Nghiên Cứu Sàng Lọc Squalene Từ Một Số Chủng Vi Tảo Biển Phân Lập Ở Việt Nam

Squalene là một hợp chất tự nhiên quan trọng, được tìm thấy trong nhiều loại thực vật và động vật, đặc biệt là trong… 77 trang · Đại học Thái Nguyên · 2014.

• Tác giả: Nguyễn Cẩm Hà
• Người hướng dẫn: PGS. Đặng Diễm Hồng
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Sàng Lọc Squalene Từ Một Số Chủng Vi Tảo Biển Phân Lập Ở Việt Nam
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về squalene
• 1.2. Nguồn gốc squalene
• 1.3. Cấu trúc squalene
• 1.4. Tính chất hóa học của squalene
• 1.5. Con đường sinh tổng hợp cholesterol
• 1.6. Vai trò của squalene
• 1.6.1. Squalene là một tác nhân chống lão hóa
• 1.7. Vai trò của squalene đối với sức khỏe con người
• 1.8. Trong điều trị và ngăn ngừa bệnh ung thư
• 1.9. Vai trò của squalene trong giải độc
• 1.10. Đối với các bệnh khác
• 1.11. Vai trò của squalene trong công nghiệp mỹ phẩm
• 1.12. Vai trò của squalene đối với các ngành công nghiệp khác
• 1.13. Các nguồn khai thác squalene
• 1.14. Nghiên cứu khai thác squalene từ vi tảo trên thế giới
• 1.15. Một số hướng nghiên cứu về squalene trên thế giới
• 1.16. Nghiên cứu trong nước về squalene
• 1.17. Một số giới thiệu về chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium của Việt Nam
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị
• 2.2. Chủng tảo và điều kiện nuôi cấy
• 2.3. Phương pháp
• 2.3.1. Xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào
• 2.3.2. Xác định hình thái và kích thước tế bào bằng kính hiển vi quang học
• 2.3.3. Xác định sinh trưởng qua sinh khối khô
• 2.3.4. Phương pháp nhuộm lipid bằng Nile red
• 2.3.5. Tách chiết lipit
• 2.3.6. Định lượng squalene bằng phương pháp so màu
• 2.3.7. Tách chiết và tinh sạch squalene thô
• 2.3.8. Tách chiết squalene thô
• 2.3.9. Tinh sạch squalene thô
• 2.3.10. Xác định squalene bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng
• 2.3.11. Tinh sạch squalene bằng phương pháp sắc kí cột
• 2.3.12. Xác định squalene bằng sắc ký lỏng cao áp
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nuôi trồng đủ sinh khối vi tảo biển quang tự dưỡng và dị dưỡng làm nguyên liệu cho tách chiết squalene
• 3.2. Sàng lọc nhanh các chủng vi tảo có tiềm năng sản xuất squalene cao
• 3.3. Phát hiện nhanh lipit nội bào bằng nhuộm Nile Red
• 3.4. Phân tích lipit tổng số của các loài vi tảo biển được sử dụng trong nghiên cứu
• 3.5. Xác định hàm lượng squalene trong sinh khối tảo bằng phương pháp so màu
• 3.6. Xác định hàm lượng squalene trong sinh khối bình lên men 30 lít bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp
• 3.7. Tách chiết lipit không xà phòng hóa từ lipit tổng số
• 3.8. Xác định squalene bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp
• 3.9. Sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) - bản nhỏ để sàng lọc nhanh chóng các chủng vi tảo biển chứa hàm lượng squalene cao
• 3.10. Tinh sạch squalene bằng phương pháp sắc kí cột
• 3.11. Xác định squalene bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
• 3.12. Phân tách và tinh sạch squalene bằng sắc ký cột silicagel
• 3.13. Quy trình tách chiết squalene từ sinh khối tảo dị dưỡng S
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Khám Phá Squalene Từ Vi Tảo Biển Việt Nam Tổng Quan

Squalene là một hợp chất tự nhiên quan trọng, được tìm thấy trong nhiều loại thực vật và động vật, đặc biệt là trong vi tảo biển. Tại Việt Nam, vi tảo biển đang được nghiên cứu như một nguồn tiềm năng để sản xuất squalene. Việc khai thác squalene từ vi tảo không chỉ giúp bảo vệ môi trường mà còn cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm.

