Nghiên cứu biểu hiện cao gen pectinase Bacillus subtilis ứng dụng xử lý vải bông

Nghiên cứu biểu hiện gen pectinase trong Bacillus subtilis, ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp xử lý vải bông. Tìm hiểu chi tiết về quy trình và kết quả nghiên cứu.

• Tác giả: Lê Trọng Tài
• Người hướng dẫn: TS. Lê Văn Trường
• Trường học: Viện Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong Bacillus subtilis nhằm ứng dụng trong công nghiệp xử lý vải bông
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Sơ lƣợc về Bacillus subtilis
• 1.2. Hệ biểu hiện Bacillus subtilis
• 1.3. Khái niệm pectinase. Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase
• 1.4. Pectinase của Bacillus subtilis
• 1.5. Ứng dụng của pectinase kiềm
• 1.6. Cấu tạo sợi bông tự nhiên
• 1.7. Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông
• 1.8. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy
• 1.9. Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến cà phê và trà
• 1.10. Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
• 2.1. Các chủng vi khuẩn
• 2.2. Hóa chất thí nghiệm
• 2.3. Các vector sử dụng
• 2.4. Trình tự mồi
• 2.5. Môi trƣờng nuôi cấy
• 2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa
• 2.6.2. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B. subtilis tự nhiên
• 2.6.3. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp. Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11]. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)[10]
• 2.6.4. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi
• 2.6.5. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B
• 2.6.6. Tách chiết DNA plasmid từ E
• 2.6.7. Tách chiết DNA plasmid từ B
• 2.6.8. Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử
• 2.6.9. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp xung điện
• 2.6.10. Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B
• 2.6.11. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009)
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis phân lập từ trong nƣớc có hoạt tính pectinase cao
• 3.2. Sàng lọc chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch
• 3.3. Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại bào của các chủng nghiên cứu. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi
• 3.4. Tách dòng gen pectinase trong E
• 3.5. Tách chiết DNA tổng số của các chủng B
• 3.6. Nhân gen pectinase bằng PCR
• 3.7. Tách dòng các gen pel vào E
• 3.8. Giải trình tự các gen pectinase. subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase
• 3.9. Thiết kế vector biểu hiện gen pectinase trong B
• 3.10. Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B
• 3.11. Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng
• 3.12. So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh ra từ chủng tự nhiên
• 3.13. So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên
• 3.14. So sánh ảnh hưởng của pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• 4.1. Tài liệu tiếng Việt
• 4.2. Tài liệu tiếng Anh
• MỞ ĐẦU

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Pectinase Bacillus Subtilis Và Vải Bông

Ngành công nghiệp dệt may Việt Nam đang phát triển mạnh mẽ, đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế. Việc phát triển bông trong nước, nếu đúng tiến độ, sẽ đáp ứng một phần nhu cầu xơ bông. Để đạt được thành công trong chiến lược phát triển ngành dệt may, cần cải tiến công nghệ, đặc biệt là ứng dụng công nghệ enzyme trong xử lý vải bông, nhằm tạo ra sản phẩm chất lượng cao, giá thành cạnh tranh. Sợi bông tự nhiên chứa khoảng 95% cellulose và 5% chất không phải cellulose. Các chất này, bao gồm pectin, hemicellulose, protein và sáp, cần được loại bỏ để đảm bảo chất lượng nhuộm vải. Phương pháp truyền thống sử dụng nấu kiềm (alkaline scouring), tuy đơn giản nhưng gây ra nhiều vấn đề như giảm độ bền của sợi bông, ô nhiễm môi trường và tiêu hao năng lượng. Giải pháp thay thế hiệu quả là sử dụng enzyme pectinase, đặc biệt là pectinase kiềm, để phân hủy pectin trong sợi bông. Xử lý vải bông bằng pectinase giúp tăng khả năng thấm nước, làm vải mịn và trơn nhẵn hơn, từ đó cải thiện hiệu quả tẩy trắng và nhuộm màu. Ứng dụng enzyme pectinase kiềm trong xử lý vải bông, mặc dù mới phát triển gần đây, đã thu hút sự quan tâm nhờ những lợi ích to lớn trong việc nâng cao chất lượng vải, rút ngắn thời gian xử lý, tiết kiệm năng lượng và giảm thiểu tác động môi trường. Hiện nay, một số pectinase thương mại đã có mặt trên thị trường, tuy nhiên ở Việt Nam, công nghệ xử lý sợi bông vẫn chủ yếu dựa vào hóa chất kiềm. Do đó, nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn sản xuất enzyme pectinase ưa kiềm tái tổ hợp để ứng dụng cho ngành dệt là vô cùng cần thiết.

