• 1.10. Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến cà phê và trà
• 1.11. Tình hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Các chủng vi khuẩn
• 2.2. Hóa chất thí nghiệm
• 2.3. Các vector sử dụng
• 2.4. Trình tự mồi
• 2.5. Môi trường nuôi cấy
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa
• 2.6.2. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B. subtilis tự nhiên
• 2.6.3. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp
• 2.6.4. Định lượng protein theo phương pháp Bradford
• 2.6.5. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)
• 2.6.6. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi
• 2.6.7. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B.
• 2.6.8. Tách chiết DNA plasmid từ E.
• 2.6.9. Tách chiết DNA plasmid từ B.
• 2.6.10. Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử
• 2.6.11. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp xung điện
• 2.6.12. Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B.
• 2.6.13. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009)
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis phân lập từ trong nước có hoạt tính pectinase cao
• 3.2. Sàng lọc chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch
• 3.3. Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại bào của các chủng nghiên cứu
• 3.4. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi
• 3.5. Tách dòng gen pectinase trong E.
• 3.6. Tách chiết DNA tổng số của các chủng B.
• 3.7. Nhân gen pectinase bằng PCR
• 3.8. Tách dòng các gen pel vào E.
• 3.9. Giải trình tự các gen pectinase subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase
• 3.10. Thiết kế vector biểu hiện gen pectinase trong B.
• 3.11. Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B.
• 3.12. Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng
• 3.13. So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh ra từ chủng tự nhiên
• 3.14. So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên
• 3.15. So sánh ảnh hưởng của pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu biểu hiện gen pectinase trong Bacillus subtilis

Nghiên cứu biểu hiện gen pectinase trong Bacillus subtilis đang thu hút sự chú ý lớn trong ngành công nghiệp xử lý vải bông. Pectinase là enzyme quan trọng giúp phân hủy pectin, một thành phần chính trong cấu trúc sợi bông. Việc ứng dụng enzyme này không chỉ nâng cao chất lượng vải mà còn giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Bacillus subtilis là một trong những vi khuẩn có khả năng sản xuất pectinase hiệu quả, mở ra nhiều cơ hội cho ngành công nghiệp dệt may.

1.1. Khái niệm về pectinase và vai trò trong công nghiệp

Pectinase là enzyme xúc tác phân cắt pectin, giúp cải thiện khả năng thấm nước của vải bông. Enzyme này có vai trò quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp như thực phẩm, dệt may và xử lý rác thải.

1.2. Bacillus subtilis và khả năng sản xuất pectinase

Bacillus subtilis là vi khuẩn gram dương, có khả năng sản xuất pectinase kiềm. Vi khuẩn này được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp nhờ vào khả năng sinh trưởng mạnh mẽ và môi trường nuôi cấy đơn giản.

II. Vấn đề trong công nghiệp xử lý vải bông hiện nay

Ngành công nghiệp dệt may Việt Nam đang đối mặt với nhiều thách thức, đặc biệt là trong việc xử lý vải bông. Việc sử dụng hóa chất kiềm để loại bỏ tạp chất không chỉ làm giảm chất lượng vải mà còn gây ô nhiễm môi trường. Do đó, cần tìm kiếm giải pháp thay thế hiệu quả hơn.

2.1. Tác động của hóa chất kiềm đến chất lượng vải

Hóa chất kiềm có thể làm giảm độ bền của sợi bông, gây ra tình trạng vải yếu và dễ hư hỏng. Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng sản phẩm cuối cùng.

2.2. Ô nhiễm môi trường từ quy trình xử lý truyền thống

Quy trình xử lý vải bông truyền thống thải ra nhiều chất độc hại, gây ô nhiễm nguồn nước và không khí. Việc chuyển sang sử dụng enzyme pectinase là một giải pháp bền vững hơn.

III. Phương pháp nghiên cứu biểu hiện gen pectinase trong Bacillus subtilis

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để tách dòng và biểu hiện gen mã hóa pectinase trong Bacillus subtilis. Các bước bao gồm tách chiết DNA, nhân gen bằng PCR và chuyển gen vào vi khuẩn chủ.

3.1. Tách chiết và nhân gen pectinase

Quy trình tách chiết DNA từ Bacillus subtilis được thực hiện để thu nhận gen pectinase. Sau đó, gen này được nhân lên bằng phương pháp PCR để tạo ra số lượng lớn cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2. Chuyển gen vào Bacillus subtilis

Gen pectinase được chuyển vào Bacillus subtilis thông qua phương pháp điện chuyển. Điều này giúp tạo ra các chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng sản xuất enzyme pectinase cao.