1.1. Squalene Là Gì Và Tại Sao Quan Trọng

Squalene là một hợp chất lipid có vai trò quan trọng trong cơ thể, giúp bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa. Nó cũng là tiền chất của cholesterol, có tác dụng chống lão hóa và hỗ trợ sức khỏe tim mạch.

1.2. Nguồn Gốc Squalene Từ Vi Tảo Biển

Vi tảo biển là nguồn cung cấp squalene phong phú, với khả năng tổng hợp cao. Các nghiên cứu cho thấy một số chủng vi tảo biển có thể sản xuất squalene với hàm lượng lớn, mở ra cơ hội cho việc khai thác bền vững.

II. Thách Thức Trong Việc Khai Thác Squalene Từ Vi Tảo Biển

Mặc dù vi tảo biển có tiềm năng lớn trong việc sản xuất squalene, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong việc khai thác và sản xuất. Các vấn đề như điều kiện nuôi trồng, quy trình tách chiết và chi phí sản xuất cần được giải quyết.

2.1. Điều Kiện Nuôi Trồng Vi Tảo Biển

Việc nuôi trồng vi tảo biển đòi hỏi điều kiện môi trường tối ưu, bao gồm ánh sáng, nhiệt độ và dinh dưỡng. Những yếu tố này ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng squalene.

2.2. Quy Trình Tách Chiết Squalene

Quy trình tách chiết squalene từ vi tảo biển cần được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu suất cao và chi phí thấp. Các phương pháp hiện tại như sắc ký và chiết xuất bằng dung môi cần được cải tiến.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Squalene Từ Vi Tảo Biển

Nghiên cứu về squalene từ vi tảo biển bao gồm nhiều phương pháp khác nhau, từ nuôi trồng đến tách chiết và phân tích. Các phương pháp này giúp xác định hàm lượng squalene và tối ưu hóa quy trình sản xuất.

3.1. Nuôi Trồng Vi Tảo Biển

Các phương pháp nuôi trồng vi tảo biển như nuôi cấy trong bể hoặc bình lên men được áp dụng để tối ưu hóa sản lượng squalene. Việc lựa chọn chủng vi tảo phù hợp cũng rất quan trọng.

3.2. Phân Tích Hàm Lượng Squalene

Sử dụng các phương pháp phân tích như sắc ký lỏng cao áp (HPLC) để xác định hàm lượng squalene trong mẫu vi tảo. Điều này giúp đánh giá hiệu quả của quy trình tách chiết.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Squalene Trong Ngành Công Nghiệp

Squalene có nhiều ứng dụng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm. Nó được sử dụng như một thành phần trong các sản phẩm chăm sóc da và thực phẩm chức năng, nhờ vào các lợi ích sức khỏe của nó.

4.1. Squalene Trong Mỹ Phẩm

Squalene được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm chăm sóc da nhờ vào khả năng giữ ẩm và chống lão hóa. Nó giúp cải thiện độ đàn hồi của da và bảo vệ da khỏi tác hại của môi trường.

4.2. Squalene Trong Dược Phẩm

Trong ngành dược phẩm, squalene được nghiên cứu như một chất bổ sung dinh dưỡng, có khả năng hỗ trợ hệ miễn dịch và giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch.

V. Kết Luận Và Tương Lai Của Nghiên Cứu Squalene Từ Vi Tảo Biển

Nghiên cứu về squalene từ vi tảo biển Việt Nam đang mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành công nghiệp. Việc phát triển các phương pháp khai thác và sản xuất bền vững sẽ giúp đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về squalene.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu tiếp tục được thực hiện để tìm ra các chủng vi tảo biển mới có khả năng sản xuất squalene cao hơn. Điều này sẽ giúp tăng cường nguồn cung và giảm chi phí sản xuất.