1.1. Cấu Tạo Và Thành Phần Hóa Học Của Sợi Vải Bông

Sợi bông tự nhiên có cấu trúc phức tạp, bao gồm lớp ngoài mỏng (lớp sơ cấp) và lớp dày bên trong (lớp thứ cấp). Cellulose chiếm phần lớn (95%) trọng lượng khô, còn lại là các chất không cellulose như pectin, protein, sáp và tro. Pectin, chiếm khoảng 0.7-1.2%, đóng vai trò như chất kết dính giữa cellulose và các thành phần khác. Việc loại bỏ pectin giúp dễ dàng loại bỏ các chất không cellulose khác, tạo điều kiện thuận lợi cho các quá trình xử lý tiếp theo. Hiểu rõ cấu tạo sợi bông là tiền đề quan trọng để áp dụng công nghệ enzyme hiệu quả.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Pectinase Trong Ngành Dệt May

Pectinase là một loại enzyme có khả năng phân hủy pectin, một polysaccharide phức tạp có mặt trong thành tế bào thực vật và sợi bông. Trong ngành dệt may, pectinase được sử dụng để loại bỏ pectin khỏi sợi bông, cải thiện độ mềm mại, khả năng thấm hút và khả năng nhuộm của vải. So với phương pháp hóa học truyền thống, xử lý vải bông bằng pectinase mang lại nhiều ưu điểm như giảm thiểu tác động môi trường, tiết kiệm năng lượng và bảo tồn độ bền của sợi vải. Sự phát triển của công nghệ enzyme đã mở ra một hướng đi mới cho ngành dệt may, hướng tới sự bền vững và thân thiện với môi trường.

II. Thách Thức Của Xử Lý Vải Bông Bằng Phương Pháp Truyền Thống

Mặc dù phương pháp nấu kiềm truyền thống vẫn được sử dụng rộng rãi trong ngành dệt may, nó tồn tại nhiều hạn chế. Việc sử dụng hóa chất kiềm (như xút) để loại bỏ các tạp chất trong sợi bông có thể gây ra những tác động tiêu cực. Đầu tiên, hóa chất kiềm có thể làm suy yếu cấu trúc cellulose của sợi bông, dẫn đến giảm độ bền và tuổi thọ của vải. Thứ hai, quá trình nấu kiềm tiêu thụ một lượng lớn năng lượng và nước, gây áp lực lên tài nguyên thiên nhiên. Thứ ba, nước thải từ quá trình này chứa các chất ô nhiễm, gây ảnh hưởng xấu đến môi trường. Do đó, việc tìm kiếm các giải pháp thay thế thân thiện với môi trường hơn là vô cùng cần thiết. Công nghệ enzyme, đặc biệt là việc sử dụng pectinase, hứa hẹn sẽ giải quyết những thách thức này, mang lại một quy trình xử lý vải bông bền vững và hiệu quả hơn.

2.1. Tác Động Tiêu Cực Của Hóa Chất Kiềm Lên Chất Lượng Vải

Việc sử dụng hóa chất kiềm trong quá trình xử lý vải bông có thể làm thay đổi cấu trúc sợi, dẫn đến giảm độ bền kéo, độ bền xé và độ bền mài mòn của vải. Ngoài ra, hóa chất kiềm còn có thể gây ra hiện tượng co rút vải, làm mất đi kích thước ban đầu của sản phẩm. Để giảm thiểu những tác động này, cần kiểm soát chặt chẽ các thông số của quá trình nấu kiềm, như nồng độ hóa chất, nhiệt độ và thời gian xử lý. Tuy nhiên, ngay cả khi được kiểm soát tốt, phương pháp này vẫn không thể loại bỏ hoàn toàn những tác động tiêu cực lên chất lượng vải.

2.2. Ô Nhiễm Môi Trường Do Nước Thải Từ Quá Trình Nấu Kiềm

Nước thải từ quá trình nấu kiềm chứa một lượng lớn các chất ô nhiễm, bao gồm hóa chất kiềm dư thừa, các chất hữu cơ hòa tan và các tạp chất từ sợi bông. Việc xả thải trực tiếp nước thải này ra môi trường có thể gây ra ô nhiễm nguồn nước, ảnh hưởng đến hệ sinh thái và sức khỏe con người. Để giải quyết vấn đề này, cần áp dụng các biện pháp xử lý nước thải hiệu quả, như trung hòa, kết tủa, lọc sinh học và hấp phụ. Tuy nhiên, việc xử lý nước thải đòi hỏi chi phí đầu tư và vận hành, làm tăng giá thành sản xuất.

