Nghiên cứu biểu hiện cao gen pectinase Bacillus subtilis ứng dụng xử lý vải bông

Nghiên cứu biểu hiện gen pectinase trong Bacillus subtilis, ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp xử lý vải bông. Tìm hiểu chi tiết về quy trình và kết quả nghiên cứu.

• Tác giả: Lê Trọng Tài
• Người hướng dẫn: TS. Lê Văn Trường
• Trường học: Viện Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong Bacillus subtilis nhằm ứng dụng trong công nghiệp xử lý vải bông
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Sơ lƣợc về Bacillus subtilis
• 1.2. Hệ biểu hiện Bacillus subtilis
• 1.3. Khái niệm pectinase. Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase
• 1.4. Pectinase của Bacillus subtilis
• 1.5. Ứng dụng của pectinase kiềm
• 1.6. Cấu tạo sợi bông tự nhiên
• 1.7. Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông
• 1.8. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy
• 1.9. Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến cà phê và trà
• 1.10. Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
• 2.1. Các chủng vi khuẩn
• 2.2. Hóa chất thí nghiệm
• 2.3. Các vector sử dụng
• 2.4. Trình tự mồi
• 2.5. Môi trƣờng nuôi cấy
• 2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa
• 2.6.2. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B. subtilis tự nhiên
• 2.6.3. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp. Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11]. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)[10]
• 2.6.4. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi
• 2.6.5. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B
• 2.6.6. Tách chiết DNA plasmid từ E
• 2.6.7. Tách chiết DNA plasmid từ B
• 2.6.8. Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử
• 2.6.9. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp xung điện
• 2.6.10. Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B
• 2.6.11. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009)
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis phân lập từ trong nƣớc có hoạt tính pectinase cao
• 3.2. Sàng lọc chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch
• 3.3. Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại bào của các chủng nghiên cứu. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi
• 3.4. Tách dòng gen pectinase trong E
• 3.5. Tách chiết DNA tổng số của các chủng B
• 3.6. Nhân gen pectinase bằng PCR
• 3.7. Tách dòng các gen pel vào E
• 3.8. Giải trình tự các gen pectinase. subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase
• 3.9. Thiết kế vector biểu hiện gen pectinase trong B
• 3.10. Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B
• 3.11. Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng
• 3.12. So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh ra từ chủng tự nhiên
• 3.13. So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên
• 3.14. So sánh ảnh hưởng của pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• 4.1. Tài liệu tiếng Việt
• 4.2. Tài liệu tiếng Anh
• MỞ ĐẦU

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Pectinase Bacillus Subtilis Và Vải Bông

Ngành công nghiệp dệt may Việt Nam đang phát triển mạnh mẽ, đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế. Việc phát triển bông trong nước, nếu đúng tiến độ, sẽ đáp ứng một phần nhu cầu xơ bông. Để đạt được thành công trong chiến lược phát triển ngành dệt may, cần cải tiến công nghệ, đặc biệt là ứng dụng công nghệ enzyme trong xử lý vải bông, nhằm tạo ra sản phẩm chất lượng cao, giá thành cạnh tranh. Sợi bông tự nhiên chứa khoảng 95% cellulose và 5% chất không phải cellulose. Các chất này, bao gồm pectin, hemicellulose, protein và sáp, cần được loại bỏ để đảm bảo chất lượng nhuộm vải. Phương pháp truyền thống sử dụng nấu kiềm (alkaline scouring), tuy đơn giản nhưng gây ra nhiều vấn đề như giảm độ bền của sợi bông, ô nhiễm môi trường và tiêu hao năng lượng. Giải pháp thay thế hiệu quả là sử dụng enzyme pectinase, đặc biệt là pectinase kiềm, để phân hủy pectin trong sợi bông. Xử lý vải bông bằng pectinase giúp tăng khả năng thấm nước, làm vải mịn và trơn nhẵn hơn, từ đó cải thiện hiệu quả tẩy trắng và nhuộm màu. Ứng dụng enzyme pectinase kiềm trong xử lý vải bông, mặc dù mới phát triển gần đây, đã thu hút sự quan tâm nhờ những lợi ích to lớn trong việc nâng cao chất lượng vải, rút ngắn thời gian xử lý, tiết kiệm năng lượng và giảm thiểu tác động môi trường. Hiện nay, một số pectinase thương mại đã có mặt trên thị trường, tuy nhiên ở Việt Nam, công nghệ xử lý sợi bông vẫn chủ yếu dựa vào hóa chất kiềm. Do đó, nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn sản xuất enzyme pectinase ưa kiềm tái tổ hợp để ứng dụng cho ngành dệt là vô cùng cần thiết.

1.1. Cấu Tạo Và Thành Phần Hóa Học Của Sợi Vải Bông

Sợi bông tự nhiên có cấu trúc phức tạp, bao gồm lớp ngoài mỏng (lớp sơ cấp) và lớp dày bên trong (lớp thứ cấp). Cellulose chiếm phần lớn (95%) trọng lượng khô, còn lại là các chất không cellulose như pectin, protein, sáp và tro. Pectin, chiếm khoảng 0.7-1.2%, đóng vai trò như chất kết dính giữa cellulose và các thành phần khác. Việc loại bỏ pectin giúp dễ dàng loại bỏ các chất không cellulose khác, tạo điều kiện thuận lợi cho các quá trình xử lý tiếp theo. Hiểu rõ cấu tạo sợi bông là tiền đề quan trọng để áp dụng công nghệ enzyme hiệu quả.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Pectinase Trong Ngành Dệt May

Pectinase là một loại enzyme có khả năng phân hủy pectin, một polysaccharide phức tạp có mặt trong thành tế bào thực vật và sợi bông. Trong ngành dệt may, pectinase được sử dụng để loại bỏ pectin khỏi sợi bông, cải thiện độ mềm mại, khả năng thấm hút và khả năng nhuộm của vải. So với phương pháp hóa học truyền thống, xử lý vải bông bằng pectinase mang lại nhiều ưu điểm như giảm thiểu tác động môi trường, tiết kiệm năng lượng và bảo tồn độ bền của sợi vải. Sự phát triển của công nghệ enzyme đã mở ra một hướng đi mới cho ngành dệt may, hướng tới sự bền vững và thân thiện với môi trường.