5.2. Khuyến Nghị Cho Các Nghiên Cứu Tiếp Theo

Cần có các nghiên cứu sâu hơn về quy trình tách chiết và ứng dụng của squalene trong các lĩnh vực khác nhau. Việc hợp tác giữa các nhà khoa học và doanh nghiệp cũng rất quan trọng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Squalene là một hợp chất triterpene không bão hòa có vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp cholesterol và các steroit khác, đồng thời được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm và thực phẩm chức năng. Theo ước tính, nhu cầu squalene trên thế giới ngày càng tăng do tác dụng chống oxy hóa, chống lão hóa, hỗ trợ điều trị ung thư và bảo vệ sức khỏe con người. Tuy nhiên, nguồn cung truyền thống từ dầu gan cá mập đang gặp nhiều khó khăn do suy giảm nguồn cá tự nhiên và các vấn đề môi trường. Việt Nam, với nguồn tài nguyên vi tảo biển phong phú, đặc biệt là các chủng vi tảo dị dưỡng như Schizochytrium mangrovei, được xem là nguồn tiềm năng thay thế để sản xuất squalene trên quy mô lớn.

Mục tiêu nghiên cứu là sàng lọc và xác định hàm lượng squalene trong một số chủng vi tảo biển phân lập ở Việt Nam, xây dựng phương pháp tách chiết và định lượng phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm trong nước, từ đó tìm ra các chủng tiềm năng cho sản xuất squalene phục vụ ngành dược phẩm và thực phẩm chức năng. Nghiên cứu được thực hiện trong phạm vi các chủng vi tảo biển quang tự dưỡng và dị dưỡng phân lập từ vùng biển Việt Nam, với thời gian nuôi cấy và thu sinh khối phù hợp để đánh giá hàm lượng squalene.

Ý nghĩa của nghiên cứu thể hiện qua việc cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển nguồn nguyên liệu squalene bền vững, giảm áp lực khai thác từ nguồn cá mập và dầu thực vật, đồng thời góp phần nâng cao giá trị kinh tế và bảo vệ môi trường biển Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cấu trúc và tính chất hóa học của squalene: Squalene (C30H50) là hydrocacbon không bão hòa với 6 liên kết đôi, có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ nhờ cấu trúc isoprenoid, là tiền chất trong con đường sinh tổng hợp cholesterol và steroit.
• Con đường sinh tổng hợp cholesterol: Squalene là sản phẩm trung gian trong quá trình tổng hợp cholesterol, được xúc tác bởi enzyme squalene synthase. Việc điều chỉnh hoạt động enzyme này ảnh hưởng đến hàm lượng cholesterol và các steroit trong cơ thể.
• Vai trò sinh học của squalene: Chất này có tác dụng chống lão hóa, bảo vệ tế bào khỏi gốc tự do, hỗ trợ điều trị ung thư, giải độc và ứng dụng trong công nghiệp mỹ phẩm như chất làm mềm da, dưỡng ẩm.
• Nguồn nguyên liệu sản xuất squalene: Từ dầu gan cá mập, dầu thực vật (đặc biệt là dầu ô liu), và vi tảo biển dị dưỡng như Schizochytrium và Thraustochytrium với ưu điểm sinh trưởng nhanh, hàm lượng lipid cao, phù hợp cho sản xuất công nghiệp.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: 7 chủng vi tảo biển phân lập từ vùng biển Việt Nam, gồm 5 loài quang tự dưỡng (Chlorella vulgaris, Dunaliella tertiolecta, Isochrysis galbana, Nannochloropsis oculata, Tetraselmis convolutae) và 2 loài dị dưỡng (Schizochytrium mangrovei PQ6, Thraustochytrium striatum).