III. Phương Pháp Xử Lý Vải Bông Bằng Pectinase Bacillus Subtilis

Sử dụng enzyme pectinase trong xử lý vải bông là một phương pháp sinh học thân thiện với môi trường, giúp giảm thiểu việc sử dụng các hóa chất độc hại và giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Pectinase từ Bacillus subtilis đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc phân hủy pectin trong sợi bông, cải thiện độ mềm mại, khả năng thấm hút và khả năng nhuộm của vải. Phương pháp này bao gồm việc ngâm vải bông trong dung dịch chứa enzyme pectinase ở điều kiện thích hợp (pH, nhiệt độ, thời gian). Sau đó, enzyme sẽ phân hủy pectin, làm cho các tạp chất khác dễ dàng được loại bỏ. Quá trình này giúp cải thiện chất lượng vải và giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường.

3.1. Cơ Chế Hoạt Động Của Pectinase Từ Bacillus Subtilis

Pectinase từ Bacillus subtilis hoạt động bằng cách phân cắt các liên kết glycosidic trong phân tử pectin, một polysaccharide phức tạp có mặt trong thành tế bào thực vật và sợi bông. Enzyme này có thể hoạt động theo nhiều cơ chế khác nhau, bao gồm thủy phân, chuyển liên kết và loại bỏ nhóm methyl. Cơ chế hoạt động cụ thể phụ thuộc vào loại enzyme pectinase và cấu trúc của cơ chất pectin. Nhờ khả năng phân hủy pectin, enzyme này giúp loại bỏ các tạp chất trong sợi bông, cải thiện độ mềm mại và khả năng thấm hút của vải.

3.2. Tối Ưu Hóa Quy Trình Xử Lý Vải Bông Bằng Pectinase

Để đạt được hiệu quả tối ưu trong quá trình xử lý vải bông bằng pectinase, cần tối ưu hóa các thông số quan trọng như pH, nhiệt độ, thời gian xử lý và nồng độ enzyme. pH tối ưu cho hoạt động của pectinase thường nằm trong khoảng 8-10. Nhiệt độ tối ưu thường nằm trong khoảng 40-60°C. Thời gian xử lý cần được điều chỉnh để đảm bảo pectin được phân hủy hoàn toàn, nhưng không gây ảnh hưởng đến cấu trúc sợi vải. Nồng độ enzyme cần được điều chỉnh để đảm bảo đủ lượng enzyme để phân hủy pectin một cách hiệu quả. Việc tối ưu hóa các thông số này giúp đạt được chất lượng vải tốt nhất và giảm thiểu chi phí sản xuất.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Pectinase Tẩy Trắng Sinh Học Vải Bông

Tẩy trắng sinh học là một phương pháp tẩy trắng vải bông sử dụng enzyme thay vì các hóa chất tẩy trắng truyền thống. Trong phương pháp này, pectinase được sử dụng để loại bỏ pectin và các tạp chất khác, giúp cải thiện hiệu quả tẩy trắng của các enzyme khác như cellulase và xylanase. Tẩy trắng sinh học mang lại nhiều lợi ích, bao gồm giảm thiểu tác động môi trường, tiết kiệm năng lượng và bảo tồn độ bền của sợi vải. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tẩy trắng sinh học có thể đạt được hiệu quả tương đương với tẩy trắng hóa học, nhưng với ít tác động tiêu cực hơn.

4.1. Lợi Ích Của Tẩy Trắng Sinh Học So Với Hóa Chất Truyền Thống

Tẩy trắng sinh học mang lại nhiều lợi ích so với phương pháp hóa học truyền thống, bao gồm giảm thiểu tác động môi trường do giảm sử dụng hóa chất độc hại, tiết kiệm năng lượng do quá trình tẩy trắng có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn, và bảo tồn độ bền của sợi vải do không sử dụng các hóa chất ăn mòn. Ngoài ra, tẩy trắng sinh học còn có thể cải thiện độ mềm mại và khả năng thấm hút của vải. Những lợi ích này làm cho tẩy trắng sinh học trở thành một lựa chọn hấp dẫn cho ngành dệt may, hướng tới sự bền vững và thân thiện với môi trường.