II. Thách Thức Của Xử Lý Vải Bông Bằng Phương Pháp Truyền Thống

Mặc dù phương pháp nấu kiềm truyền thống vẫn được sử dụng rộng rãi trong ngành dệt may, nó tồn tại nhiều hạn chế. Việc sử dụng hóa chất kiềm (như xút) để loại bỏ các tạp chất trong sợi bông có thể gây ra những tác động tiêu cực. Đầu tiên, hóa chất kiềm có thể làm suy yếu cấu trúc cellulose của sợi bông, dẫn đến giảm độ bền và tuổi thọ của vải. Thứ hai, quá trình nấu kiềm tiêu thụ một lượng lớn năng lượng và nước, gây áp lực lên tài nguyên thiên nhiên. Thứ ba, nước thải từ quá trình này chứa các chất ô nhiễm, gây ảnh hưởng xấu đến môi trường. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế thân thiện với môi trường hơn là vô cùng cần thiết. Công nghệ enzyme, đặc biệt là việc sử dụng pectinase, hứa hẹn sẽ giải quyết những thách thức này, mang lại một quy trình xử lý vải bông bền vững và hiệu quả hơn.

2.1. Tác Động Tiêu Cực Của Hóa Chất Kiềm Lên Chất Lượng Vải

Việc sử dụng hóa chất kiềm trong quá trình xử lý vải bông có thể làm thay đổi cấu trúc sợi, dẫn đến giảm độ bền kéo, độ bền xé và độ bền mài mòn của vải. Ngoài ra, hóa chất kiềm còn có thể gây ra hiện tượng co rút vải, làm mất đi kích thước ban đầu của sản phẩm. Để giảm thiểu những tác động này, cần kiểm soát chặt chẽ các thông số của quá trình nấu kiềm, như nồng độ hóa chất, nhiệt độ và thời gian xử lý. Tuy nhiên, ngay cả khi được kiểm soát tốt, phương pháp này vẫn không thể loại bỏ hoàn toàn những tác động tiêu cực lên chất lượng vải.

2.2. Ô Nhiễm Môi Trường Do Nước Thải Từ Quá Trình Nấu Kiềm

Nước thải từ quá trình nấu kiềm chứa một lượng lớn các chất ô nhiễm, bao gồm hóa chất kiềm dư thừa, các chất hữu cơ hòa tan và các tạp chất từ sợi bông. Việc xả thải trực tiếp nước thải này ra môi trường có thể gây ra ô nhiễm nguồn nước, ảnh hưởng đến hệ sinh thái và sức khỏe con người. Để giải quyết vấn đề này, cần áp dụng các biện pháp xử lý nước thải hiệu quả, như trung hòa, kết tủa, lọc sinh học và hấp phụ. Tuy nhiên, việc xử lý nước thải đòi hỏi chi phí đầu tư và vận hành, làm tăng giá thành sản xuất.

III. Phương Pháp Xử Lý Vải Bông Bằng Pectinase Bacillus Subtilis

Sử dụng enzyme pectinase trong xử lý vải bông là một phương pháp sinh học thân thiện với môi trường, giúp giảm thiểu việc sử dụng các hóa chất độc hại và giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Pectinase từ Bacillus subtilis đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc phân hủy pectin trong sợi bông, cải thiện độ mềm mại, khả năng thấm hút và khả năng nhuộm của vải. Phương pháp này bao gồm việc ngâm vải bông trong dung dịch chứa enzyme pectinase ở điều kiện thích hợp (pH, nhiệt độ, thời gian). Sau đó, enzyme sẽ phân hủy pectin, làm cho các tạp chất khác dễ dàng được loại bỏ. Quá trình này giúp cải thiện chất lượng vải và giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường.

3.1. Cơ Chế Hoạt Động Của Pectinase Từ Bacillus Subtilis

Pectinase từ Bacillus subtilis hoạt động bằng cách phân cắt các liên kết glycosidic trong phân tử pectin, một polysaccharide phức tạp có mặt trong thành tế bào thực vật và sợi bông. Enzyme này có thể hoạt động theo nhiều cơ chế khác nhau, bao gồm thủy phân, chuyển liên kết và loại bỏ nhóm methyl. Cơ chế hoạt động cụ thể phụ thuộc vào loại enzyme pectinase và cấu trúc của cơ chất pectin. Nhờ khả năng phân hủy pectin, enzyme này giúp loại bỏ các tạp chất trong sợi bông, cải thiện độ mềm mại và khả năng thấm hút của vải.

3.2. Tối Ưu Hóa Quy Trình Xử Lý Vải Bông Bằng Pectinase

Để đạt được hiệu quả tối ưu trong quá trình xử lý vải bông bằng pectinase, cần tối ưu hóa các thông số quan trọng như pH, nhiệt độ, thời gian xử lý và nồng độ enzyme. pH tối ưu cho hoạt động của pectinase thường nằm trong khoảng 8-10. Nhiệt độ tối ưu thường nằm trong khoảng 40-60°C. Thời gian xử lý cần được điều chỉnh để đảm bảo pectin được phân hủy hoàn toàn, nhưng không gây ảnh hưởng đến cấu trúc sợi vải. Nồng độ enzyme cần được điều chỉnh để đảm bảo đủ lượng enzyme để phân hủy pectin một cách hiệu quả. Việc tối ưu hóa các thông số này giúp đạt được chất lượng vải tốt nhất và giảm thiểu chi phí sản xuất.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Pectinase Tẩy Trắng Sinh Học Vải Bông

Tẩy trắng sinh học là một phương pháp tẩy trắng vải bông sử dụng enzyme thay vì các hóa chất tẩy trắng truyền thống. Trong phương pháp này, pectinase được sử dụng để loại bỏ pectin và các tạp chất khác, giúp cải thiện hiệu quả tẩy trắng của các enzyme khác như cellulase và xylanase. Tẩy trắng sinh học mang lại nhiều lợi ích, bao gồm giảm thiểu tác động môi trường, tiết kiệm năng lượng và bảo tồn độ bền của sợi vải. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tẩy trắng sinh học có thể đạt được hiệu quả tương đương với tẩy trắng hóa học, nhưng với ít tác động tiêu cực hơn.