• Điều kiện nuôi cấy: Vi tảo quang tự dưỡng được nuôi trong môi trường Walne với điều kiện ánh sáng 60-100 µmol/m2s, nhiệt độ 25-30°C, pH 7-9; vi tảo dị dưỡng nuôi trong môi trường M1 hoặc Bajpai cải tiến, lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ 25-28°C, pH 6,5-7.
• Phương pháp phân tích:
  • Xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào bằng buồng đếm Burker-Turk.
  • Đo sinh khối khô bằng phương pháp sấy khô mẫu.
  • Phát hiện lipit nội bào bằng nhuộm huỳnh quang Nile Red.
  • Tách chiết lipit tổng số bằng dung môi methanol:chloroform (2:1).
  • Định lượng squalene bằng phương pháp so màu dựa trên phản ứng với H2SO4 và formaldehyde, đo mật độ quang ở bước sóng 400 nm.
  • Tinh sạch squalene thô bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột silicagel và xác định hàm lượng chính xác bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC).
• Cỡ mẫu và chọn mẫu: 7 chủng vi tảo được chọn dựa trên khả năng nuôi trồng và tiềm năng sản xuất lipid, trong đó tập trung đánh giá kỹ chủng Schizochytrium mangrovei PQ6.
• Timeline nghiên cứu: Nuôi cấy vi tảo trong 4-5 ngày, thu sinh khối, tiến hành tách chiết và phân tích trong phòng thí nghiệm trong vòng 1-2 tháng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Hàm lượng lipit tổng số: Hai loài vi tảo dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 và Thraustochytrium striatum có hàm lượng lipit cao nhất, lần lượt đạt khoảng 50,10% và 50,88% khối lượng khô, cao hơn gấp gần 3 lần so với các loài quang tự dưỡng (dao động từ 9,99% đến 18,91%).
2. Hàm lượng squalene trong sinh khối: Phương pháp so màu cho thấy Schizochytrium mangrovei PQ6 có hàm lượng squalene cao nhất trong số các chủng nghiên cứu, với giá trị ước tính khoảng 0,16 mg/g sinh khối khô, vượt trội so với các loài khác.
3. Hiệu quả tách chiết và tinh sạch: Squalene thô được tách chiết hiệu quả từ lipit tổng số bằng dung môi methanol:chloroform, sau đó tinh sạch qua sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột silicagel, đạt độ tinh khiết trên 90% xác định bằng HPLC.
4. Phương pháp nhuộm Nile Red: Phát hiện nhanh lipit nội bào cho thấy hai chủng dị dưỡng có mức độ nhuộm huỳnh quang mạnh hơn hẳn, phù hợp làm nguồn nguyên liệu cho sản xuất squalene.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu khẳng định tiềm năng vượt trội của các chủng vi tảo dị dưỡng, đặc biệt là Schizochytrium mangrovei PQ6, trong việc sản xuất squalene với hàm lượng và hiệu suất cao hơn nhiều so với các loài quang tự dưỡng truyền thống. Điều này phù hợp với các nghiên cứu quốc tế cho thấy vi tảo dị dưỡng có tốc độ sinh trưởng nhanh, không phụ thuộc ánh sáng và có khả năng tích lũy lipid cao.

