Luận văn thạc sĩ hay nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong bacillus subtilis ứng dụng trong công nghiệp xử lý vải bông

Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong Bacillus subtilis, ứng dụng trong công nghiệp xử lý vải bông, mang lại giải pháp hiệu quả.

• Tác giả: Lê Trọng Tài
• Người hướng dẫn: Ts. Lê Văn Trường
• Trường học: Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật
• Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong Bacillus subtilis nhằm ứng dụng trong công nghiệp xử lý vải bông
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis
• 1.2. Hệ biểu hiện Bacillus subtilis
• 1.3. Khái niệm pectinase
• 1.4. Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase
• 1.5. Pectinase của Bacillus subtilis
• 1.6. Ứng dụng của pectinase kiềm
• 1.7. Cấu tạo sợi bông tự nhiên
• 1.8. Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông
• 1.9. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy
• 1.10. Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến cà phê và trà
• 1.11. Tình hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Các chủng vi khuẩn
• 2.2. Hóa chất thí nghiệm
• 2.3. Các vector sử dụng
• 2.4. Trình tự mồi
• 2.5. Môi trường nuôi cấy
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa
• 2.6.2. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B. subtilis tự nhiên
• 2.6.3. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp
• 2.6.4. Định lượng protein theo phương pháp Bradford
• 2.6.5. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)
• 2.6.6. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi
• 2.6.7. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B.
• 2.6.8. Tách chiết DNA plasmid từ E.
• 2.6.9. Tách chiết DNA plasmid từ B.
• 2.6.10. Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử
• 2.6.11. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp xung điện
• 2.6.12. Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B.
• 2.6.13. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009)
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis phân lập từ trong nước có hoạt tính pectinase cao
• 3.2. Sàng lọc chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch
• 3.3. Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại bào của các chủng nghiên cứu
• 3.4. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi
• 3.5. Tách dòng gen pectinase trong E.
• 3.6. Tách chiết DNA tổng số của các chủng B.
• 3.7. Nhân gen pectinase bằng PCR
• 3.8. Tách dòng các gen pel vào E.
• 3.9. Giải trình tự các gen pectinase subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase
• 3.10. Thiết kế vector biểu hiện gen pectinase trong B.
• 3.11. Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B.
• 3.12. Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng
• 3.13. So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh ra từ chủng tự nhiên
• 3.14. So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên
• 3.15. So sánh ảnh hưởng của pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu biểu hiện gen pectinase trong Bacillus subtilis

Nghiên cứu biểu hiện gen pectinase trong Bacillus subtilis đang thu hút sự chú ý lớn trong ngành công nghiệp xử lý vải bông. Pectinase là enzyme quan trọng giúp phân hủy pectin, một thành phần chính trong cấu trúc sợi bông. Việc ứng dụng enzyme này không chỉ nâng cao chất lượng vải mà còn giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Bacillus subtilis là một trong những vi khuẩn có khả năng sản xuất pectinase hiệu quả, mở ra nhiều cơ hội cho ngành công nghiệp dệt may.

1.1. Khái niệm về pectinase và vai trò trong công nghiệp

Pectinase là enzyme xúc tác phân cắt pectin, giúp cải thiện khả năng thấm nước của vải bông. Enzyme này có vai trò quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp như thực phẩm, dệt may và xử lý rác thải.

1.2. Bacillus subtilis và khả năng sản xuất pectinase

Bacillus subtilis là vi khuẩn gram dương, có khả năng sản xuất pectinase kiềm. Vi khuẩn này được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp nhờ vào khả năng sinh trưởng mạnh mẽ và môi trường nuôi cấy đơn giản.

II. Vấn đề trong công nghiệp xử lý vải bông hiện nay

Ngành công nghiệp dệt may Việt Nam đang đối mặt với nhiều thách thức, đặc biệt là trong việc xử lý vải bông. Việc sử dụng hóa chất kiềm để loại bỏ tạp chất không chỉ làm giảm chất lượng vải mà còn gây ô nhiễm môi trường. Do đó, cần tìm kiếm giải pháp thay thế hiệu quả hơn.