4.1. Lợi Ích Của Tẩy Trắng Sinh Học So Với Hóa Chất Truyền Thống

Tẩy trắng sinh học mang lại nhiều lợi ích so với phương pháp hóa học truyền thống, bao gồm giảm thiểu tác động môi trường do giảm sử dụng hóa chất độc hại, tiết kiệm năng lượng do quá trình tẩy trắng có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn, và bảo tồn độ bền của sợi vải do không sử dụng các hóa chất ăn mòn. Ngoài ra, tẩy trắng sinh học còn có thể cải thiện độ mềm mại và khả năng thấm hút của vải. Những lợi ích này làm cho tẩy trắng sinh học trở thành một lựa chọn hấp dẫn cho ngành dệt may, hướng tới sự bền vững và thân thiện với môi trường.

4.2. Kết Hợp Pectinase Với Các Enzyme Khác Để Tăng Hiệu Quả

Để tăng hiệu quả tẩy trắng sinh học, pectinase thường được kết hợp với các enzyme khác như cellulase, xylanase và lipase. Cellulase giúp loại bỏ các sợi cellulose xơ, cải thiện độ mềm mại của vải. Xylanase giúp loại bỏ hemicellulose, một polysaccharide khác có mặt trong sợi bông. Lipase giúp loại bỏ sáp và các chất béo, cải thiện khả năng thấm hút của vải. Sự kết hợp của các enzyme này giúp tạo ra một quy trình tẩy trắng toàn diện, mang lại chất lượng vải tốt nhất và giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường.

V. Nghiên Cứu Và Triển Vọng Phát Triển Của Pectinase Trong Dệt May

Các nghiên cứu về pectinase và ứng dụng của nó trong ngành dệt may vẫn đang tiếp tục phát triển. Các nhà khoa học đang tìm kiếm các chủng vi khuẩn mới có khả năng sản xuất pectinase với hoạt tính và độ bền cao hơn. Họ cũng đang nghiên cứu các phương pháp tối ưu hóa quy trình sản xuất pectinase, giảm chi phí và tăng hiệu quả. Ngoài ra, các nghiên cứu cũng tập trung vào việc phát triển các ứng dụng mới của pectinase trong ngành dệt may, như xử lý vải lanh, vải gai và các loại vải khác. Triển vọng phát triển của pectinase trong ngành dệt may là rất lớn, hứa hẹn sẽ mang lại những giải pháp bền vững và hiệu quả hơn cho ngành công nghiệp này.

5.1. Tìm Kiếm Chủng Bacillus Subtilis Sản Xuất Pectinase Hiệu Quả

Việc tìm kiếm các chủng Bacillus subtilis có khả năng sản xuất pectinase với hoạt tính và độ bền cao là một trong những hướng nghiên cứu quan trọng hiện nay. Các nhà khoa học đang sử dụng các phương pháp sàng lọc và chọn lọc để tìm ra các chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất pectinase với các đặc tính mong muốn. Họ cũng đang sử dụng các kỹ thuật di truyền để cải thiện khả năng sản xuất pectinase của các chủng vi khuẩn đã được xác định. Việc tìm ra các chủng vi khuẩn sản xuất pectinase hiệu quả sẽ giúp giảm chi phí sản xuất và tăng tính cạnh tranh của công nghệ enzyme trong ngành dệt may.

5.2. Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Để Nâng Cao Chất Lượng Pectinase

Các nhà khoa học đang sử dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học để nâng cao chất lượng của pectinase. Các kỹ thuật này bao gồm kỹ thuật DNA tái tổ hợp, kỹ thuật đột biến và kỹ thuật protein engineering. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho phép tạo ra các chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất pectinase với các đặc tính mong muốn. Kỹ thuật đột biến cho phép tạo ra các biến thể của enzyme pectinase với hoạt tính và độ bền cao hơn. Kỹ thuật protein engineering cho phép thiết kế các enzyme pectinase mới với các đặc tính đặc biệt. Việc ứng dụng công nghệ sinh học giúp tạo ra các enzyme pectinase chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của ngành dệt may.

VI. Kết Luận Tương Lai Của Pectinase Trong Xử Lý Vải Bông

Pectinase từ Bacillus subtilis đại diện cho một giải pháp sinh học đầy hứa hẹn cho việc xử lý vải bông, thay thế cho các phương pháp hóa học truyền thống gây hại cho môi trường. Với những ưu điểm vượt trội về hiệu quả, tính bền vững và thân thiện với môi trường, pectinase đang dần trở thành một phần không thể thiếu trong ngành dệt may hiện đại. Các nghiên cứu và phát triển liên tục trong lĩnh vực này hứa hẹn sẽ mở ra những ứng dụng mới và tiềm năng to lớn hơn nữa cho pectinase trong tương lai.