Phương pháp so màu được thiết lập lại trong điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam cho phép sàng lọc nhanh, chi phí thấp, phù hợp với điều kiện nghiên cứu trong nước. Việc kết hợp các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột và HPLC giúp nâng cao độ chính xác trong định lượng và tinh sạch squalene, tạo tiền đề cho phát triển quy trình sản xuất công nghiệp.

So sánh với các nghiên cứu trên thế giới, hàm lượng squalene của chủng PQ6 tương đương hoặc cao hơn một số chủng vi tảo biển dị dưỡng được công bố, đồng thời vượt trội so với các nguồn nguyên liệu thực vật và nấm men. Điều này mở ra cơ hội phát triển nguồn nguyên liệu squalene bền vững tại Việt Nam, giảm phụ thuộc vào dầu gan cá mập và dầu thực vật.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh hàm lượng lipit và squalene giữa các chủng vi tảo, bảng tổng hợp điều kiện nuôi cấy và hiệu suất tách chiết, giúp minh họa rõ ràng tiềm năng của từng chủng.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình nuôi trồng quy mô lớn: Tăng cường nghiên cứu và ứng dụng công nghệ nuôi cấy vi tảo dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong bình lên men từ 30 đến 150 lít nhằm tối ưu hóa sinh khối và hàm lượng squalene, dự kiến hoàn thành trong 12-18 tháng, do các viện nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học thực hiện.
2. Hoàn thiện quy trình tách chiết và tinh sạch squalene: Áp dụng phương pháp dung môi kết hợp sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột silicagel để nâng cao hiệu suất và độ tinh khiết sản phẩm, giảm chi phí sản xuất, triển khai trong 6-12 tháng, do phòng thí nghiệm công nghệ tảo chủ trì.
3. Xây dựng hệ thống sàng lọc nhanh các chủng vi tảo tiềm năng: Sử dụng phương pháp nhuộm Nile Red kết hợp định lượng so màu để mở rộng sàng lọc các chủng vi tảo biển khác tại Việt Nam, nhằm đa dạng hóa nguồn nguyên liệu, thực hiện liên tục trong các dự án nghiên cứu.
4. Nghiên cứu ứng dụng squalene trong dược phẩm và thực phẩm chức năng: Thử nghiệm các sản phẩm chứa squalene chiết xuất từ vi tảo trên mô hình lâm sàng và thực tế, đánh giá hiệu quả chống oxy hóa, chống ung thư và làm đẹp da, triển khai trong 2-3 năm, phối hợp giữa viện nghiên cứu và doanh nghiệp dược phẩm.
5. Tăng cường đào tạo và hợp tác quốc tế: Nâng cao năng lực nghiên cứu, chuyển giao công nghệ và tiếp cận các kỹ thuật hiện đại trong sản xuất squalene từ vi tảo, nhằm đẩy nhanh tiến độ thương mại hóa sản phẩm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành sinh học, hóa sinh, công nghệ sinh học: Cung cấp kiến thức chuyên sâu về squalene, phương pháp tách chiết và định lượng, cũng như tiềm năng ứng dụng vi tảo biển trong sản xuất hợp chất sinh học.
2. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và dược phẩm: Tham khảo quy trình nuôi trồng, tách chiết và tinh sạch squalene từ vi tảo để phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên, nâng cao giá trị sản phẩm.
3. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách về tài nguyên sinh vật biển: Đánh giá tiềm năng khai thác bền vững nguồn vi tảo biển Việt Nam, xây dựng chính sách hỗ trợ phát triển công nghiệp sinh học xanh, bảo vệ môi trường biển.
4. Người tiêu dùng và cộng đồng quan tâm đến sức khỏe: Hiểu rõ về lợi ích của squalene trong phòng chống lão hóa, ung thư và các bệnh mãn tính, từ đó lựa chọn sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và hiệu quả.

Câu hỏi thường gặp

1. Squalene là gì và tại sao nó quan trọng?
   Squalene là một hợp chất lipid không bão hòa, tiền chất trong sinh tổng hợp cholesterol và steroit. Nó có tác dụng chống oxy hóa mạnh, bảo vệ tế bào khỏi gốc tự do, hỗ trợ điều trị ung thư và làm đẹp da, rất quan trọng trong y học và công nghiệp mỹ phẩm.

2. Tại sao vi tảo biển được chọn làm nguồn sản xuất squalene?
   Vi tảo biển, đặc biệt là các chủng dị dưỡng như Schizochytrium mangrovei, có tốc độ sinh trưởng nhanh, hàm lượng lipid và squalene cao, không phụ thuộc ánh sáng, dễ nuôi trồng trên quy mô lớn, phù hợp để thay thế nguồn nguyên liệu truyền thống như dầu gan cá mập.

3. Phương pháp nào được sử dụng để xác định hàm lượng squalene trong vi tảo?
   Nghiên cứu sử dụng phương pháp so màu dựa trên phản ứng với axit sulfuric và formaldehyde, đo mật độ quang ở bước sóng 400 nm để sàng lọc nhanh. Để xác định chính xác hơn, sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng cao áp (HPLC).

4. Làm thế nào để tách chiết và tinh sạch squalene từ sinh khối vi tảo?
   Squalene được tách chiết từ lipit tổng số bằng dung môi methanol:chloroform, sau đó tinh sạch qua sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột silicagel để loại bỏ tạp chất, thu được squalene có độ tinh khiết cao phục vụ nghiên cứu và ứng dụng.

5. Nghiên cứu này có thể ứng dụng thực tế như thế nào?
   Kết quả nghiên cứu giúp phát triển quy trình sản xuất squalene từ vi tảo biển tại Việt Nam, cung cấp nguyên liệu cho ngành dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng, góp phần bảo vệ môi trường, giảm khai thác nguồn cá mập và nâng cao giá trị kinh tế biển.