2.1. Tác động của hóa chất kiềm đến chất lượng vải

Hóa chất kiềm có thể làm giảm độ bền của sợi bông, gây ra tình trạng vải yếu và dễ hư hỏng. Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng sản phẩm cuối cùng.

2.2. Ô nhiễm môi trường từ quy trình xử lý truyền thống

Quy trình xử lý vải bông truyền thống thải ra nhiều chất độc hại, gây ô nhiễm nguồn nước và không khí. Việc chuyển sang sử dụng enzyme pectinase là một giải pháp bền vững hơn.

III. Phương pháp nghiên cứu biểu hiện gen pectinase trong Bacillus subtilis

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để tách dòng và biểu hiện gen mã hóa pectinase trong Bacillus subtilis. Các bước bao gồm tách chiết DNA, nhân gen bằng PCR và chuyển gen vào vi khuẩn chủ.

3.1. Tách chiết và nhân gen pectinase

Quy trình tách chiết DNA từ Bacillus subtilis được thực hiện để thu nhận gen pectinase. Sau đó, gen này được nhân lên bằng phương pháp PCR để tạo ra số lượng lớn cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2. Chuyển gen vào Bacillus subtilis

Gen pectinase được chuyển vào Bacillus subtilis thông qua phương pháp điện chuyển. Điều này giúp tạo ra các chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng sản xuất enzyme pectinase cao.

IV. Ứng dụng thực tiễn của pectinase trong công nghiệp xử lý vải bông

Việc ứng dụng enzyme pectinase trong công nghiệp xử lý vải bông đã cho thấy nhiều lợi ích. Enzyme này giúp cải thiện khả năng thấm nước, làm cho vải mềm mại và dễ nhuộm hơn. Điều này không chỉ nâng cao chất lượng sản phẩm mà còn tiết kiệm thời gian và năng lượng trong quy trình sản xuất.

4.1. Cải thiện chất lượng vải bông

Sử dụng pectinase giúp loại bỏ tạp chất hiệu quả, làm cho vải bông trở nên mềm mại và có độ bền cao hơn. Điều này tạo ra sản phẩm có giá trị hơn trên thị trường.

4.2. Giảm thiểu ô nhiễm môi trường

Việc thay thế hóa chất kiềm bằng enzyme pectinase không chỉ bảo vệ môi trường mà còn giảm thiểu chi phí xử lý. Điều này giúp ngành công nghiệp dệt may phát triển bền vững hơn.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu biểu hiện gen pectinase trong Bacillus subtilis mở ra nhiều cơ hội cho ngành công nghiệp xử lý vải bông. Việc ứng dụng enzyme này không chỉ nâng cao chất lượng sản phẩm mà còn bảo vệ môi trường. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giải pháp bền vững cho ngành dệt may.

5.1. Tương lai của enzyme pectinase trong công nghiệp

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, enzyme pectinase sẽ ngày càng được ứng dụng rộng rãi hơn trong nhiều lĩnh vực, không chỉ riêng ngành dệt may.

5.2. Khuyến khích nghiên cứu và phát triển

Cần khuyến khích các nghiên cứu tiếp theo về enzyme pectinase để tối ưu hóa quy trình sản xuất và ứng dụng, từ đó nâng cao hiệu quả và giảm thiểu tác động đến môi trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ngành công nghiệp dệt may đóng vai trò then chốt trong nền kinh tế Việt Nam với mục tiêu sản xuất 40.000 tấn bông vào năm 2015 nhằm đáp ứng khoảng 10% nhu cầu trong nước và phấn đấu đạt 60.000 tấn vào năm 2020 theo Quyết định số 36/2008/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ. Sợi bông tự nhiên có cấu trúc phức tạp với 88% đến 96% là cellulose và khoảng 5% là các hợp chất không phải cellulose, trong đó pectin chiếm từ 0,7% đến 1,2%. Pectin đóng vai trò chất kết dính lớp sáp và tạp chất trên bề mặt sợi, cản trở trực tiếp quá trình thấm hút nước cũng như hiệu quả bắt màu thuốc nhuộm.