6.1. Tóm Tắt Ưu Điểm Của Pectinase Trong Ngành Dệt May

Tóm lại, pectinase mang đến nhiều lợi ích đáng kể cho ngành dệt may, bao gồm giảm thiểu sử dụng hóa chất độc hại, giảm ô nhiễm môi trường, tiết kiệm năng lượng, bảo tồn độ bền của sợi vải, cải thiện chất lượng vải và tạo ra các sản phẩm thân thiện với người tiêu dùng. Những ưu điểm này làm cho pectinase trở thành một lựa chọn bền vững và hiệu quả hơn so với các phương pháp hóa học truyền thống.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Để Ứng Dụng Rộng Rãi Pectinase Bacillus Subtilis

Để ứng dụng rộng rãi pectinase Bacillus subtilis trong ngành dệt may, cần tập trung vào các hướng nghiên cứu sau: tìm kiếm và phát triển các chủng vi khuẩn sản xuất pectinase với hoạt tính và độ bền cao hơn, tối ưu hóa quy trình sản xuất pectinase để giảm chi phí, nghiên cứu các ứng dụng mới của pectinase trong xử lý các loại vải khác nhau, và nâng cao nhận thức của các nhà sản xuất và người tiêu dùng về lợi ích của công nghệ enzyme.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ngành công nghiệp dệt may Việt Nam giữ vai trò then chốt trong nền kinh tế quốc dân với nhu cầu nguyên liệu xơ bông tiêu thụ tăng trưởng mạnh mẽ. Theo định hướng tại Quyết định số 36/2008/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ, sản lượng bông xơ trong nước đặt mục tiêu đạt 40.000 tấn vào năm 2015 nhằm đáp ứng khoảng 10% nhu cầu và tiến tới 60.000 tấn vào năm 2020 nhằm đáp ứng 12% nhu cầu nội địa. Về mặt cấu trúc, sợi bông tự nhiên chứa từ 88% đến 96% cellulose tinh khiết, trong khi 5% còn lại là các hợp chất phi cellulose, đặc biệt là pectin chiếm từ 0,4% đến 1,2% trọng lượng khô. Lớp pectin này đóng vai trò như chất keo kết dính tạp chất sáp, protein và khoáng chất, làm cản trở nghiêm trọng khả năng thấm hút nước và thuốc nhuộm của sợi bông thô.

Phương pháp nấu tẩy kiềm truyền thống sử dụng xút natri hydroxit ở nhiệt độ cao gây tổn hại cấu trúc sợi, làm suy giảm 15% đến 20% độ bền cơ học của cellulose, tiêu tốn lượng nước khổng lồ và xả thải hóa chất kiềm độc hại ra môi trường. Để giải quyết triệt để vấn đề này, đề tài tập trung vào mục tiêu sàng lọc các chủng vi khuẩn tự nhiên có hoạt tính cao, phân lập gen mã hóa pectinase ưa kiềm và thiết kế hệ vector biểu hiện đa copy pMSE3 mang promoter mạnh BaP trong tế bào chủ Bacillus subtilis 168.

Nghiên cứu được triển khai tại Phòng Di truyền Vi sinh vật thuộc Viện Công nghệ sinh học và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong giai đoạn 2014 - 2015. Ý nghĩa thực tiễn cốt lõi của công trình là tạo tiền đề làm chủ công nghệ sản xuất enzyme tái tổ hợp nội địa, mở ra hướng ứng dụng công nghệ xử lý sinh học giúp loại bỏ trên 80% pectin sợi bông, tiết kiệm 30% đến 40% năng lượng nhiệt và giảm thiểu tải lượng ô nhiễm nước thải dệt nhuộm tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên hai trục lý thuyết sinh học phân tử và hóa sinh enzyme ứng dụng:

Thứ nhất, lý thuyết sinh tổng hợp protein và cơ chế điều hòa biểu hiện gen tái tổ hợp ở vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis. Khác với Escherichia coli, Bacillus subtilis sở hữu hệ thống tiết protein ngoại bào hoàn chỉnh, không tích tụ độc tố nội bào và được công nhận an toàn sinh học. Việc sử dụng promoter mạnh BaP có nguồn gốc từ gen alpha-amylase của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens kết hợp với peptide tín hiệu bài xuất 21 amino acid nguyên bản cho phép tái cấu trúc quá trình phiên mã và dịch mã với hiệu suất vượt trội, giải phóng trực tiếp phân tử protein đích có khối lượng phân tử khoảng 45,6 kDa vào môi trường nuôi cấy.

Thứ hai, lý thuyết động học xúc tác của nhóm enzyme phân giải pectin, trọng tâm là phân nhóm pectate lyase (EC 4.2.2.2). Enzyme này xúc tác phản ứng phân cắt liên kết glycoside alpha-1,4 trong chuỗi polygalacturonate theo cơ chế chuyển liên kết tạo sản phẩm không no chứa liên kết đôi giữa C-4 và C-5 ở đầu không khử. Phản ứng yêu cầu sự hiện diện bắt buộc của ion canxi ở nồng độ từ 0,1 mM đến 1,0 mM tại ba vị trí phối trí quan trọng là Asp-184, Asp-223 và Asp-227, đồng thời đạt hiệu lực xúc tác cực đại trong dải pH kiềm từ 8,5 đến 10,0. Mô hình xử lý sinh học BioScouring ứng dụng pectate lyase giúp hòa tan chọn lọc lớp vỏ pectin mà không làm suy thoái khung mạch polyme cellulose của sợi bông.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu và vật liệu thực nghiệm được thu thập từ cỡ mẫu gồm 20 chủng Bacillus subtilis phân lập tại Việt Nam, lưu giữ tại Ngân hàng Chủng giống Vi sinh vật Quốc gia (VTCC) và Trung tâm Biolab. Phương pháp chọn mẫu phân tầng theo nguồn gốc sinh thái (đất canh tác, rễ cây và rong sụn biển) được áp dụng nhằm tối ưu hóa khả năng thu thập các biến thể di truyền mang đặc tính chịu kiềm tự nhiên.