Kết luận

• Đã xác định được 7 chủng vi tảo biển phân lập ở Việt Nam, trong đó Schizochytrium mangrovei PQ6 và Thraustochytrium striatum có hàm lượng lipit và squalene cao nhất, phù hợp cho sản xuất squalene quy mô lớn.
• Phương pháp so màu kết hợp sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp được thiết lập thành công, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm trong nước để sàng lọc và định lượng squalene.
• Vi tảo dị dưỡng có ưu thế vượt trội về tốc độ sinh trưởng và hàm lượng squalene so với vi tảo quang tự dưỡng, mở ra hướng phát triển nguồn nguyên liệu bền vững.
• Quy trình tách chiết và tinh sạch squalene từ sinh khối vi tảo được tối ưu, đạt hiệu suất và độ tinh khiết cao, tạo tiền đề cho ứng dụng công nghiệp.
• Đề xuất phát triển quy trình nuôi trồng, tách chiết và ứng dụng squalene trong dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm chức năng tại Việt Nam trong vòng 1-3 năm tới.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các viện nghiên cứu và doanh nghiệp phối hợp triển khai quy trình sản xuất quy mô pilot, đồng thời mở rộng sàng lọc các chủng vi tảo biển khác để đa dạng hóa nguồn nguyên liệu squalene trong nước.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Squalene là tiền chất steroit của động, thực vật, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm, có tác dụng chống khô da và làm mềm da, có vai trò bảo vệ da khỏi các tác hại do ánh sáng, tia UV gây ra. Các nghiên cứu dịch tễ học đã cho thấy squalene ức chế hiệu quả các tác nhân hóa học có khả năng gây ung thư ruột kết, phổi, da ở động vật thực nghiệm. Squalene cần thiết cho cơ thể bởi nó là một chất chống oxy hoá tự nhiên có vai trò bảo vệ các tế bào khỏi các gốc tự do và oxy phân tử có hoạt tính cao, có khả năng tăng cường hoạt động của hệ miễn dịch. Việc cung cấp thực phẩm chức năng có thành phần squalene cao (khoảng 500 mg/ngày) đã được chứng minh là cần thiết cho sức khỏe dinh dưỡng của con người, làm giảm đáng kể bệnh tim mạch và ung thư vì vậy chúng cũng được dùng phổ biến trong dược phẩm.

Cho đến nay, các nguồn sản xuất squalene được biết đến nhiều nhất là các loại dầu động, thực vật. Dầu o liu chứa hàm lượng squalene cao nhất trong khi một số loại dầu khác như dầu cọ, dầu ngô, dầu vừng lại có hàm lượng squalene không cao. Dầu gan cá mập là một nguồn nguyên liệu truyền thống cho tách chiết squalene có hàm lượng và chất lượng cao. Tuy nhiên, việc duy trì nguồn cung cấp squalene liên tục và lâu dài ngày càng gặp khó khăn do sự suy giảm nguồn cá trong tự nhiên cũng như các vấn đề về thổ nhưỡng và mùa vụ của các loại cây trồng.

Trong khi đó, hiện nay, trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, nhu cầu về squalene làm nguyên liệu trong ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm đang ngày càng tăng. Do vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới thay thế nguồn truyền thống để tách chiết squalene là rất cần thiết và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Trong đó, vi sinh vật nói chung và vi tảo biển nói riêng là một nguồn tiềm năng cho sản xuất squalene trên qui mô lớn. Tảo lục Botrycoccus braunii có khả năng tổng hợp squalene cao nhưng tốc độ sinh trưởng rất thấp và là cơ thể quang tự dưỡng bắt buộc nên gây khó khăn cho việc thương mại hóa sản phẩm này.

Trong khi đó, một số các loài vi tảo biển dị dưỡng như thraustochytrids được xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng cho sản Nguyễn Cẩm Hà - K16 1 xuất các chất có giá trị cao trong đó có squalene. Chi tảo thraustochytrid có hàm lượng squalene cao, có tốc độ sinh trưởng cao trong điều kiện nuôi cấy dị dưỡng có bổ sung nguồn cacbon hữu cơ và không cần có ánh sáng bởi vì cơ thể chúng có bộ máy quang hợp đã bị thoái hóa. Do vậy, việc nâng cấp quy mô nuôi trồng chúng bằng các hệ thống bình lên men khác nhau để bảo đảm cung cấp đủ nguồn nguyên liệu cho sản xuất squalene hứa hẹn sẽ có thành công. Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam hiện đang có một tập đoàn giống vi tảo biển quang tự dưỡng và dị dưỡng của Việt Nam.