Phương pháp nấu kiềm truyền thống sử dụng xút ở nhiệt độ cao gây phá hủy cấu trúc cellulose, làm giảm độ bền cơ học của sợi và thải ra môi trường lượng nước thải kiềm độc hại. Để giải quyết triệt để vấn đề này, luận văn tập trung nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase kiềm từ các chủng vi khuẩn bản địa trong hệ thống sinh vật chủ Bacillus subtilis nhằm tạo nguồn chế phẩm sinh học phục vụ công nghệ xử lý vải bông thân thiện với môi trường.

Nghiên cứu được triển khai tại Viện Công nghệ sinh học và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong giai đoạn năm 2015. Đề tài hướng tới việc sàng lọc 20 chủng vi khuẩn bản địa, nhân bản gen mã hóa pectate lyase, thiết kế vector biểu hiện đa copy pMSE3 mang promoter mạnh BaP và đánh giá đặc tính của enzyme tái tổ hợp. Kết quả nghiên cứu mở ra hướng đi bền vững cho ngành dệt may trong nước, nâng cao hiệu quả tẩy sạch pectin lên tới 80%, giảm 20% đến 30% chi phí xử lý nước thải và giảm thiểu đáng kể lượng hóa chất độc hại so với quy trình công nghiệp truyền thống.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên cơ sở lý thuyết về cấu trúc đại phân tử pectin thực vật và cơ chế phân giải xúc tác của hệ enzyme pectinolytic. Pectin cấu tạo từ chuỗi polygalacturonic acid liên kết qua cầu nối alpha-1,4-glycoside với hai dạng tồn tại chính là pectin ester hóa và pectin acid. Quá trình xử lý sinh học sử dụng nhóm enzyme pectate lyase thuộc phân lớp enzyme mã số EC 4.2.2.2 để phân cắt liên kết glycoside theo cơ chế chuyển liên kết khử hydro, hình thành liên kết đôi không no giữa carbon C-4 và C-5 ở đầu không khử.

Mô hình nghiên cứu ứng dụng hệ biểu hiện vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis 168 với các đặc tính ưu việt như khả năng tiết thẳng protein ngoại bào, tốc độ sinh trưởng nhanh và tính an toàn sinh học cao. Để tối ưu hóa mức độ phiên mã và dịch mã, nghiên cứu tích hợp promoter mạnh BaP có nguồn gốc từ gen mã hóa alpha-amylase của Bacillus amyloliquefaciens cùng peptide tín hiệu tiết đặc hiệu gồm 21 amino acid, phối hợp với vector đa copy pMSE3 nhằm gia tăng số lượng bản sao gen trong tế bào chủ.

Phương pháp nghiên cứu

Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 20 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập tại Việt Nam, được thu thập từ nguồn lưu trữ của Ngân hàng Chủng giống Vi sinh vật Quốc gia và Trung tâm Công nghệ sinh học phục vụ đời sống và sản xuất. Phương pháp chọn mẫu tập trung vào các chủng có nguồn gốc sinh thái đa dạng từ đất canh tác, rễ cây và rong sụn biển nhằm tối đa hóa độ đa dạng di truyền của gen mục tiêu.

Quy trình phân tích hoạt tính sử dụng phương pháp phát hiện vòng phân giải trên thạch LB bổ sung 0,2% pectin citrus kết hợp thuốc thử cetyltrimethylammonium bromide nồng độ 0,5%. Hoạt tính enzyme dịch lỏng được định lượng chính xác bằng phương pháp đường khử với thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid ở bước sóng 530 nm dựa trên đường chuẩn glucose quy đổi, kết hợp phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 232 nm để phát hiện liên kết đôi đặc trưng. Hàm lượng protein tổng số được xác định theo phương pháp Bradford tại bước sóng 595 nm với albumin huyết thanh bò nồng độ từ 10 đến 150 microgram/ml.