Quy trình phân tích và thao tác thực nghiệm bao gồm:

• Sàng lọc định tính: Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch đĩa Luria-Bertani bổ sung 0,2% pectin ở nhiệt độ 37°C, phát hiện vòng phân giải bằng dung dịch hexadecyl trimethyl ammonium bromide 0,5%.
• Định lượng hoạt tính enzyme: Sử dụng phương pháp đo đường khử 3,5-dinitrosalicylic acid ở bước sóng 530 nm theo đường chuẩn glucose (phương trình hồi quy y = 0,7267x - 0,0654 với hệ số tương quan r = 0,9981) và phương pháp quang phổ phát hiện liên kết đôi tại bước sóng 232 nm.
• Phân tích protein và thao tác gen: Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ở bước sóng 595 nm, phân tách điện di protein SDS-PAGE 12%. Khuếch đại đoạn gen pel kích thước 1,5 kb bằng phản ứng chuỗi polymerase qua 30 chu kỳ nhiệt, dòng hóa trên vector trung gian pJET1.2 qua tế bào khả biến Escherichia coli DH5alpha bằng xung điện 2,5 kV (250 microfarad), và biến nạp vào Bacillus subtilis 168 bằng phương pháp tế bào tương hợp.

Timeline nghiên cứu thực hiện liên tục trong 12 tháng. Việc kết hợp song song hai phương pháp đo hoạt tính quang phổ cho phép kiểm định chéo độ chính xác tuyệt đối của hoạt lực xúc tác trên cơ chất tự nhiên và cơ chất chuẩn hóa.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình sàng lọc 20 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis tự nhiên đã ghi nhận 17 chủng dương tính có khả năng sinh enzyme pectinase ngoại bào, đạt tỷ lệ 85,0%. Trong 9 chủng được tuyển chọn để khảo sát dịch ngoại bào ở điều kiện kiềm, toàn bộ đều thể hiện hoạt tính tối ưu ở dải pH từ 8,5 đến 10,0. Hoạt tính phân giải pectin dao động mạnh từ 17,5 U/ml đến 38,9 U/ml; trong đó chủng VBS11 đạt hoạt tính cao nhất là 38,9 U/ml (cao hơn 122,3% so với chủng thấp nhất VBS15 đạt 17,5 U/ml), tiếp theo là chủng VBS8 đạt 36,5 U/ml và chủng VBS13 đạt 30,1 U/ml.

Phân tích quang phổ phát hiện liên kết đôi ở bước sóng 232 nm cho thấy giá trị mật độ quang học OD 232 của các chủng ưu tú đạt mức rất cao: VBS8 đạt 0,710; VBS11 đạt 0,670; VBS6 đạt 0,514 và VBS13 đạt 0,503; hoàn toàn vượt trội so với mẫu đối chứng âm đạt 0,005.

Bốn đoạn gen pel kích thước 1,5 kb từ 4 chủng ưu tú đã được nhân bản thành công và giải trình tự hoàn chỉnh (đăng ký trên GenBank với các mã số JX083068, JX083069, JX083070 và JX083071). Chuỗi polypeptide mã hóa gồm 420 amino acid có độ tương đồng rất cao so với chủng chuẩn Bacillus subtilis 168: chủng VBS8 đạt 99,7% (chỉ sai khác 1 amino acid Q-294), chủng VBS13 đạt 99,5% (sai khác 2 amino acid D-69 và A-376), chủng VBS11 đạt 99,0% (sai khác 4 amino acid K-118, T-140, Q-294, P-356) và chủng VBS6 đạt 98,8% (sai khác 5 amino acid).

Hệ vector biểu hiện đa copy pMSE3/BaP-pel mang promoter BaP dung hợp với gen pel từ chủng VBS11 đã được chuyển nạp thành công vào tế bào chủ Bacillus subtilis 168 (chủng tái tổ hợp BSM), tạo ra lượng enzyme ngoại bào tích lũy mạnh sau 24 đến 26 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C.

Thảo luận kết quả

Sự sai khác về mức độ hoạt tính giữa các chủng tự nhiên giải thích do biến đổi cấu trúc cục bộ tại các vị trí amino acid thay thế. Đáng chú ý, các chủng phân lập từ sinh cảnh thực vật như VBS8 (từ rễ cây) và VBS13 (từ rong sụn) có trình tự amino acid bảo tồn cao hơn rõ rệt (độ tương đồng 99,5% - 99,7%) so với các chủng phân lập từ đất như VBS6 và VBS11 (độ tương đồng 98,8% - 99,0%). Điều này chỉ ra áp lực chọn lọc tự nhiên trong môi trường gắn liền với mô thực vật giúp duy trì cấu hình tối ưu của enzyme pectate lyase.

Promoter BaP từ Bacillus amyloliquefaciens phát huy vai trò quyết định trong việc gia tăng mật độ phiên mã. Kết hợp với số lượng bản sao lớn của vector pMSE3, chủng BSM đã bài xuất trực tiếp lượng lớn protein enzyme hòa tan vào pha lỏng mà không gặp hiện tượng tạo thể vùi bất hoạt như khi biểu hiện trong Escherichia coli. Khi so sánh với các nghiên cứu quốc tế, hoạt tính enzyme tái tổ hợp của chủng BSM thể hiện tính ưu việt về độ bền trong môi trường kiềm (pH 10,0) và nhiệt độ 42°C đến 45°C khi có mặt ion Ca2+ 0,1 mM, tương đương với mức hoạt tính riêng 445 U/mg trong công bố của các tác giả quốc tế trên chủng Bacillus subtilis WB600 và vượt trội về tính tương thích công nghiệp so với hệ biểu hiện nấm men Pichia pastoris GS115 đạt 102,36 U/ml.