Nhiều loài vi tảo trong tập đoàn giống có thể là nguồn cung cấp cho việc tách chiết squalene trên quy mô lớn. Chính vì vậy, chúng tôi mong muốn tiến hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu sàng lọc squalene từ một số chủng vi tảo biển phân lập ở Việt Nam” nhằm cung cấp cơ sở khoa học ban đầu về hàm lượng squalene ở vi tảo biển Việt Nam, có được các phương pháp nghiên cứu phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm về tách chiết, xác định squalene trong sinh khối vi tảo biển để bước đầu tìm ra được một số chủng tiềm năng cho việc nghiên cứu sâu hơn theo định hướng sử dụng squalene làm thực phẩm chức năng và dược phẩm trong tương lai ở Việt Nam Luận văn nghiên cứu có một số nội dung như sau: 1. Sàng lọc một số chủng vi tảo biển của Việt Nam có khả năng nuôi trồng trên quy mô lớn và có hàm lượng squalene cao. Xây dựng các phương pháp xác định nhanh chóng hàm lượng squalene phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam để sử dụng cho việc sàng lọc nhanh các chủng tiềm năng cho sản xuất squalene.

Bước đầu tách chiết và làm sạch squalene từ chủng tiềm năng lựa chọn được. Công việc nghiên cứu được thực hiện tại phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nguyễn Cẩm Hà - K16 2 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Giới thiệu chung về squalene 1. Nguồn gốc squalene Mặc dù ở độ sâu từ 500m -1000m dưới lòng biển, nơi hầu như không có ánh sáng mặt trời, không có thực vật, do đó hàm lượng oxy rất thấp, nhiệt độ trung bình quanh năm khoảng 2°C, áp suất nước là 50-100kgf/cm2 nhưng cá mập biển sâu vẫn sống và tồn tại được. Một vấn đề được nêu ra là làm sao loài cá mập đại dương lại có thể sinh tồn trong một môi trường sống khắc nghiệt như vậy được. Các nhà sinh vật học đã nghiên cứu và nhận thấy ở loài cá mập đại dương này có bộ phận gan lớn hơn rất nhiều so với gan của các loài cá khác.

Trong đó, 80% gan cá này là dầu có chứa một chất được xem là “thần bí”. Sau này, chất này được xác định là squalene. Khả năng tồn tại được trong điều kiện sống bất lợi nêu trên đối với cá mập đại dương liên quan nhiều đến sự có mặt squalene với hàm lượng cao ở gan của nó. Squalene có khả năng nâng cao sức sống cho tế bào và tăng sức đề kháng của cơ thể cá mập và chính những điều này đã giúp cho loài cá này có thể tự do sinh tồn trong môi trường biển với độ sâu 500m – 1000m.

Dầu gan cá mập chứa khoảng 60-85% chất hữu cơ nêu trên trong khi ở dầu oliu chất này có hàm lượng chỉ khoảng 0,4- 0,8 %. Cư dân của bán đảo Izu của Nhật Bản đã uống một loại dầu được đặt tên địa phương là “Samedawa” có nghĩa là “chữa được tất cả” các bệnh. Theo các dẫn chứng khoa học thì từ xa xưa, người Nhật Bản chủ yếu đã sử dụng nhiều hải sản trong chế độ ăn uống của họ. Vì vậy, không quá ngạc nhiên vào năm 1916, một nhà hóa học người Nhật Bản là Tiến sĩ Tsujimoto đã chứng minh được rằng “Samedawa” chứa một lượng rất lớn các hydrocacbon không bão hòa.

Ông gọi nó là squalene do sự xuất hiện của nó trong dầu gan cá mập, từ gốc Latin là “Squalus” (cá mập) [90]. Cấu trúc squalene Mười năm sau phát hiện của Tiến sĩ Tsujimoto, cấu trúc của squalene đã được xác định như một dihydrotriterpene và là một chất trung gian trong quá trình Nguyễn Cẩm Hà - K16 3 sinh tổng hợp của steroit [39]. Năm 1934, Robinson đã công bố cấu trúc vòng của squalene với phân tử steroit [78]. Tuy nhiên, đến năm 1936 công thức hóa học của squalene mới được công bố đầy đủ do Karrer, (1943) – người cũng đã khám phá ra cấu trúc hóa học của vitamin A và E.