Về sinh học phân tử, DNA tổng số được tách chiết bằng kỹ thuật ly giải lysozyme kết hợp bộ kit tinh sạch chuyên dụng. Gen mã hóa pectinase được nhân bản bằng phản ứng chuỗi polymerase với cặp mồi chuyên biệt qua 30 chu kỳ nhiệt, gắn vào vector trung gian pJET1.2 trước khi biến nạp vào Escherichia coli DH5alpha bằng xung điện thế cao 2,5 kV. Vector tái tổ hợp pMSE3 chứa gen dung hợp BaP-pel được chuyển vào Bacillus subtilis 168 thông qua phương pháp tạo tế bào khả biến tự nhiên, sau đó đánh giá biểu hiện protein ngoại bào bằng điện di gel polyacrylamide biến tính 12% theo phương pháp Laemmli trong thời gian nuôi cấy từ 24 đến 26 giờ.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình sàng lọc sơ bộ 20 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ghi nhận 17 chủng tạo vòng phân giải rõ rệt trên đĩa thạch chứa 0,2% pectin, chiếm tỷ lệ 85% tổng số mẫu khảo sát. Khảo sát 9 chủng có hoạt tính ngoại bào cao trong môi trường nuôi cấy lỏng cho thấy toàn bộ các enzyme thu nhận đều là pectinase ưa kiềm với dải pH tối ưu từ 8,5 đến 10,0. Trong đó, chủng VBS11 đạt hoạt tính cao nhất là 38,9 U/ml tại pH 10,0, vượt trội 122% so với chủng VBS15 chỉ đạt 17,5 U/ml. Chủng VBS8 và VBS13 cũng thể hiện hoạt tính mạnh lần lượt là 36,5 U/ml và 30,1 U/ml.

Bốn đoạn gen mã hóa pectinase từ các chủng VBS6, VBS8, VBS11 và VBS13 được nhân bản thành công bằng kỹ thuật PCR với kích thước đồng nhất khoảng 1,5 kb. Trình tự nucleotide hoàn chỉnh của 4 gen đã được đăng ký thành công trên Ngân hàng Gen Quốc tế với các mã số JX083068, JX083069, JX083070 và JX083071. Phân tích tin sinh học cho thấy chuỗi peptide suy diễn gồm 420 amino acid với khối lượng phân tử khoảng 45,6 kDa, đạt độ tương đồng rất cao từ 98,8% đến 99,7% so với chủng chuẩn Bacillus subtilis 168.

Nghiên cứu đã thiết kế thành công vector biểu hiện đa copy pMSE3/BaP-pel mang gen từ chủng VBS11 và chuyển nạp vào Bacillus subtilis 168. Thể biến nạp BSM thu được biểu hiện mạnh mẽ enzyme tái tổ hợp ra môi trường lỏng sau 24 giờ lên men với hoạt tính xúc tác bền vững trong điều kiện nhiệt độ 45 đến 50 độ C và pH kiềm tối ưu từ 9,5 đến 10,0.

Thảo luận kết quả

Sự sai khác về trình tự amino acid giữa 4 chủng bản địa thể hiện tính đa dạng sinh học rõ rệt theo môi trường sống. Kết quả căn hàng ClustalW ghi nhận 9 vị trí biến dị amino acid; trong đó các chủng phân lập từ đất như VBS6 và VBS11 mang nhiều sai khác hơn (từ 4 đến 5 vị trí amino acid) so với chủng phân lập từ rễ cây VBS8 (1 vị trí) và rong sụn VBS13 (2 vị trí). Điều này phản ánh áp lực tiến hóa thích nghi của vi khuẩn đất đối với nguồn cơ chất phức tạp trong tự nhiên.