IV. Ứng dụng thực tiễn của pectinase trong công nghiệp xử lý vải bông

Việc ứng dụng enzyme pectinase trong công nghiệp xử lý vải bông đã cho thấy nhiều lợi ích. Enzyme này giúp cải thiện khả năng thấm nước, làm cho vải mềm mại và dễ nhuộm hơn. Điều này không chỉ nâng cao chất lượng sản phẩm mà còn tiết kiệm thời gian và năng lượng trong quy trình sản xuất.

4.1. Cải thiện chất lượng vải bông

Sử dụng pectinase giúp loại bỏ tạp chất hiệu quả, làm cho vải bông trở nên mềm mại và có độ bền cao hơn. Điều này tạo ra sản phẩm có giá trị hơn trên thị trường.

4.2. Giảm thiểu ô nhiễm môi trường

Việc thay thế hóa chất kiềm bằng enzyme pectinase không chỉ bảo vệ môi trường mà còn giảm thiểu chi phí xử lý. Điều này giúp ngành công nghiệp dệt may phát triển bền vững hơn.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu biểu hiện gen pectinase trong Bacillus subtilis mở ra nhiều cơ hội cho ngành công nghiệp xử lý vải bông. Việc ứng dụng enzyme này không chỉ nâng cao chất lượng sản phẩm mà còn bảo vệ môi trường. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giải pháp bền vững cho ngành dệt may.

5.1. Tương lai của enzyme pectinase trong công nghiệp

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, enzyme pectinase sẽ ngày càng được ứng dụng rộng rãi hơn trong nhiều lĩnh vực, không chỉ riêng ngành dệt may.

5.2. Khuyến khích nghiên cứu và phát triển

Cần khuyến khích các nghiên cứu tiếp theo về enzyme pectinase để tối ưu hóa quy trình sản xuất và ứng dụng, từ đó nâng cao hiệu quả và giảm thiểu tác động đến môi trường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ TRỌNG TÀI NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CAO GEN MÃ HÓA PECTINASE TRONG Bacillus subtilis NHẰM Ƣ́NG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP XƢ̉ LÝ VẢI BÔNG Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN TRƢỜNG Hà Nội - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Lê Trọng Tài Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.

Lê Văn Trường, là người thầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (nay là Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật) đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận văn. Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn - những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Tác giả Lê Trọng Tài Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT. v DANH MỤC BẢNG. vi DANH MỤC HÌNH. 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

Sơ lƣợc về Bacillus subtilis. Hệ biểu hiện Bacillus subtilis. Khái niệm pectinase. Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase.

Pectinase của Bacillus subtilis. Ứng dụng của pectinase kiềm. Cấu tạo sợi bông tự nhiên. Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông.

Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy. Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến cà phê và trà. Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam. 13 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP.

Các chủng vi khuẩn. Hóa chất thí nghiệm. Các vector sử dụng. Trình tự mồi.

Môi trƣờng nuôi cấy. Phƣơng pháp nghiên cứu. Sàng lọc các chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa.

Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B. subtilis tự nhiên. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp. Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11].

Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)[10]. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi. 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B.

Tách chiết DNA plasmid từ E. Tách chiết DNA plasmid từ B. Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử. Biến nạp plasmid vào E.

coli bằng phương pháp xung điện. Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009). 27 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

Sàng lọc các chủng B. subtilis phân lập từ trong nƣớc có hoạt tính pectinase cao. Sàng lọc chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch.

Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại bào của các chủng nghiên cứu. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi. Tách dòng gen pectinase trong E. Tách chiết DNA tổng số của các chủng B.

Nhân gen pectinase bằng PCR. Tách dòng các gen pel vào E. Giải trình tự các gen pectinase. subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase.

Thiết kế vector biểu hiện gen pectinase trong B. Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B. Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng. So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh ra từ chủng tự nhiên.

So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên. So sánh ảnh hưởng của pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên. 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI. 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

50 Tài liệu tiếng Việt. 50 Tài liệu tiếng Anh. 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT a.a : Amino acid APS : Ammonium persulfate B. subtilis : Bacillus subtilis BMM : Môi trƣờng khoáng chất Belisky BSA : Bovine serum albumin DEAE : Diethylethanolamine DNA : Deoxyribonucleic axit DNSA : 3,5-Dinitrosalicylic axit E.

coli : Escherichia coli EDTA : Ethylenediaminetetraacetic axit HTAB : Hecxadecyl trimethyl trimethyl trimethyl trimethyl ammonium bromide ISO : International standards organization kDa : Kilo Dalton LB : Luria bertani M : Mole OD : Optical density PCR : Polymerase chain reaction pel : Gen pectinase Pel : Enzyme pectinase RR : Rhuthenium red rPel : Pectinase tái tổ hợp SDS : Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED : Tetramethylethylenediamine U : Unit Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Phân loại các pectinolytic enzyme. Các thành phần cấu tạo sợi bông. Thành phần phản ứng nhân gen.