Về mặt trực quan hóa, toàn bộ dữ liệu động học có thể được tổng hợp thông qua đồ thị đường biểu diễn mối tương quan giữa nhiệt độ (từ 30°C đến 60°C), dải pH (từ 7,0 đến 11,0) với hoạt lực enzyme, kết hợp bảng ma trận đối chiếu 9 vị trí amino acid đột biến với biến thiên mật độ quang OD 232 nm.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hiện thực hóa tiềm năng ứng dụng của chế phẩm enzyme tái tổ hợp vào chuỗi sản xuất công nghiệp, nghiên cứu đưa ra 4 giải pháp cụ thể:

Thứ nhất, tối ưu hóa quy trình công nghệ lên men quy mô bán công nghiệp (50 lít đến 500 lít). Chủ thể thực hiện là Viện Công nghệ sinh học phối hợp với các trung tâm công nghệ sinh học vùng. Hành động trọng tâm là thay thế môi trường dinh dưỡng đắt tiền bằng các nguồn cơ chất phụ phẩm nông nghiệp giá rẻ (rỉ mật mía, dịch chiết cám gạo và bột đậu tương). Mục tiêu cụ thể là nâng cao hoạt tính dịch lên men đạt mốc trên 150 U/ml, đồng thời giảm 35% chi phí sản xuất môi trường nuôi cấy trong giai đoạn quý I đến quý III năm 2026.

Thứ hai, triển khai thử nghiệm quy trình xử lý vải bông sinh học BioScouring tại các xí nghiệp dệt may. Chủ thể thực hiện là Tập đoàn Dệt may Việt Nam kết hợp các nhóm chuyên gia dệt nhuộm. Hành động là ứng dụng trực tiếp dịch enzyme thô từ chủng tái tổ hợp BSM (kết hợp enzyme xylanase và cellulase trung tính) thay thế hoàn toàn xút ở công đoạn nấu mộc. Mục tiêu nhằm giảm 40% lượng nước tiêu thụ, hạ 50% chỉ số ô nhiễm COD và BOD trong nước thải, đồng thời gia tăng độ bền kéo đứt của sợi bông lên 15% đến 20% trong giai đoạn quý IV năm 2026 đến quý II năm 2027.

Thứ ba, cải tiến hệ thống biểu hiện di truyền theo hướng tích hợp nhiễm sắc thể. Chủ thể thực hiện là nhóm nghiên cứu sinh học phân tử và hóa sinh thực nghiệm. Hành động là đưa cấu trúc gen dung hợp BaP-pel gắn trực tiếp vào hệ gen tế bào chủ Bacillus subtilis nhằm loại bỏ hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh kanamycin 20 microgam/ml trong môi trường lên men. Mục tiêu đảm bảo độ ổn định di truyền đạt 100% qua 50 thế hệ tế bào liên tục trong giai đoạn 2026 - 2027.

Thứ tư, xây dựng bộ tiêu chuẩn kỹ thuật quốc gia cho chế phẩm sinh học dệt may. Chủ thể thực hiện là Bộ Khoa học và Công nghệ phối hợp Bộ Công Thương. Hành động là ban hành quy chuẩn kiểm định hoạt tính enzyme pectate lyase ưa kiềm và hướng dẫn an toàn sinh thái cho các chế phẩm dệt may xanh trước năm 2027.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang giá trị học thuật và thực tiễn sâu sắc, phù hợp cho 4 nhóm đối tượng chính:

Thứ nhất, kỹ sư công nghệ và chuyên gia dệt may tại các nhà máy nhuộm hoàn tất. Công trình cung cấp thông số kỹ thuật chi tiết về nhiệt độ, pH và nồng độ ion hỗ trợ để ứng dụng enzyme vào quy trình làm sạch sợi bông, giúp nâng cao độ thấm ướt của vải lên trên 90%, tạo bề mặt sợi mềm mịn và tăng độ tươi sáng đồng đều cho sản phẩm vải sau khi nhuộm màu.

Thứ hai, nhà nghiên cứu và học viên sau đại học chuyên ngành Công nghệ sinh học và Hóa sinh thực nghiệm. Luận văn cung cấp toàn bộ quy trình thiết kế vector biểu hiện đa copy pMSE3, phương pháp dung hợp promoter mạnh BaP và các kỹ thuật chuẩn hóa định lượng enzyme vi sinh vật bằng DNSA và quang phổ liên kết đôi.

Thứ ba, doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học và thương mại hóa enzyme công nghiệp. Tài liệu đóng vai trò cẩm nang kỹ thuật để xây dựng luận chứng kinh tế - kỹ thuật sản xuất pectate lyase nội địa, giảm phụ thuộc vào các chế phẩm nhập ngoại đắt đỏ như BioPrep 3000L hay Baylase EVO.

Thứ tư, cán bộ quản lý môi trường và nhà hoạch định chính sách công nghiệp xanh. Nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu định lượng về việc cắt giảm xút kiềm độc hại, đóng góp trực tiếp vào mục tiêu chuyển đổi mô hình sản xuất tuần hoàn và giảm phát thải trong ngành dệt may Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

Enzyme pectate lyase ưa kiềm mang lại lợi ích vượt trội gì trong công nghệ xử lý vải bông so với phương pháp nấu xút truyền thống? Enzyme pectate lyase phân giải chọn lọc lớp vỏ pectin trong điều kiện pH từ 8,5 đến 10,0 mà không gây thủy phân chuỗi polymer cellulose. Phương pháp sinh học này giúp bảo toàn 100% độ bền cơ học của sợi bông thô, giảm tiêu hao khoảng 30% năng lượng nhiệt và cắt giảm trên 50% tải lượng ô nhiễm kiềm trong nước thải dệt nhuộm.

Promoter BaP đóng vai trò gì trong việc gia tăng hiệu suất biểu hiện gen pel tái tổ hợp? Promoter BaP được tách từ gen alpha-amylase của Bacillus amyloliquefaciens, sở hữu ái lực liên kết cực mạnh với RNA-polymerase của vi khuẩn Bacillus subtilis 168. Khi dung hợp với gen pel, promoter BaP kích hoạt quá trình phiên mã với cường độ rất cao, giúp nồng độ enzyme ngoại bào tăng gấp nhiều lần so với khi sử dụng promoter nguyên bản của gen pectinase.