Dữ liệu thực nghiệm về hoạt tính enzyme theo các dải pH từ 7,0 đến 11,0 được minh họa rõ nét qua biểu đồ đường biến thiên, khẳng định tính chất ưa kiềm mạnh mẽ của chế phẩm. Hoạt tính riêng và khả năng tiết ngoại bào vượt bậc của chủng tái tổ hợp BSM chứng minh vai trò quyết định của promoter BaP trong việc kích hoạt phiên mã mạnh mẽ trong Bacillus subtilis. Sự phụ thuộc tuyệt đối của enzyme vào ion Ca2+ với 3 vị trí gắn kết bảo tồn Asp-184, Asp-223 và Asp-227 là minh chứng khoa học cho cơ chế xúc tác lyase, hoàn toàn phù hợp với các công bố quốc tế hàng đầu về cấu trúc pectate lyase.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa công nghệ lên men quy mô pilot: Đề nghị các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học và viện nghiên cứu chuyên ngành tiến hành khảo sát các thông số lên men trên hệ thống bioreactor 10 đến 50 lít, tối ưu hóa thành phần nguồn carbon và nitơ rẻ tiền nhằm nâng cao hoạt tính pectinase ngoại bào đạt ngưỡng trên 120 U/ml trong khung thời gian từ 6 đến 12 tháng tới.
2. Thực nghiệm quy trình xử lý vải bông công nghiệp: Khuyến nghị các doanh nghiệp dệt may trong nước phối hợp với nhóm nghiên cứu triển khai thử nghiệm công nghệ BioScouring thay thế xút trên dây chuyền vải mộc quy mô nhà xưởng, hướng tới mục tiêu giảm 30% lượng nước tiêu thụ và cắt giảm 25% chi phí năng lượng gia nhiệt trong giai đoạn 12 đến 18 tháng.
3. Nghiên cứu phối hợp đa enzyme: Nhóm tác giả cần tiếp tục phát triển tổ hợp enzyme đa chức năng kết hợp giữa pectinase kiềm tái tổ hợp với xylanase, lipase và cellulase nhằm tăng cường hiệu suất bóc tách lớp sáp và hemicellulose trên sợi bông thô đạt trên 85% trong thời gian 18 đến 24 tháng.
4. Đăng ký sở hữu trí tuệ và hoàn thiện hồ sơ thương mại hóa: Cơ quan chủ quản và các đơn vị nghiên cứu cần hoàn thiện hồ sơ bảo hộ giải pháp hữu ích đối với cấu trúc plasmid pMSE3/BaP-pel, đồng thời xúc tiến chuyển giao công nghệ cho các nhà máy sản xuất chế phẩm sinh học nội địa nhằm thay thế 15% đến 20% lượng chế phẩm nhập khẩu trong vòng 24 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Nhà khoa học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học: Nguồn tài liệu chuyên sâu về kỹ thuật tách dòng, thiết kế vector biểu hiện đa copy cho vi khuẩn Gram dương và chiến lược khai thác promoter mạnh phục vụ công nghệ tái tổ hợp protein.
• Kỹ sư công nghệ và chuyên viên kỹ thuật ngành Dệt Nhuộm: Cẩm nang thực tế cung cấp thông số sinh hóa chuẩn xác về enzyme ưa kiềm để xây dựng quy trình nấu tẩy vải mộc thân thiện môi trường, nâng cao độ mao dẫn và độ bền cơ học của sợi dệt.
• Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học công nghiệp: Cơ sở dữ liệu khoa học tin cậy để đánh giá tính khả thi kinh tế - kỹ thuật trong việc làm chủ quy trình lên men vi sinh vật sản xuất enzyme kiềm quy mô lớn tại Việt Nam.
• Học viên cao học và sinh viên ngành Sinh học Thực nghiệm: Mô hình nghiên cứu mẫu mực từ khâu thu thập mẫu, sàng lọc hoạt tính, giải trình tự gen đến tối ưu hóa biểu hiện ngoại bào phục vụ quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

Enzyme pectinase ưa kiềm mang lại lợi ích gì nổi bật so với xút trong xử lý vải bông?
Xử lý vải bông bằng pectinase kiềm giúp loại bỏ chọn lọc khoảng 80% pectin ở điều kiện nhiệt độ ôn hòa từ 45 đến 50 độ C và pH 9,5 đến 10,0. Phương pháp này bảo toàn nguyên vẹn 100% cấu trúc cellulose, giúp sợi vải mềm mại, tăng khả năng thấm hút nước và giảm thiểu đáng kể chi phí xử lý nước thải kiềm.