4.2. Kết Hợp Pectinase Với Các Enzyme Khác Để Tăng Hiệu Quả

Để tăng hiệu quả tẩy trắng sinh học, pectinase thường được kết hợp với các enzyme khác như cellulase, xylanase và lipase. Cellulase giúp loại bỏ các sợi cellulose xơ, cải thiện độ mềm mại của vải. Xylanase giúp loại bỏ hemicellulose, một polysaccharide khác có mặt trong sợi bông. Lipase giúp loại bỏ sáp và các chất béo, cải thiện khả năng thấm hút của vải. Sự kết hợp của các enzyme này giúp tạo ra một quy trình tẩy trắng toàn diện, mang lại chất lượng vải tốt nhất và giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường.

V. Nghiên Cứu Và Triển Vọng Phát Triển Của Pectinase Trong Dệt May

Các nghiên cứu về pectinase và ứng dụng của nó trong ngành dệt may vẫn đang tiếp tục phát triển. Các nhà khoa học đang tìm kiếm các chủng vi khuẩn mới có khả năng sản xuất pectinase với hoạt tính và độ bền cao hơn. Họ cũng đang nghiên cứu các phương pháp tối ưu hóa quy trình sản xuất pectinase, giảm chi phí và tăng hiệu quả. Ngoài ra, các nghiên cứu cũng tập trung vào việc phát triển các ứng dụng mới của pectinase trong ngành dệt may, như xử lý vải lanh, vải gai và các loại vải khác. Triển vọng phát triển của pectinase trong ngành dệt may là rất lớn, hứa hẹn sẽ mang lại những giải pháp bền vững và hiệu quả hơn cho ngành công nghiệp này.

5.1. Tìm Kiếm Chủng Bacillus Subtilis Sản Xuất Pectinase Hiệu Quả

Việc tìm kiếm các chủng Bacillus subtilis có khả năng sản xuất pectinase với hoạt tính và độ bền cao là một trong những hướng nghiên cứu quan trọng hiện nay. Các nhà khoa học đang sử dụng các phương pháp sàng lọc và chọn lọc để tìm ra các chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất pectinase với các đặc tính mong muốn. Họ cũng đang sử dụng các kỹ thuật di truyền để cải thiện khả năng sản xuất pectinase của các chủng vi khuẩn đã được xác định. Việc tìm ra các chủng vi khuẩn sản xuất pectinase hiệu quả sẽ giúp giảm chi phí sản xuất và tăng tính cạnh tranh của công nghệ enzyme trong ngành dệt may.

5.2. Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Để Nâng Cao Chất Lượng Pectinase

Các nhà khoa học đang sử dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học để nâng cao chất lượng của pectinase. Các kỹ thuật này bao gồm kỹ thuật DNA tái tổ hợp, kỹ thuật đột biến và kỹ thuật protein engineering. Kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho phép tạo ra các chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất pectinase với các đặc tính mong muốn. Kỹ thuật đột biến cho phép tạo ra các biến thể của enzyme pectinase với hoạt tính và độ bền cao hơn. Kỹ thuật protein engineering cho phép thiết kế các enzyme pectinase mới với các đặc tính đặc biệt. Việc ứng dụng công nghệ sinh học giúp tạo ra các enzyme pectinase chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của ngành dệt may.

VI. Kết Luận Tương Lai Của Pectinase Trong Xử Lý Vải Bông

Pectinase từ Bacillus subtilis đại diện cho một giải pháp sinh học đầy hứa hẹn cho việc xử lý vải bông, thay thế cho các phương pháp hóa học truyền thống gây hại cho môi trường. Với những ưu điểm vượt trội về hiệu quả, tính bền vững và thân thiện với môi trường, pectinase đang dần trở thành một phần không thể thiếu trong ngành dệt may hiện đại. Các nghiên cứu và phát triển liên tục trong lĩnh vực này hứa hẹn sẽ mở ra những ứng dụng mới và tiềm năng to lớn hơn nữa cho pectinase trong tương lai.