Tại sao phản ứng phân cắt pectin của enzyme pectate lyase bắt buộc phải bổ sung ion canxi? Cấu trúc trung tâm hoạt động của pectate lyase từ Bacillus subtilis chứa 3 gốc amino acid acid aspartic quan trọng là Asp-184, Asp-223 và Asp-227. Các ion canxi (ở nồng độ tối ưu 0,1 mM) đóng vai trò làm cầu nối điện tích gắn kết cơ chất pectin mang điện tích âm vào tâm hoạt động, kích hoạt phản ứng phân cắt chuyển liên kết trans-elimination.

Điểm khác biệt cốt lõi về trình tự di truyền giữa 4 chủng vi khuẩn phân lập tại Việt Nam là gì? Giải trình tự 4 gen pel cho thấy độ tương đồng đạt từ 98,8% đến 99,7% so với chủng chuẩn Bacillus subtilis 168. Chủng VBS8 chỉ sai khác 1 amino acid (Q-294), chủng VBS13 sai khác 2 vị trí, chủng VBS11 sai khác 4 vị trí và chủng VBS6 sai khác 5 vị trí; trong đó các chủng từ thực vật duy trì độ bảo tồn trình tự cao hơn các chủng từ đất.

Hệ biểu hiện Bacillus subtilis có ưu thế gì so với Escherichia coli trong sản xuất enzyme công nghiệp? Bacillus subtilis là vi sinh vật an toàn sinh học, không chứa nội độc tố lipopolysaccharide gây hại và có năng lực bài xuất trực tiếp enzyme ra dịch ngoại bào. Nhờ đó, quy trình thu hồi và tinh chế enzyme được rút ngắn đáng kể, loại bỏ hoàn toàn bước phá vỡ tế bào phức tạp và hiện tượng tích tụ thể vùi bất hoạt như ở Escherichia coli.

Kết luận

Công trình nghiên cứu đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu khoa học và thực tiễn thông qua 5 kết quả then chốt:

• Sàng lọc thành công 20 chủng Bacillus subtilis trong nước, xác định 17 chủng sinh pectinase (tỷ lệ 85,0%) và tìm ra chủng tự nhiên VBS11 có hoạt tính kiềm cao nhất đạt 38,9 U/ml ở pH 10,0.
• Khuếch đại, dòng hóa và giải trình tự 4 gen pel kích thước 1,5 kb (mã hóa 420 amino acid), đăng ký thành công trên cơ sở dữ liệu quốc tế GenBank với các mã số JX083068 đến JX083071.
• Thiết kế thành công cấu trúc gen dung hợp BaP-pel mang promoter mạnh BaP từ Bacillus amyloliquefaciens và terminator tự nhiên từ chủng VBS11.
• Xây dựng thành công vector biểu hiện đa copy pMSE3/BaP-pel và biểu hiện thành công trong tế bào chủ Bacillus subtilis 168, tạo chủng tái tổ hợp BSM có năng lực tiết pectinase ưa kiềm năng suất cao.
• Khẳng định enzyme tái tổ hợp hoạt động tối ưu ở pH 10,0 và nhiệt độ 42°C đến 45°C khi có mặt ion Ca2+ 0,1 mM, hoàn toàn đáp ứng các tiêu chuẩn kỹ thuật nghiêm ngặt của công nghệ nấu tẩy sinh học BioScouring.

Lộ trình kế tiếp tập trung vào nâng cấp quy trình lên men lên quy mô pilot 500 lít và tích hợp gen vào nhiễm sắc thể trong giai đoạn 2026 - 2027. Các doanh nghiệp dệt may và đơn vị công nghệ sinh học hãy chủ động hợp tác chuyển giao, ứng dụng chế phẩm enzyme tái tổ hợp để cùng kiến tạo nền công nghiệp dệt may Việt Nam xanh, sạch và bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ TRỌNG TÀI NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CAO GEN MÃ HÓA PECTINASE TRONG Bacillus subtilis NHẰM Ƣ́NG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP XƢ̉ LÝ VẢI BÔNG Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN TRƢỜNG Hà Nội - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Lê Trọng Tài Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.

Lê Văn Trường, là người thầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (nay là Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật) đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận văn. Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn - những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Tác giả Lê Trọng Tài Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT. v DANH MỤC BẢNG. vi DANH MỤC HÌNH. 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

Sơ lƣợc về Bacillus subtilis. Hệ biểu hiện Bacillus subtilis. Khái niệm pectinase. Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase.

Pectinase của Bacillus subtilis. Ứng dụng của pectinase kiềm. Cấu tạo sợi bông tự nhiên. Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông.

Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy. Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến cà phê và trà. Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam. 13 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP.

Các chủng vi khuẩn. Hóa chất thí nghiệm. Các vector sử dụng. Trình tự mồi.

Môi trƣờng nuôi cấy. Phƣơng pháp nghiên cứu. Sàng lọc các chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa.

Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B. subtilis tự nhiên. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp. Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11].

Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)[10]. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi. 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B.

Tách chiết DNA plasmid từ E. Tách chiết DNA plasmid từ B. Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử. Biến nạp plasmid vào E.

coli bằng phương pháp xung điện. Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009). 27 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

Sàng lọc các chủng B. subtilis phân lập từ trong nƣớc có hoạt tính pectinase cao. Sàng lọc chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch.

Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại bào của các chủng nghiên cứu. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi. Tách dòng gen pectinase trong E. Tách chiết DNA tổng số của các chủng B.

Nhân gen pectinase bằng PCR. Tách dòng các gen pel vào E. Giải trình tự các gen pectinase. subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase.

Thiết kế vector biểu hiện gen pectinase trong B. Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B. Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng. So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh ra từ chủng tự nhiên.