Tại sao nghiên cứu lại chọn vi khuẩn Bacillus subtilis thay vì Escherichia coli để biểu hiện gen?
Bacillus subtilis là sinh vật chủ an toàn sinh học không chứa nội độc tố, có hệ thống bài xuất protein ngoại bào trực tiếp vào môi trường nuôi cấy. Điều này giúp loại bỏ hoàn toàn các bước phá vỡ tế bào phức tạp, giảm 40% chi phí tinh sạch và hạn chế tối đa hiện tượng tạo thể vùi thường gặp ở Escherichia coli.

Ion canxi (Ca2+) đóng vai trò như thế nào đối với hoạt tính phân giải của pectinase?
Ion Ca2+ là cofactor bắt buộc tham gia trực tiếp vào trung tâm hoạt động của enzyme tại các vị trí liên kết bảo tồn gồm Asp-184, Asp-223 và Asp-227. Sự hiện diện của nồng độ khoảng 0,1 mM Ca2+ giúp ổn định cấu trúc không gian bậc ba và kích hoạt phản ứng phân cắt liên kết glycoside theo cơ chế chuyển liên kết.

Điểm khác biệt cốt lõi giữa vector đa copy pMSE3 và vector tích hợp nhiễm sắc thể là gì?
Vector đa copy pMSE3 duy trì số lượng lớn bản sao plasmid trong mỗi tế bào, mang lại mức độ biểu hiện protein cao hơn từ 3 đến 5 lần so với vector tích hợp. Tuy nhiên, hệ thống này đòi hỏi duy trì áp lực chọn lọc bằng kháng sinh kanamycin nồng độ 20 microgram/ml trong môi trường lên men để đảm bảo độ bền plasmid.

Chủng vi khuẩn bản địa nào cho hoạt tính phân giải pectin cao nhất và tiềm năng ứng dụng ra sao?
Chủng Bacillus subtilis VBS11 phân lập từ đất đạt hoạt tính ngoại bào cao nhất là 38,9 U/ml tại pH 10,0. Gen mã hóa pectinase từ chủng này sở hữu độ tương đồng 99,0% với chủng chuẩn và đã được sử dụng thành công để tái tổ hợp biểu hiện cao, chứng minh tiềm năng thương mại hóa rất lớn trong ngành dệt may nội địa.

Kết luận

• Luận văn đã sàng lọc thành công 20 chủng vi khuẩn bản địa và xác định 17 chủng có khả năng sinh tổng hợp pectinase kiềm, trong đó chủng VBS11 đạt hoạt tính cao nhất là 38,9 U/ml ở pH 10,0.
• Nhân bản, tách dòng và công bố thành công 4 trình tự gen mã hóa pectinase kích thước 1,5 kb trên Ngân hàng Gen Quốc tế với các mã số từ JX083068 đến JX083071.
• Thiết kế hoàn chỉnh vector biểu hiện đa copy pMSE3 mang promoter mạnh BaP và biểu hiện thành công enzyme tái tổ hợp có khối lượng 45,6 kDa trong tế bào chủ Bacillus subtilis 168.
• Chế phẩm enzyme tái tổ hợp hoạt động tối ưu ở pH từ 9,5 đến 10,0 và nhiệt độ 45 đến 50 độ C, đáp ứng hoàn hảo các tiêu chuẩn kỹ thuật khắt khe của công nghệ xử lý vải bông sinh học.
• Đề tài đóng góp nền tảng công nghệ sinh học quan trọng, mở ra lộ trình từ 12 đến 24 tháng để tiến tới sản xuất enzyme nội địa quy mô công nghiệp; các viện nghiên cứu và doanh nghiệp dệt may nên nhanh chóng phối hợp thử nghiệm để thúc đẩy nền công nghiệp dệt nhuộm xanh và bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ TRỌNG TÀI NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CAO GEN MÃ HÓA PECTINASE TRONG Bacillus subtilis NHẰM Ƣ́NG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP XƢ̉ LÝ VẢI BÔNG Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN TRƢỜNG Hà Nội - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Lê Trọng Tài Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn i LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.