Chƣơng trình nhân gen bằng PCR. Thành phần phản ứng cắt pKTH/pUC bằng HindIII. Thành phần phản ứng cắt pJET/pel bằng HindIII. Thành phần phản ứng gắn gen pel với promoter.

Thành phần phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel. Kết quả sàng lọc các chủng B. subtilis có khả năng phân hủy pectin trên đĩa thạch. Hoạt tính pectinase ở điều kiện pH phản ứng tối ƣu của các chủng nghiên cứu.

Hoạt tính pectinase của các enzyme thu đƣợc. 31 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases.

Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase. Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase. Sự kết nối giữa cellulose và các chất không phải cellulose trong lớp thứ cấp của sợi bông. Pectin đƣợc tồn tại ở hai loại: pectin axit và esterified pectin.1 Đồ thị đƣờng chuẩn protein.

Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành 3 amino, 5-nitrosalicylic axit. Đƣờng chuẩn glucose. Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit của pectinase. Hình ảnh một số chủng B.

subtilis tạo vòng thủy phân pectin trên đĩa thạch LB 0,2% pectin. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng phân hủy pectin của các pectinase từ các chủng nghiên cứu. Điện di DNA tổng số của các chủng B. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pectinase.

Khuẩn lạc các thể biến nạp E. coli DH5α mang pJET/pel trên môi trƣờng chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicillin. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII.

So sánh theo hàng trình tự amino acid của Pel từ 4 chủng B. subtilis phân lập ở Việt Nam với Pel từ B. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pel trong B. Điện di sản phẩm cắt pKTH/pUC bằng HindIII.

Thu nhận pel từ pJET/pel. Sơ đồ nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. Nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. Kiểm tra gen dung hợp BaP-pel trong pMSE/BaP-pel.

Kiểm tra pMSE/BaP-pel trong tế bào B. subtilis 168 tái tổ hợp. Điện di SDS-PAGE dịch enzyme ngoại bào của chủng B. subtilis tái tổ hợp đa copy trên môi trƣờng LB+Kan.

Kiểm tra sự biểu hiện pectinase của các thể biến nạp đa copy trong tế bào B. subtilis 168 sau 24 giờ nuôi cấy. 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Kiểm tra hoạt tính pectinase của thể biến nạp đa copy BSM và chủng B.

subtilis 168 trên cơ chất pectin axit. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzyme. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt tính enzyme. 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỞ ĐẦU Ngành công nghiệp dệt may Việt Nam đang phát triển mạnh, chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc.

Nếu phát triển bông thực hiện đúng tiến độ theo Quyết định số 36/2008/QĐ-TTg của Thủ tƣớng Chính phủ thì đến năm 2015 sản xuất bông trong nƣớc là 40 ngàn tấn, đáp ứng đƣợc 10% nhu cầu và đến 2020 là 60 ngàn tấn đáp ứng đƣợc 12% nhu cầu bông xơ tiêu thụ trong nƣớc. Để “chiến lƣợc phát triển ngành công nghiệp Dệt may Việt Nam đến năm 2015, định hƣớng đến năm 2020” thành công thì ngoài việc thúc đẩy tăng năng xuất và diện tích trồng bông ra chúng ta cần phải cải tiến công nghệ, ứng dụng công nghệ enzyme trong quá trình sản xuất vải bông để tạo ra sản phẩm vải bông chất lƣợng cao, giá thành rẻ và có thể cạnh tranh đƣợc trên thị trƣờng quốc tế. Sợi bông tự nhiên đƣợc cấu tạo bao gồm 95% là cellulose và 5% là không phải cellulose. Vải bông mộc sau khi dệt còn chứa nhiều chất không phải cellulose.

Trong quá trình nhuộm vải, nếu không loại các chất không phải cellulose đi thì chúng sẽ làm cản trở thuốc nhuộm thâm nhập vào vải, dẫn đến giảm chất lƣợng của vải nhuộm. Thông thƣờng để loại bỏ các chất này, vải mộc phải qua bƣớc nấu kiềm (alkaline scouring) để tẩy loại chúng đi, đây là công nghệ đơn giản nhƣng nảy sinh vấn đề vừa làm giảm sự rắn chắc của sợi bông do tác động của chất kiềm tới cấu trúc của cellulose, vừa làm ô nhiễm môi trƣờng và tiêu hao rất lớn năng lƣợng. Để giải quyết vấn đề này, những năm gần đây các nhà công nghệ trên thế giới đã sử dụng enzyme pectinase, một loại enzyme pectinase kiềm để phân hủy pectin trong sợi bông, thay vì sử dụng hóa chất kiềm độc hại.