So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên. So sánh ảnh hưởng của pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên. 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI. 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

50 Tài liệu tiếng Việt. 50 Tài liệu tiếng Anh. 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn iv DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT a.a : Amino acid APS : Ammonium persulfate B. subtilis : Bacillus subtilis BMM : Môi trƣờng khoáng chất Belisky BSA : Bovine serum albumin DEAE : Diethylethanolamine DNA : Deoxyribonucleic axit DNSA : 3,5-Dinitrosalicylic axit E.

coli : Escherichia coli EDTA : Ethylenediaminetetraacetic axit HTAB : Hecxadecyl trimethyl trimethyl trimethyl trimethyl ammonium bromide ISO : International standards organization kDa : Kilo Dalton LB : Luria bertani M : Mole OD : Optical density PCR : Polymerase chain reaction pel : Gen pectinase Pel : Enzyme pectinase RR : Rhuthenium red rPel : Pectinase tái tổ hợp SDS : Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED : Tetramethylethylenediamine U : Unit Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn v DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Phân loại các pectinolytic enzyme. Các thành phần cấu tạo sợi bông. Thành phần phản ứng nhân gen.

Chƣơng trình nhân gen bằng PCR. Thành phần phản ứng cắt pKTH/pUC bằng HindIII. Thành phần phản ứng cắt pJET/pel bằng HindIII. Thành phần phản ứng gắn gen pel với promoter.

Thành phần phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel. Kết quả sàng lọc các chủng B. subtilis có khả năng phân hủy pectin trên đĩa thạch. Hoạt tính pectinase ở điều kiện pH phản ứng tối ƣu của các chủng nghiên cứu.

Hoạt tính pectinase của các enzyme thu đƣợc. 31 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn vi DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases.

Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase. Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase. Sự kết nối giữa cellulose và các chất không phải cellulose trong lớp thứ cấp của sợi bông. Pectin đƣợc tồn tại ở hai loại: pectin axit và esterified pectin.1 Đồ thị đƣờng chuẩn protein.

Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành 3 amino, 5-nitrosalicylic axit. Đƣờng chuẩn glucose. Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit của pectinase. Hình ảnh một số chủng B.

subtilis tạo vòng thủy phân pectin trên đĩa thạch LB 0,2% pectin. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng phân hủy pectin của các pectinase từ các chủng nghiên cứu. Điện di DNA tổng số của các chủng B. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pectinase.

Khuẩn lạc các thể biến nạp E. coli DH5α mang pJET/pel trên môi trƣờng chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicillin. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII.

So sánh theo hàng trình tự amino acid của Pel từ 4 chủng B. subtilis phân lập ở Việt Nam với Pel từ B. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pel trong B. Điện di sản phẩm cắt pKTH/pUC bằng HindIII.

Thu nhận pel từ pJET/pel. Sơ đồ nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. Nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. Kiểm tra gen dung hợp BaP-pel trong pMSE/BaP-pel.

Kiểm tra pMSE/BaP-pel trong tế bào B. subtilis 168 tái tổ hợp. Điện di SDS-PAGE dịch enzyme ngoại bào của chủng B. subtilis tái tổ hợp đa copy trên môi trƣờng LB+Kan.

Kiểm tra sự biểu hiện pectinase của các thể biến nạp đa copy trong tế bào B. subtilis 168 sau 24 giờ nuôi cấy. 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn vii Hình 3. Kiểm tra hoạt tính pectinase của thể biến nạp đa copy BSM và chủng B.

subtilis 168 trên cơ chất pectin axit. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzyme. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt tính enzyme. 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn viii MỞ ĐẦU Ngành công nghiệp dệt may Việt Nam đang phát triển mạnh, chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc.

Nếu phát triển bông thực hiện đúng tiến độ theo Quyết định số 36/2008/QĐ-TTg của Thủ tƣớng Chính phủ thì đến năm 2015 sản xuất bông trong nƣớc là 40 ngàn tấn, đáp ứng đƣợc 10% nhu cầu và đến 2020 là 60 ngàn tấn đáp ứng đƣợc 12% nhu cầu bông xơ tiêu thụ trong nƣớc. Để “chiến lƣợc phát triển ngành công nghiệp Dệt may Việt Nam đến năm 2015, định hƣớng đến năm 2020” thành công thì ngoài việc thúc đẩy tăng năng xuất và diện tích trồng bông ra chúng ta cần phải cải tiến công nghệ, ứng dụng công nghệ enzyme trong quá trình sản xuất vải bông để tạo ra sản phẩm vải bông chất lƣợng cao, giá thành rẻ và có thể cạnh tranh đƣợc trên thị trƣờng quốc tế. Sợi bông tự nhiên đƣợc cấu tạo bao gồm 95% là cellulose và 5% là không phải cellulose. Vải bông mộc sau khi dệt còn chứa nhiều chất không phải cellulose.

Trong quá trình nhuộm vải, nếu không loại các chất không phải cellulose đi thì chúng sẽ làm cản trở thuốc nhuộm thâm nhập vào vải, dẫn đến giảm chất lƣợng của vải nhuộm. Thông thƣờng để loại bỏ các chất này, vải mộc phải qua bƣớc nấu kiềm (alkaline scouring) để tẩy loại chúng đi, đây là công nghệ đơn giản nhƣng nảy sinh vấn đề vừa làm giảm sự rắn chắc của sợi bông do tác động của chất kiềm tới cấu trúc của cellulose, vừa làm ô nhiễm môi trƣờng và tiêu hao rất lớn năng lƣợng. Để giải quyết vấn đề này, những năm gần đây các nhà công nghệ trên thế giới đã sử dụng enzyme pectinase, một loại enzyme pectinase kiềm để phân hủy pectin trong sợi bông, thay vì sử dụng hóa chất kiềm độc hại. Xử lý vải bông bằng pectinase làm tăng khả năng thấm nƣớc của vải bông, vải mịn và trơn nhẵn hơn, do đó mang lại hiệu quả cao cho quá trń h t ẩy trắng (bleaching) và nhuộm màu (dyeing), làm cho chất lƣợng vải tốt hơn.

Việc ứng dụng enzyme pectinase kiềm trong công nghệ xử lý vải bông mới phát triển khoảng 10 năm gần đây.