Squalene từ dầu gan cá mập được đặt tên theo tiếng Latin là “squalene oxogene oleum”. Trong y học nó được gọi là Spinacene hay Supraene. Theo công bố của Kohno và cộng sự (1995) [52] thì squalene có cấu tạo: (2,6,10,15,19,23–hexanmethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexane) - là một hydrocacbon hợp chất béo không bão hòa (C30H50), với 6 liên kết đôi, chứa 6 đơn vị isoprene để cung cấp bộ khung cho tổng hợp cholesterol axit mật và steroit, là một chất trao đổi trung gian quan trọng trong sinh tổng hợp sterol và triterpenes ở động vật và thực vật (Hình 1. Do cấu trúc của liên kết đôi trong sáu nhóm CH 3, các isoprenoit có tác dụng chống oxy hóa tự nhiên một cách mạnh mẽ.

Squalene có cấu trúc tương tự như các isoprenoit khác như β-carotene, lycopene, vitamin A, vitamin E, và coenzyme Q10 [24]. Cấu trúc hóa học của squalene (C30H50) [48] Trên thực tế, squalene là một chất trao đổi trung gian và là tiền chất của quá trình tổng hợp cholesterol. Trong cơ thể của con người, squalene được biến đổi thành cholesterol chứa lipoprotein tỷ trọng cao nhờ đó mà cholesterol tốt tăng lên và cholesterol xấu giảm đi. Tính chất hóa học của squalene Squalene không tan trong nước, tan ít trong rượu, axit axetic lạnh, tan vô hạn trong ete, ete dầu hỏa, aceton và các dung môi hòa tan chất béo khác.

Ở dạng tinh Nguyễn Cẩm Hà - K16 4 khiết, nó gần như không màu, không mùi, không vị. Ngoài ra, squalene hấp thụ oxy và trở nên sền sền trông gần giống như dầu hạt lanh (Bảng 1. Các thông số lý hóa của squalene (http://en.org/wiki/Squalene) Trạng thái Chất lỏng Nhiệt độ nóng chảy (độ C) -5 Điểm sôi (độ C) 429 Điểm chớp cháy (độ C) 254 Trọng lượng phân tử 410,73 Độ tan trong nước (g/l) Không tan trong nước Tỷ trọng tương đối (không khí =1) >1 Nhiệt độ bay hơi (kJ/mol) 65,8 Tỷ trọng hơi (không khí =1) 14,2 1. Con đƣờng sinh tổng hợp cholesterol Kể từ khi được phát hiện vào đầu thế kỉ XX, squalene đã được công nhận là mắt xích quan trọng trong con đường trao đổi chất, là một bước trung gian trong quá trình sinh tổng hợp cholesterol và tất cả các hormone steroit.

Cholesterol gắn với lipoprotein có trọng lượng phân tử thấp (LDL-C, Low Density Lipoprotein - Cholesterol) có hàm lượng cao là một nguy cơ đối với những người mắc bệnh tim. Statins là một trong những loại thuốc làm hạ cholesterol máu, có tác dụng ngăn chặn bệnh tim ở người bởi nó ức chế enzyme hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A reductase (HMG-CoA reductase) có vai trò xúc tác tạo ra cholesterol. Tuy nhiên, statins có thể gây ra tác dụng phụ ở một số bệnh nhân và đối với một phạm vi người nào đó thì nó lại không có hiệu quả. Thay thế cho statins, hiện nay, một số tác nhân làm giảm cholesterol bằng cách ức chế trực tiếp quá trình sinh tổng hợp squalene được cho là đầy hứa hẹn.

Squalene được chứng minh là một chất ức chế hoạt tính Nguyễn Cẩm Hà - K16 5 của nhóm HMG-CoA reductase và làm tăng hoạt động của Acyl CoA cholesterol acyltransferase [53]. Trong thực tế, tổng hợp nội sinh của squalene bắt đầu bằng việc sản xuất HMG-CoA. Giảm hàm lượng HMG-CoA sẽ kéo theo hình thành mevalonate [7]. Cholesterol được tổng hợp theo con đường mevalonate.

Sau các phản ứng sinh hóa, các nhóm prenyl được bổ sung, các phân tử của nhóm trung gian farnesyldiphosphate được tập hợp và giảm đi, kết quả là hình thành squalene.