6.1. Tóm Tắt Ưu Điểm Của Pectinase Trong Ngành Dệt May

Tóm lại, pectinase mang đến nhiều lợi ích đáng kể cho ngành dệt may, bao gồm giảm thiểu sử dụng hóa chất độc hại, giảm ô nhiễm môi trường, tiết kiệm năng lượng, bảo tồn độ bền của sợi vải, cải thiện chất lượng vải và tạo ra các sản phẩm thân thiện với người tiêu dùng. Những ưu điểm này làm cho pectinase trở thành một lựa chọn bền vững và hiệu quả hơn so với các phương pháp hóa học truyền thống.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Để Ứng Dụng Rộng Rãi Pectinase Bacillus Subtilis

Để ứng dụng rộng rãi pectinase Bacillus subtilis trong ngành dệt may, cần tập trung vào các hướng nghiên cứu sau: tìm kiếm và phát triển các chủng vi khuẩn sản xuất pectinase với hoạt tính và độ bền cao hơn, tối ưu hóa quy trình sản xuất pectinase để giảm chi phí, nghiên cứu các ứng dụng mới của pectinase trong xử lý các loại vải khác nhau, và nâng cao nhận thức của các nhà sản xuất và người tiêu dùng về lợi ích của công nghệ enzyme.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ TRỌNG TÀI NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CAO GEN MÃ HÓA PECTINASE TRONG Bacillus subtilis NHẰM Ƣ́NG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP XƢ̉ LÝ VẢI BÔNG Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN TRƢỜNG Hà Nội - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Lê Trọng Tài Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.

Lê Văn Trường, là người thầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (nay là Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật) đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận văn. Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn - những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Tác giả Lê Trọng Tài Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT. v DANH MỤC BẢNG. vi DANH MỤC HÌNH. 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

Sơ lƣợc về Bacillus subtilis. Hệ biểu hiện Bacillus subtilis. Khái niệm pectinase. Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase.

Pectinase của Bacillus subtilis. Ứng dụng của pectinase kiềm. Cấu tạo sợi bông tự nhiên. Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông.

Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy. Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến cà phê và trà. Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam. 13 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP.

Các chủng vi khuẩn. Hóa chất thí nghiệm. Các vector sử dụng. Trình tự mồi.

Môi trƣờng nuôi cấy. Phƣơng pháp nghiên cứu. Sàng lọc các chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa.

Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B. subtilis tự nhiên. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp. Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11].

Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)[10]. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi. 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B.

Tách chiết DNA plasmid từ E. Tách chiết DNA plasmid từ B. Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử. Biến nạp plasmid vào E.

coli bằng phương pháp xung điện. Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009). 27 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

Sàng lọc các chủng B. subtilis phân lập từ trong nƣớc có hoạt tính pectinase cao. Sàng lọc chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch.

Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại bào của các chủng nghiên cứu. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi. Tách dòng gen pectinase trong E. Tách chiết DNA tổng số của các chủng B.

Nhân gen pectinase bằng PCR. Tách dòng các gen pel vào E. Giải trình tự các gen pectinase. subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase.

Thiết kế vector biểu hiện gen pectinase trong B. Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B. Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng. So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh ra từ chủng tự nhiên.

So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên. So sánh ảnh hưởng của pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng tự nhiên. 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI. 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

50 Tài liệu tiếng Việt. 50 Tài liệu tiếng Anh. 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn iv DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT a.a : Amino acid APS : Ammonium persulfate B. subtilis : Bacillus subtilis BMM : Môi trƣờng khoáng chất Belisky BSA : Bovine serum albumin DEAE : Diethylethanolamine DNA : Deoxyribonucleic axit DNSA : 3,5-Dinitrosalicylic axit E.

coli : Escherichia coli EDTA : Ethylenediaminetetraacetic axit HTAB : Hecxadecyl trimethyl trimethyl trimethyl trimethyl ammonium bromide ISO : International standards organization kDa : Kilo Dalton LB : Luria bertani M : Mole OD : Optical density PCR : Polymerase chain reaction pel : Gen pectinase Pel : Enzyme pectinase RR : Rhuthenium red rPel : Pectinase tái tổ hợp SDS : Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED : Tetramethylethylenediamine U : Unit Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn v DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Phân loại các pectinolytic enzyme. Các thành phần cấu tạo sợi bông. Thành phần phản ứng nhân gen.

Chƣơng trình nhân gen bằng PCR. Thành phần phản ứng cắt pKTH/pUC bằng HindIII. Thành phần phản ứng cắt pJET/pel bằng HindIII. Thành phần phản ứng gắn gen pel với promoter.

Thành phần phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel. Kết quả sàng lọc các chủng B. subtilis có khả năng phân hủy pectin trên đĩa thạch. Hoạt tính pectinase ở điều kiện pH phản ứng tối ƣu của các chủng nghiên cứu.

Hoạt tính pectinase của các enzyme thu đƣợc. 31 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn vi DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases.

Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase. Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase. Sự kết nối giữa cellulose và các chất không phải cellulose trong lớp thứ cấp của sợi bông. Pectin đƣợc tồn tại ở hai loại: pectin axit và esterified pectin.1 Đồ thị đƣờng chuẩn protein.

Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành 3 amino, 5-nitrosalicylic axit. Đƣờng chuẩn glucose. Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit của pectinase. Hình ảnh một số chủng B.

subtilis tạo vòng thủy phân pectin trên đĩa thạch LB 0,2% pectin. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng phân hủy pectin của các pectinase từ các chủng nghiên cứu. Điện di DNA tổng số của các chủng B. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pectinase.

Khuẩn lạc các thể biến nạp E. coli DH5α mang pJET/pel trên môi trƣờng chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicillin. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII.

So sánh theo hàng trình tự amino acid của Pel từ 4 chủng B. subtilis phân lập ở Việt Nam với Pel từ B. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pel trong B. Điện di sản phẩm cắt pKTH/pUC bằng HindIII.

Thu nhận pel từ pJET/pel. Sơ đồ nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. Nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. Kiểm tra gen dung hợp BaP-pel trong pMSE/BaP-pel.

Kiểm tra pMSE/BaP-pel trong tế bào B. subtilis 168 tái tổ hợp. Điện di SDS-PAGE dịch enzyme ngoại bào của chủng B. subtilis tái tổ hợp đa copy trên môi trƣờng LB+Kan.

Kiểm tra sự biểu hiện pectinase của các thể biến nạp đa copy trong tế bào B. subtilis 168 sau 24 giờ nuôi cấy. 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn vii Hình 3. Kiểm tra hoạt tính pectinase của thể biến nạp đa copy BSM và chủng B.

subtilis 168 trên cơ chất pectin axit. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzyme. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt tính enzyme. 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn viii MỞ ĐẦU Ngành công nghiệp dệt may Việt Nam đang phát triển mạnh, chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc.

Nếu phát triển bông thực hiện đúng tiến độ theo Quyết định số 36/2008/QĐ-TTg của Thủ tƣớng Chính phủ thì đến năm 2015 sản xuất bông trong nƣớc là 40 ngàn tấn, đáp ứng đƣợc 10% nhu cầu và đến 2020 là 60 ngàn tấn đáp ứng đƣợc 12% nhu cầu bông xơ tiêu thụ trong nƣớc. Để “chiến lƣợc phát triển ngành công nghiệp Dệt may Việt Nam đến năm 2015, định hƣớng đến năm 2020” thành công thì ngoài việc thúc đẩy tăng năng xuất và diện tích trồng bông ra chúng ta cần phải cải tiến công nghệ, ứng dụng công nghệ enzyme trong quá trình sản xuất vải bông để tạo ra sản phẩm vải bông chất lƣợng cao, giá thành rẻ và có thể cạnh tranh đƣợc trên thị trƣờng quốc tế. Sợi bông tự nhiên đƣợc cấu tạo bao gồm 95% là cellulose và 5% là không phải cellulose. Vải bông mộc sau khi dệt còn chứa nhiều chất không phải cellulose.

Trong quá trình nhuộm vải, nếu không loại các chất không phải cellulose đi thì chúng sẽ làm cản trở thuốc nhuộm thâm nhập vào vải, dẫn đến giảm chất lƣợng của vải nhuộm. Thông thƣờng để loại bỏ các chất này, vải mộc phải qua bƣớc nấu kiềm (alkaline scouring) để tẩy loại chúng đi, đây là công nghệ đơn giản nhƣng nảy sinh vấn đề vừa làm giảm sự rắn chắc của sợi bông do tác động của chất kiềm tới cấu trúc của cellulose, vừa làm ô nhiễm môi trƣờng và tiêu hao rất lớn năng lƣợng. Để giải quyết vấn đề này, những năm gần đây các nhà công nghệ trên thế giới đã sử dụng enzyme pectinase, một loại enzyme pectinase kiềm để phân hủy pectin trong sợi bông, thay vì sử dụng hóa chất kiềm độc hại. Xử lý vải bông bằng pectinase làm tăng khả năng thấm nƣớc của vải bông, vải mịn và trơn nhẵn hơn, do đó mang lại hiệu quả cao cho quá trń h t ẩy trắng (bleaching) và nhuộm màu (dyeing), làm cho chất lƣợng vải tốt hơn.

Việc ứng dụng enzyme pectinase kiềm trong công nghệ xử lý vải bông mới phát triển khoảng 10 năm gần đây.