Lê Văn Trường, là người thầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (nay là Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật) đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận văn. Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn - những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Tác giả Lê Trọng Tài Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT. v DANH MỤC BẢNG. vi DANH MỤC HÌNH. 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

Sơ lƣợc về Bacillus subtilis. Hệ biểu hiện Bacillus subtilis. Khái niệm pectinase. Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase.

Pectinase của Bacillus subtilis. Ứng dụng của pectinase kiềm. Cấu tạo sợi bông tự nhiên. Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông.

Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy. Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến cà phê và trà. Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam. 13 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP.

Các chủng vi khuẩn. Hóa chất thí nghiệm. Các vector sử dụng. Trình tự mồi.

Môi trƣờng nuôi cấy. Phƣơng pháp nghiên cứu. Sàng lọc các chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa.

Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B. subtilis tự nhiên. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp. Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11].

Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)[10]. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi. 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B.

Tách chiết DNA plasmid từ E. Tách chiết DNA plasmid từ B. Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử. Biến nạp plasmid vào E.

coli bằng phương pháp xung điện. Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009). 27 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

Sàng lọc các chủng B. subtilis phân lập từ trong nƣớc có hoạt tính pectinase cao. Sàng lọc chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch.

Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại bào của các chủng nghiên cứu. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi. Tách dòng gen pectinase trong E. Tách chiết DNA tổng số của các chủng B.

Nhân gen pectinase bằng PCR. Tách dòng các gen pel vào E. Giải trình tự các gen pectinase. subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase.

Thiết kế vector biểu hiện gen pectinase trong B. Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B. Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng. So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh ra từ chủng tự nhiên.

So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên. So sánh ảnh hưởng của pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên. 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI. 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

50 Tài liệu tiếng Việt. 50 Tài liệu tiếng Anh. 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT a.a : Amino acid APS : Ammonium persulfate B. subtilis : Bacillus subtilis BMM : Môi trƣờng khoáng chất Belisky BSA : Bovine serum albumin DEAE : Diethylethanolamine DNA : Deoxyribonucleic axit DNSA : 3,5-Dinitrosalicylic axit E.

coli : Escherichia coli EDTA : Ethylenediaminetetraacetic axit HTAB : Hecxadecyl trimethyl trimethyl trimethyl trimethyl ammonium bromide ISO : International standards organization kDa : Kilo Dalton LB : Luria bertani M : Mole OD : Optical density PCR : Polymerase chain reaction pel : Gen pectinase Pel : Enzyme pectinase RR : Rhuthenium red rPel : Pectinase tái tổ hợp SDS : Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED : Tetramethylethylenediamine U : Unit Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn v LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Phân loại các pectinolytic enzyme. Các thành phần cấu tạo sợi bông. Thành phần phản ứng nhân gen.

Chƣơng trình nhân gen bằng PCR. Thành phần phản ứng cắt pKTH/pUC bằng HindIII. Thành phần phản ứng cắt pJET/pel bằng HindIII. Thành phần phản ứng gắn gen pel với promoter.

Thành phần phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel. Kết quả sàng lọc các chủng B. subtilis có khả năng phân hủy pectin trên đĩa thạch. Hoạt tính pectinase ở điều kiện pH phản ứng tối ƣu của các chủng nghiên cứu.

Hoạt tính pectinase của các enzyme thu đƣợc. 31 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases.

Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase. Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase. Sự kết nối giữa cellulose và các chất không phải cellulose trong lớp thứ cấp của sợi bông. Pectin đƣợc tồn tại ở hai loại: pectin axit và esterified pectin.1 Đồ thị đƣờng chuẩn protein.

Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành 3 amino, 5-nitrosalicylic axit. Đƣờng chuẩn glucose. Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit của pectinase. Hình ảnh một số chủng B.

subtilis tạo vòng thủy phân pectin trên đĩa thạch LB 0,2% pectin. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng phân hủy pectin của các pectinase từ các chủng nghiên cứu. Điện di DNA tổng số của các chủng B. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pectinase.

Khuẩn lạc các thể biến nạp E. coli DH5α mang pJET/pel trên môi trƣờng chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicillin. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII.

So sánh theo hàng trình tự amino acid của Pel từ 4 chủng B. subtilis phân lập ở Việt Nam với Pel từ B. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pel trong B. Điện di sản phẩm cắt pKTH/pUC bằng HindIII.

Thu nhận pel từ pJET/pel. Sơ đồ nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. Nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. Kiểm tra gen dung hợp BaP-pel trong pMSE/BaP-pel.

Kiểm tra pMSE/BaP-pel trong tế bào B. subtilis 168 tái tổ hợp. Điện di SDS-PAGE dịch enzyme ngoại bào của chủng B. subtilis tái tổ hợp đa copy trên môi trƣờng LB+Kan.

Kiểm tra sự biểu hiện pectinase của các thể biến nạp đa copy trong tế bào B. subtilis 168 sau 24 giờ nuôi cấy. 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Kiểm tra hoạt tính pectinase của thể biến nạp đa copy BSM và chủng B.

subtilis 168 trên cơ chất pectin axit. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzyme. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt tính enzyme. 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] MỞ ĐẦU Ngành công nghiệp dệt may Việt Nam đang phát triển mạnh, chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc.

Nếu phát triển bông thực hiện đúng tiến độ theo Quyết định số 36/2008/QĐ-TTg của Thủ tƣớng Chính phủ thì đến năm 2015 sản xuất bông trong nƣớc là 40 ngàn tấn, đáp ứng đƣợc 10% nhu cầu và đến 2020 là 60 ngàn tấn đáp ứng đƣợc 12% nhu cầu bông xơ tiêu thụ trong nƣớc. Để “chiến lƣợc phát triển ngành công nghiệp Dệt may Việt Nam đến năm 2015, định hƣớng đến năm 2020” thành công thì ngoài việc thúc đẩy tăng năng xuất và diện tích trồng bông ra chúng ta cần phải cải tiến công nghệ, ứng dụng công nghệ enzyme trong quá trình sản xuất vải bông để tạo ra sản phẩm vải bông chất lƣợng cao, giá thành rẻ và có thể cạnh tranh đƣợc trên thị trƣờng quốc tế. Sợi bông tự nhiên đƣợc cấu tạo bao gồm 95% là cellulose và 5% là không phải cellulose. Vải bông mộc sau khi dệt còn chứa nhiều chất không phải cellulose.

Trong quá trình nhuộm vải, nếu không loại các chất không phải cellulose đi thì chúng sẽ làm cản trở thuốc nhuộm thâm nhập vào vải, dẫn đến giảm chất lƣợng của vải nhuộm. Thông thƣờng để loại bỏ các chất này, vải mộc phải qua bƣớc nấu kiềm (alkaline scouring) để tẩy loại chúng đi, đây là công nghệ đơn giản nhƣng nảy sinh vấn đề vừa làm giảm sự rắn chắc của sợi bông do tác động của chất kiềm tới cấu trúc của cellulose, vừa làm ô nhiễm môi trƣờng và tiêu hao rất lớn năng lƣợng. Để giải quyết vấn đề này, những năm gần đây các nhà công nghệ trên thế giới đã sử dụng enzyme pectinase, một loại enzyme pectinase kiềm để phân hủy pectin trong sợi bông, thay vì sử dụng hóa chất kiềm độc hại.